Xác định một số trình tự adn mã vạch phục vụ giám định và đánh giá đa dạng di truyền loài xá xị (cinnamomum parthenoxylon meisn) tại tỉnh thanh hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon Meissn) TẠI TỈNH THANH HĨA NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 7420201 Giảng viên hướng dẫn: TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Thị Huyên Mã SV : 1753070701 Lớp : K62 – CNSH Khóa : 2017 - 2021 Hà Nội, tháng năm 2021 LỜI CẢM ƠN Với mục tiêu nhằm đánh giá chất lượng học tập hồn thành chương trình đào tạo sinh viên Trường Đại học Lâm nghiệp, đồng ý Ban Giám hiệu trường Đại học Lâm nghiệp, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giúp đỡ quý thầy, cô giáo hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Xác định số trình tự ADN mã vạch phục vụ giám định đánh giá đa dạng di truyền loài Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon Meissn) tỉnh Thanh Hóa” Để hồn thành báo cáo em xin chân thành cảm ơn TS Hà Bích Hồng thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ Gen Di truyền phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp định hướng, tận tình hướng dẫn giảng dạy em suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Trường Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ, gia đình, bạn bè – người động viên, khích lệ em suốt q trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Kinh phí thực đề tài hỗ trợ đề tài cấp Nhà nước “Khai thác phát triển nguồn gen Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) số tỉnh miền Bắc” Do hạn chế mặt thời gian kinh nghiệm thân nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót tồn định Em mong muốn nhận lời nhận xét, ý kiến đóng góp q thầy, giáo để đề tài hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thị Huyên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung Xá xị 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Xá xị 1.1.2 Đặc điểm hình thái chung Xá xị .2 1.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái Xá xị .3 1.1.4 Giá trị sử dụng Xá xị 1.2 Tổng quan ADN mã vạch (ADN barcode) 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch 1.2.2 Ứng dụng lợi ích mã vạch ADN .6 1.2.3 Các ADN mã vạch thường sử dụng thực vật 1.2.4 Ứng dụng ADN barcode thực vật 1.3 Tình hình nghiên cứu Thế giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới .8 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .11 CHƯƠNG 2.NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.3.2.Hóa chất 15 2.4 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu: .15 2.5 Phương pháp nghiên cứu 16 2.5.1 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu 16 2.5.2 Phương pháp phân lập đoạn trình tự ADN mã vạch 16 2.5.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide trình tự ADN mã vạch 19 2.5.4 Phương pháp phân tích số liệu 19 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số .20 3.2.Kết nhân đoạn trình tự ADN mã vạch kỹ thuật PCR 20 3.2.1Kết nhân đoạn trình tự matK 21 3.2.2Kết nhân đoạn trình tự rbcL .22 3.2.3.Kết nhân đoạn trình tự trnH-psbA 24 3.3 Kết giải trình tự nucleotide đoạn ADN mã vạch mẫu Xá xị 25 3.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK nhân 08 mẫu Xá xị huyện Thường Xuân Quan Hóa 25 3.3.2 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen rbcL nhân 08 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa 29 3.3.3.Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA nhân 08 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa 33 3.4Thảo luận đánh giá hiệu giám định loài nghiên cứu đa dạng di truyền ba trình tự ADN mã vạch 37 3.4.1 Thảo luận .37 3.4.2 Đánh giá hiệu giám định loài nghiên cứu đa dạng di truyền ba trình tự ADN mã vạch 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1.Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp cpDNA Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Base pair Chloroplast DNA CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Adenosin triphosphat Cặp base gen lục lạp Cetyl trimethylammonium bromide Cytochrome b Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotid triphosphate Đệm tách A Đệm tách B axit ethylenediamine tetraacetic Cytb DNA Cytochrome b Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EBA EBB Extraction Buffer A Extraction Buffer B EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi R-Primer Reverse primer Mồi ngược NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vòng / phút DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu thu thập, phân tích Thanh Hố 15 Bảng 2.2 Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 17 Bảng 2.3 Trình tự thơng tin cặp mồi 18 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mồi matK rbcL, trnH – psbA 18 Bảng 3.1: Một số loài ngân hàng gen có trình tự gen matK tương đồng với trình tự đoạn gen matK mẫu Xá xị TH01 TH34 Thường Xuân Quan Hóa 28 Bảng 3.2 Một số lồi ngân hàng gen quốc tế có trình tự đoạn gen rbcL tương đồng với đoạn gen rbcL nhân 02 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa .31 Bảng 3.3: Vị trí sai khác nucleotide sai khác 03 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa .34 Bảng 3.4 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa .35 Bảng 3.5: Điều kiện tự nhiên huyện Thường Xuân Quan Hóa .37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Cây, Xá xị .2 Hình 3.1: Kết nhân trình tự đoạn gen matK 08 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa) .21 Hình 3.2: Kết nhân trình tự đoạn gen rbcL 08 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa) .23 Hình 3.3: Kết nhân trình tự đoạn gen trnH-psbA 08 mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa) 24 Hình 3.4 : So sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa (các vị trí sai khác đóng khung) 27 Hình 3.5 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị với 05 loài có trình tự gen matK tương đồng cao 01 loài sử dụng làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế 29 Hình 3.6: So sánh trình tự nucleotide đoạn gen rbcL 02 mẫu Thường Xn Quan Hóa (các vị trí sai khác đóng khung) .30 Hình 3.7 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị với 08 lồi có trình tự gen rbcL tương đồng 01 loài sử dụng làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế .32 Hình 3.8: So sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa (các vị trí sai khác đóng khung) 34 Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền 03 mẫu Xá xị với 07 lồi có trình tự gen trnHpsbA tương đồng cao 01 loài sử dụng làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Lãnh thổ Việt Nam nằm vành đai nhiệt đới bán cầu Bắc có chứa nhiều hệ sinh thái rừng Trong năm nửa kỷ 20, diện tích rừng Việt Nam có biến động đáng kể, chất lượng rừng giá trị đa dạng sinh học bị suy giảm Hiện nay, khai thác mức làm nhiều loài thực vật đứng trước nguy tuyệt chủng Theo sách đỏ Việt Nam năm 2007 có 464 lồi lồi thực vật có nguy tuyệt chủng tăng 100 loài so với năm 1996 Những lồi có giá trị kinh tế cao nên bị khai thác mức Trước tình hình đó, Chính phủ Việt Nam có giải pháp nhằm bảo vệ rừng, bảo vệ giá trị đa dạng sinh học Một giải pháp quan trọng việc thành lập hệ thống khu rừng đặc dụng phạm vi tồn quốc Trong Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon Meissn) loại gỗ cao cấp cho giá trị kinh tế cao, trước thấy khai thác lấy gỗ, dùng xây dựng đóng đồ dùng thấy làm thuốc Gần tỉnh phía Nam, nhân dân số vùng khai thác từ vỏ thân gỗ thân loại tinh dầu mùi thơm dùng pha nước uống làm thuốc Cây Xá xị chưa thấy sử dụng vỏ, gỗ, thân hay tinh dầu để chế nước Xá xị làm thuốc Chỉ thấy sử dụng tinh dầu để chế nước Xá xị uống giải khát, tiêu cơm Ngoài ra, gỗ Xá xị cịn có khả xua đuổi trùng (gián, kiến, muỗi…)một cách tự nhiên, tỏa hương thơm không gian, dùng để khử mùi phịng ngủ, văn phòng, nhà vệ sinh tốt Khử mùi xe hơi, cốp xe máy Có thể dùng gỗ Xá xị để chế tác tượng gỗ… Tinh dầu Xá xị thường sử dụng để xông không gian thờ cúng, chữa hen suyễn, làm dịu vết thương trùng chích, sát trùng, làm đẹp da, phòng chống bệnh ung thư…Tinh dầu Xá xị nguyên chất cịn có cơng dụng chữa đau bụng, bí tiểu tiện, nôn mửa, đầy bụng, loại thuốc quý dân gian, dầu Xá xị dùng để chữa bệnh tim mạch, hơ hấp, thần kinh, tiêu hóa, đường tiết niệu, có tính kháng sinh tạo kháng thể tốt cho thể Trong y học, rễ thân Xá xị có vị đắng, cay, tính ấm nên dùng làm để điều trị cảm mạo, ăn uống khó tiêu, đau dày, viêm khớp xương phong tê thấp, ho gà bệnh lỵ Ngồi ra, vỏ thân Xá xị cịn dùng để điều trị gan sưng to Mặt khác, kết nghiên cứu chuột thí nghiệm cho thấy chiết xuất vỏ Xá xị cịn có khả chống oxy hóa hạ đường huyết Với mục đích xác định xác lồi Xá xị nghiên cứu tính đa dạng di truyền lồi phục vụ cho công tác bảo tồn phát triển nguồn gen, em thực đề tài “Xác định số trình tự ADN mã vạch phục vụ giám định đánh giá đa dạng di truyền loài Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon Meissn) tỉnh Thanh Hóa” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung Xá xị 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Xá xị Cây Xá xị có tên khoa học Cinnamomum parthenoxylon Meissn; thuộc họ Long não (Lauraceae) chi Long não (Cinnamomum) Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương Long não (Lauraceae) họ thực vật thân gỗ lớn (trừ loài ký sinh thân thảo, Cassytha) với khoảng 50 chi 2500 đến 3000 loài phân bố khắp vĩ độ nhiệt đới đến cận nhiệt đới, thường mọc vươn cao đón ánh nắng mặt trời nên phù hợp với khí hậu nóng ẩm nhiệt đới gió mùa Cây tìm thấy nhiều nước có rừng nhiệt đới Việt Nam, Malaysia, Thái Lan quốc gia thuộc bán đảo Ấn Độ Ở Việt Nam Xá xị mọc tỉnh phía Bắc nhiều Tây Nguyên, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Thanh Hóa…, mọc chủ yếu từ Bắc Trung Bộ trở vào Nam 1.1.2 Đặc điểm hình thái chung Xá xị (Trích: https://duoclieuvietnam.com.vn ngày 07 tháng 02 năm 2020) Hình 1.1 : Cây, Xá xị Trong dân gian Xá xị có tên gọi khác Gù Lương, Re Dầu, Re Hương,Vù Hương Cây Xá xị lâu năm trưởng thành đạt chiều cao từ 12m đến 20m, gỗ với đường kính thân 50cm đến 60cm Thân có vỏ màu xám nâu cho mùi thơm đặc trưng Lá Xá xị rộng khoảng 6cm dài từ 11cm đến 18cm Có hai kiểu lá: có gân lơng chim có gân, thấy hai loại cành Hai mặt có màu xanh lục, nhẵn Gân rõ mặt, thường phẳng theo mặt Lá non thường có màu đỏ, nhẵn hai mặt Chồi hoa thường mập, mang nhiều vảy chồi Cây Xá xị hoa có mùi thơm dịu, màu trắng Cụm hoa dạng chùy hay tán, mọc đầu cành hay nách lá, dài từ 6-12cm, cụm mang khoảng 15 hoa Hoa lưỡng tính, bao hoa thùy, màu trắng vàng, nhị 9, bào phấn ô, nhị có lơng, nhị vịng có tuyến mật, nhị lép Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,8-1,2cm, đế hình chèn, có khía răng, chín màu tím đen Mùa hoa tháng 3-7, mùa chín tháng 10-11 (Phùng Văn Phê 2012) 1.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái Xá xị Mọc rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm núi đất hay núi đá vơi, độ cao 500-1.000m chí đến 3.000m Cây ưa tầng đất mặt sâu, dày, tơi xốp, nhiều mùn nước Khi cịn non ưa ẩm chịu bóng, trưởng thành lại ưa sáng Sinh trưởng tốt loại hình rừng có mật độ trung bình, tái sinh chồi khỏe (Phùng Văn Phê 2012) Giá trị nguồn gen tình trạng bảo tồn: Nguồn gen Xá xị loài đa tác dụng có phân bố số tỉnh phía Bắc Bắc Trung Việt Nam Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Thái Ngun, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận Cây thuộc họ Long não nói chung chi Long não nói riêng có giá trị kinh tế vô quan trọng Phần lớn chúng nguồn tài nguyên quan trọng gỗ xây dựng, gia vị, tinh dầu thuốc Đồng thời, tán chúng rộng rãi, chúng có giá trị sinh thái to lớn phát triển bảo vệ môi trường Ngoài giá trị cho gỗ dùng xây dựng, làm tà vẹt đóng đồ, phận cịn chưng cất tinh dầu dùng cơng nghiệp y dược Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khơ bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dày, phong thấp, mẩn ngứa da Quả dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà (Phùng Văn Phê 2012) Tinh dầu Xá xị sử dụng rộng rãi cơng nghệ hố mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm Tinh dầu cịn dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Tinh dầu chứa hầu hết phận (lá, vỏ, thân rễ) Tuy nhiên, hàm lượng tinh dầu xác định chủ yếu từ Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại lớn thị trường Quốc tế Hình 0.9: Cây quan hệ di truyền 03 mẫu Xá xị với 07 lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng cao 01 loài sử dụng làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế Sử dụng phần mềm Mega7, em xác định khoảng cách di truyền 03 mẫu Xá xị với 07 lồi có mức độ tương đồng cao 01 lồi có quan hệ xa sử dụng làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế Qua hình 3.9 cho thấy quan hệ di truyền chia làm nhóm với độ tin cậy cao (chỉ số boostrap đạt 100%): nhóm thứ gồm 04 loài Cinnamomum micranthum (MT783681.1); Cinnamomum mayanum (MF137940.1); Cinnamomum pittosporoides (MN047450.1) Cinnamomum yabunikkei (MG717939.1) Nhóm thứ hai gồm 03 lồi Cinnamomum bodinieri (MF137955.1); Cinnamomum glanduriferum (MF137965.1) Cinnamomum parthenoxylon (MH050971.1), tất loài thuộc chi Long não (Cinnamomum) với tỷ lệ tương đồng cao Còn mẫu Xá xị đại diện nằm nhóm gần với loài Cinnamomum parthenoxylon với tỷ lệ tương đồng cao loài sử dụng để so sánh Sử dụng 01 loài làm đối chứng Hymenasplenium szechuanense (MW194193.1) cho thấy lồi nằm khác nhánh với lồi thuộc chi Long não (Cinnamomum) Qua kết so sánh phân tích đoạn trình tự trnH-psbA mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa cho thấy so với hai trình tự matK rbcL, trình tự 36 trnH-psbA có hiệu giám định lồi thấp trình tự trnH-psbA lại thể đa dạng di truyền loài tốt Điều cho thấy, để đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ hay xuất xứ khác trình tự trnH-psbA phù hợp 3.4 Thảo luận đánh giá hiệu giám định loài nghiên cứu đa dạng di truyền ba trình tự ADN mã vạch 3.4.1 Thảo luận Vị trí địa lý huyện Thường Xuân Quan Hóa: Huyện Thường Xn: Nằm phía Tây tỉnh Thanh Hóa, phía bắc giáp huyện Lang Chánh, Ngọc Lặc, phía Tây giáp huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An, đường biên giới giáp với huyện Sầm Tớ, tỉnh Hủa Phăn, nước CHDCND Lào, phía Đơng giáp huyện Thọ Xn, Triệu Sơn, phía Nam giáp huyện Như Xuân Như Thành Huyện Quan Hóa: Nằm phía Tây tỉnh Thanh Hóa, phía Tây giáp huyện Mường Lát huyện Viêng Xay, tỉnh Hủa Phăn, nước CHDCND Lào, phía Bắc giáp huyện Vân Hồ (tỉnh Sơn La) huyện Mai Châu (tỉnh Hịa Bình), phía Đơng giáp huyện Bá Thước, phía Nam giáp huyện Quan Sơn Bảng 3.5: Điều kiện tự nhiên huyện Thường Xuân Quan Hóa STT Điều kiện tự nhiên Thường Xuân Thấp dần từ Tây Bắc xuống Đơng Địa hình Nam, độ cao trung bình từ 100-200m, địa hình bị chia cắt sơng, Nhiệt độ trung bình từ 22-24ºC, khí Nhiệt độ hậu nóng ẩm, mưa nhiều thích hợp cho thực vật sinh trường phát triển Lượng mưa trung bình từ 1.600- Lượng 2.000mm, gió mùa Đơng Bắc từ 10 mưa đến tháng năm sau, gió Tây Nam khơ nóng từ tháng đến tháng Đất Feralit Quan Hóa Núi cao, có độ dốc lớn thích hợp hoạt động lâm nghiệp bảo tồn thiên nhiên, độ cao trung bình 700m Nhiệt độ trung bình từ 2224ºC, Lượng mưa trung bình 1.266m, độ ẩm trung bình 84% Gió mùa Đơng Bắc từ tháng 10 đến tháng năm sau, gió Tây Nam khơ nóng từ tháng đến tháng Đất mùn, đất Feralit 37 Với khác địa hình hai huyện Thường Xuân Quan Hóa dẫn đến khác biệt điều kiện sinh thái (Bảng 3.5) để hình thành nên đơn vị phân loại lồi Đối với lồi Xá xị, phân tích trình tự nucleotide 02 đoạn gen matK rbcL cho thấy có khác biệt nhỏ trình tự nucleotide hai đoạn gen mẫu Thường Xn Quan Hóa (hai vị trí nucleotide trình tự matK ba vị trí nucleotide trình tự rbcL) So sánh đặc điểm hình thái mẫu Xá xị hai huyện khơng có khác biệt, cho biến đổi trình tự nucleotide đột biến ngẫu nhiên không ảnh hưởng đến kiểu hình cá thể quần thể Với trình tự trnH-psbA khơng có khác biệt trình tự nucleotide mẫu huyện Thường Xuân có khác biệt nhỏ mẫu huyện Quan Hóa (một vị trí nucleotide sai khác) mẫu hai huyện lại có sai khác nhiều (11 vị trí nucleotide sai khác), điều cho thấy khác biệt điều kiện địa lý, sinh thái tích lũy đột biến gen khác loài Xá xị hai huyện Thường Xuân Quan Hóa Tuy nhiên, sai khác trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA khơng thể sai khác hình thái Xá xị hai huyện chúng thuộc loài với xuất xứ khác 3.4.2 Đánh giá hiệu giám định loài nghiên cứu đa dạng di truyền ba trình tự ADN mã vạch Từ kết nhân PCR, giải trình tự nucleotide, phân tích, so sánh trình tự ADN mã vạch loài Xá xị với loài thuộc chi Cinnamomum cho thấy đoạn gen matK, rbcL có mức độ tương đồng cao với lồi Cinnamomum parthenoxylon ngân hàng gen quốc tế (100%) Tiếp đến trình tự nucleotide vùng gen trnHpsbA với 98,73%, từ cho thấy để giám định cho lồi Xá xị hiệu trình tự ADN mã vạch xếp sau: matK > rbcL > trnH-psbA Do đó, để xác định giám định cho Xá xị ta nên sử dụng trình tự gen matK cho kết xác hai trình tự cịn lại gen rbcL trnH-psbA cho hiệu định danh loài Xá xị thấp Từ kết so sánh trình tự nucleotide mẫu Xá xị vùng với so sánh mẫu Xá xị vùng sử dụng 03 đoạn trình tự gen cho thấy trình tự nucleotide khác thể rõ ràng đoạn gen matK sai khác 02 vị trí, tiếp đến đoạn gen rbcL sai khác 04 vị trí cuối 38 đoạn gen trnH-psbA có tới 11 vị trí sai khác Do vậy, để đánh giá đa dạng di truyền lồi Xá xị hiệu trình tự ADN mã vạch lại xắp xếp theo thứ tự sau: trnH-psbA > rbcL > matK Đúng theo trình tự xắp xếp, trình tự gen sau trnH-psbA nhân mẫu Xá xị cho kết đa dạng di truyền tốt so với đoạn trình tự gen matK rbcL Qua kết phân tích em nhận thấy mối tương quan di truyền 08 mẫu Xá xị nghiên cứu tương đối cao, số tin cậy đạt 100% Các mẫu Xá xị có mức độ đa dạng di truyền cao, điều chứng minh rõ ràng tiến hành nghiên cứu số thị hệ gen lục lạp 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tách chiết thành công ADN tổng số từ 08 mẫu Xá xị sử dụng quy trình tách chiết ADN tổng số CTAB; Hàm lượng ADN tổng số không cao đủ tiêu chuẩn để thực phản ứng PCR - Nhân thành công 03 đoạn trình tự ADN mã vạch matK, rbcL, trnHpsbA 08 mẫu Xá xị có xuất xứ Thường Xn Quan Hóa; - Giải trình tự nucleotide 03 đoạn trình tự ADN mã vạch 08 mẫu Xá xị phục vụ đăng ký quyền ngân hàng gen quốc tế - Giám định loài Xá xị có xuất xứ Thường Xuân Quan Hóa sử dụng trình tự ADN mã vạch matK, trnH-psbA, rbcL Trong đó, đoạn trình tự matK có hiệu giám định loài hiệu so với 02 đoạn trình tự ADN mã vạch cịn lại - Đánh giá đa dạng di truyền mẫu Xá xị Thường Xuân Quan Hóa Cả 04 mẫu Xá xị Thường Xuân đa dạng di truyền thị ADN mã vạch matK, rbcL, trnH-psbA Mẫu Xá xị Quan Hóa có đa dạng di truyền thị ADN mã vạch, thị trnH-psbA cho thấy thị có khả phân biệt đa dạng di truyền cá thể xuất xứ tốt 4.2 Kiến nghị Cơng bố trình tự ADN mã vạch lồi Xá xị Thường Xuân Quan Hóa lên ngân hàng gen Quốc tế làm sở liệu phục vụ giám định loài nghiên cứu liên quan Tiếp tục phân tích thêm mẫu Xá xị huyện khác tỉnh Thanh Hóa, kết hợp với xuất xứ khác để khẳng định đa dạng di truyền cá thể xuất xứ xuất xứ với Từ có sở khoa học cho bảo tồn phát triển nguồn gen Xá xị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.Bộ Khoa học Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, 1999 Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hải Hà, Vũ Quang Nam, Nguyễn Thế Đại, Phan Văn Quỳnh, Nguyễn Ngọc Ánh (2017) Giám định số loài Nưa Thanh Hóa dẫn liệu hình thái phân tử Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, số 3, trang 9-16 Hà Văn Huân, Nguyễn Trung Thành, Hoàng Minh Trang (2016) Xác định số đoạn mã vạch AND cho số loài Trà hoa vàng vườn Quốc gia Tam Đảo Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, trang 3-5 Phùng Văn Phê (2012), Nghiên cứu giâm hom Xá Xị Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn làm sở cho công tác bảo tồn Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 50 (5) (2012): 643-650 Đỗ Tất Lợi ( 2012) Những thuốc vị thuốc việt Nam NXB Y Học Vũ Thị Như Trang, Chu Hoàng Mậu Sử dụng mã vạch matK nhận diện mẫu Thổ Nhân Sâm số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, số 184, trang 101-106 Nguyễn Thị Hải Yến, Chu Hoàng Mậu, Đỗ Tiến Phát Sử dụng đặc điểm hình thái mã vạch DNA để định danh lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum Emersonii) Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, số 11, trang 18-25 Hà Văn Huân, Hoàng Minh Trang, Bùi Thị Mai Hương Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho loài Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) phục vụ giám định lồi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Giống trồng, số 1, trang 3-9 10.Lê Thanh Hương (2017) Ứng dụng mã vạch ADN hỗ trợ định loại loài số mẫu Sâm thuộc chi Nhân sâm (T66) Tạp chí cơng nghệ sinh học 15 11 Đinh Đồn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 12 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 13 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) - Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập II, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 2003 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Kress WJ., Erickson DL (2007) A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnHpsbA Spacer Region PLoS ONE 2(6): e508 16 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 17.Liu, Z F , Ci, X.Q, Li, L , Li, H.W , Conran, J G anh Li, J (2016), “DNA barcoding evaluation and imlication for phylogenetic relationships in Lauraceae from China” 18 Wen J, Zimmer EA (1996) Phylogeny and biogeography of Panax L (the ginseng genus, Araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA Mol Phylogenet Evol 6(2): 167-177 19 Sang T., Crawford D.J., Stuessy T.F (1997) Chloroplast DNA phylogeny, reticulate evolution, and biogeography of Paeonia (Paeoniaceae) Am J Bot 84: 1120-1136 20 Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., Berg C.V.D., Madriñán S., Petersen G., Seberg O., Jørgsensen T., Cameron K.M., Carine M., Pedersen N., Hedderson T.A.J., Conrad F., Salazar G.A., Richardson J.E., Hollingsworth M.L., Barraclough T.G., Kelly L., Wilkinson M (2007) A proposal for a st ADN ardised protocol to barcode all ADN plants Taxon 56 (2): 295-299 21 Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS One (1): e8613 22 Zhen Liu, Shi-Lin Chen, Jing-Yuan Song, Shou-Jun Zhang, and Ke-Li Chen (2012), “Application of deoxyribonucleic acid barcoding in Lauraceae plants”, Pharmacogn Mag ; 8(29): 4–11 23 V P Swetha,V A Parvathy,T E Sheeja &B Sasikumar (2014), “DNA Barcoding for Discriminating the Economically Important Cinnamomum verum from Its Adulterants”, Food Biotechnology, (28),pp 183-194 24.CBOL plant working group (2009) A ADN mã vạch for land plants, Proc Natl Acad Sci USA,106: 12794-12797 25.Chiang Mai J (2014), “Identifying Efficiency in Herbal Medicine Cinnamomum Species (Lauraceae) Using Banding Patterns and Sequence Alignments of rpoB, rbcL and matK Regions, Contributed Paper; 41(5.1):1094-1108 26 Hebert PD, Ratnasingham S, de Waard JR Barcoding animal life: Cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proc Biol Sci 2003;270(Suppl 1):S96–9 27 Hall TA (1999) BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98 28 Kumar S., Stecher G., Tamura K (2015) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729 WEBSITE 29.http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-va-huong-nghiencuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html 30.https://doctors24h.vn/cay-xa-xi-la-non-dung-lam-rau-xanh-tinh-dau-dung-lamnuoc-giai-khat-giup-tieu-com.html 31 https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_barcoding 32 https://trungtamduoclieu.vn/cay-xa-xi-id487.html 33 https://duoclieuvietnam.com.vn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự nucleotide đoạn gen matK cá thể Thường Xuân Phụ lục 2: Trình tự nucleotide đoạn gen matK cá thể Quan Hóa Phụ lục 3: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL cá thể Thường Xuân Phụ lục 4: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL cá thể Quan Hóa Phụ lục 5: Trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA cá thể Thường Xuân Phụ lục : Trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA cá thể Quan Hóa