Nghiên cứu giám định và phân tích đa dạng di truyền loài xá xị (cinnamomum parthenoxylon (jack) meisn) tại vườn quốc gia tam đảo bằng phương pháp dna mã vạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNA MÃ VẠCH NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Tiến Thành Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị, máy móc q trình thực đề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực đề tài em nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, giúp em hồn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp đặc biệt TS Hà Bích Hồng hướng dẫn tận tình cho em thời gian thực đề tài “Ngiên cứu giám định phân tích đa dạng di truyền lồi Xá xị vườn Quốc gia Tam Đảo DNA mã vạch” Bằng nhiệt huyếtvà kinh nghiê ̣m truyền đạt kiến thức để em nắm rõ tất nội dung trình nghiên cứu để có báo cáo hơm Cuối , em xin kính chúc thầy , Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp có sức khỏe dồi thành công công việc để tiếp tục truyền đạt cho khóa sinh viên Kinh phí thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi đề tài cấ p Nhà nước “Khai thác phát triển nguồn gen Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) số tỉnh miền Bắc” Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Tiến Thành i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BANG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiêụ chung về Xá xi ̣ 1.1.1 Đặc điểm hình thái của Xá xi ̣ 1.1.2 Đă ̣c điể m sinh học sinh thái của Xá xi ̣ 1.1.3 Giá trị sử dụng xá xị 1.2 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3 Tổng quan DNA mã vạch (DNA barcode) 1.3.1 Giới thiệu DNA mã vạch 1.3.2 Các đă ̣c điể m bản của trình tự DNA barcode 1.3.3 Các DNA mã vạch thường sử dụng 10 1.3.4 Ứng du ̣ng của DNA barcode thực vâ ̣t 13 1.3.5 Mô ̣t số nghiên cứu về DNA mã va ̣ch thực vâ ̣t 16 CHƯƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.1.1.Mục tiêu chung 19 2.1.2.Mục tiêu cụ thể 19 2.2.Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 2.3.Nội dung nghiên cứu 19 2.4.Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 2.4.1.Vật liệu nghiên cứu 20 ii 2.4.2.Hóa chất 20 2.5.Phương pháp nghiên cứu 21 2.5.1.Phương pháp thu nhận mẫu 21 2.5.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21 2.5.3.Kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 22 2.5.4.Phương pháp PCR với că ̣p mồi đặc hiệu 23 2.5.5.Phương pháp tinh sản phẩm PCR 25 2.5.6.Phương pháp phân tích số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1.Kết tách chiết DNA tổng số 26 3.2.Kết nhân trình tự DNA mã va ̣ch phương pháp PCR 26 3.2.1.Kết nhân đoạn trình tự matK 27 3.2.2.Kết nhân đoạn trình tự rbcL 28 3.2.3.Kết đoạn gen trnH-psbA 29 3.3.Kết phân tích trình tự các đoa ̣n DNA mã va ̣ch ở loài Xá xi 30 ̣ 3.3.1.Kết phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen matK 30 3.3.2.Kết phân tić h và so sánh trình tự gen rbcL 35 3.3.3.Kết phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA 39 CHƯƠNG 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1.Kế t luâ ̣n 45 4.2.Kiế n nghi 45 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp cpDNA CTAB Cytb DNA (DNA) Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Base pair Chloroplast DNA Cytochrome b Adenosin triphosphat Cặp base gen lục lạp Cetyl trimethylammonium bromide Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Cetyl trimethylammonium bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EBA EBB Extraction Buffer A Extraction Buffer B Deoxyribonucleotid triphosphate Đệm tách A Đệm tách B EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi R-Primer Reverse primer Mồi ngược NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Quốc gia Thông Information tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction fragment polymorphism RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vòng / phút Phản ứng chuỗi polymerase length iv Phân tích đa hình trình tự DNA DANH MỤC BANG Bảng 2.1 Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 23 Bảng 2.2 Trình tự thông tin cặp mồi 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mồi matK RbcL, trnH - psbA 24 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoa ̣n gen matK tương đồng với trình tự gen matK mẫu VP01 ngân hàng gen NCBI 32 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với trình tự gen rbcL mẫu VP01 ngân hàng gen NCBI 36 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL 38 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác 07 mẫu nghiên cứu Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 41 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen trnH-psbA 07 mẫu Xá xị ngân hàng gen NCBI 42 v DANH MỤC HÌNH Hình 0.1: Cành mang hoa Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Hình 1.2: Cây Xá Xị Hình 3.1: Kết nhân bản đoa ̣n triǹ h tự MatK của 07 mẫu Xá xi ̣ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 27 Hình 3.2: Kết nhân bản đoa ̣n trình tự rbcL của 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 28 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen trnH-psbA 29 Hình 3.4: Trin ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen MatK đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ta ̣ ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 31 Hình 3.5: So sánh trin ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP01 với 06 triǹ h tự tương đồ ng ngân hàng gen 33 Hình 3.6: Cây quan ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa triǹ h tự đoa ̣n gen MatK 34 Hình 3.7: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen rbcL đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 35 Hình 3.8: So sánh triǹ h tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng ngân hàng gen 37 Hình 3.9: Cây quan ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa triǹ h tự đoa ̣n gen rbcL 39 Hình 3.10: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣ 40 Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền 07 mẫu nghiên cứu 07 loài NCBI… 43 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Xá xị loài đa tác dụng có phân bố số tỉnh miền Bắc Việt Nam Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, tỉnh Vĩnh Phúc, v.v Ngoài giá trị cho gỗ dùng xây dựng, làm tà vẹt đóng đồ, phận cịn chưng cất tinh dầu dùng cơng nghiệp y dược Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khơ bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Quả dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà Tinh dầu Xá xị sử dụng rộng rãi cơng nghệ hố mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm Tinh dầu cịn dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dày, phong thấp, mẩn ngứa da Tinh dầu chứa hầu hết phận (lá, vỏ, thân rễ) Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại lớn thị trường Quốc tế Tình trạng khai thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu thời gian qua nước ta làm cho loài đứng trước nguy tuyệt chủng Hiện nay, Xá xị xếp nhóm IIA thuộc Nghị định 06/2019/NĐ-CP Chính phủ năm 2019, nhóm CR nguy cấp Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 Đồng thời với việc bảo tồn, cần nghiên cứu thử nghiệm gieo trồng đưa loài Xá xị vào đối tượng gây trồng chương trình trồng rừng nước ta Với mu ̣c đích xác đinh ̣ chính xác loài Xá xi ̣ và nghiên cứu tiń h đa hiǹ h di truyề n của loài này phu ̣c vu ̣ cho công tác bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen, em thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu giám đinh ̣ và phân tích đa da ̣ng di truyề n loài Xá xi ̣ ( Cinnamomum parthenoxylon ( Jack) Meisn) ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo bằ ng phương pháp DNA mã va ̣ch” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiêụ chung về Xá xi ̣ Xá Xị có tên khoa học: Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb 1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii Lecomte, 1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm 1952 Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương 1.1.1 Đặc điểm hình thái của Xá xi ̣ Cây gỗ, kích thước trung bình lớn; thân hình trụ thẳng, cao 20-25m, đường kính thân (40-70) cm; rụng nhiều hay ít; gốc phình to đơi có bạnh gốc Vỏ màu nâu, nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc bong mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt Cành non trịn, thơ, có cạnh, màu lục xám Lá đơn nguyên, mọc cách; phiến hình trứng hay hình bầu dục thn; kích thước 5-15 x 2,5-8cm; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng; hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; cuống dài 1,2-3cm Cụm hoa dạng chuỳ hay tán; mọc đầu cành hay nách lá; cụm mang khoảng 10 hoa Hoa lưỡng tính; bao hoa thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn ơ, nhị có lơng, nhị vịng có tuyến mật; nhị lép Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,6-1cm; đế hình chén, có khía răng, chín màu xanh vàng tím đen[1] (Phùng Văn Phê, 2019) Hình 1.1: Cành mang hoa Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Hình 1.2: Cây Xá Xị 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái của Xá xi ̣ Mùa hoa tháng 3-6, mùa tháng 6-10 Mọc rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm núi đất hay núi đá vôi, độ cao 500-1.000m chí đến 3.000m Cây ưa tầng đất mặt sâu, dày, tơi xốp, nhiều mùn nước Khi cịn non ưa ẩm chịu bóng, trưởng thành lại ưa sáng Sinh trưởng tốt loại hình rừng có mật độ trung bình Tái sinh chồi khỏe[1],[5]  Giá trị nguồn gen tình trạng bảo tồn Nguồn gen Xá xị lồi đa tác dụng có phân bố số tỉnh phía Bắc Bắc Trung Việt Nam Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, tỉnh Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận Ngoài giá trị cho gỗ dùng xây dựng, Hình 3.5: So sánh trin ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng ngân hàng gen C.par: Cinnamomum parthenoxylon; C.aro: Cinnamomum aromaticum; C.yab: Cinnamomum yabunikkei; C.ret: Cinnamomum reticulatum; C.pol: Cinnamomum polyadephum; C.che: Cinnamomum chekiangense 33 Kế t quả so sánh trin ̀ h tự đoa ̣n gen matK cho thấ y sự tương đồ ng 100% của mẫu VP01 với loài Cinnamomum parthenoxylon, còn 05 loài còn la ̣i có sự tương đồ ng với 100% và khác với mẫu VP01 ta ̣i vi ̣ trí 414 Cụ thể mẫu VP01 nucleotide loại T 05 loài còn la ̣i nucleotit loại G Sư khác về mô ̣t vi ̣ trí nucleotide nhấ t giữa mẫu VP01 và loài Cinnamomum parthenoxylon với 05 loài còn la ̣i có thể giả thuyế t là mô ̣t đô ̣t biế n thay thế đã dẫn sự hình thành loài mới chi Long Naõ và các loài này có cùng nguồ n gố c Mố i quan ̣ di truyề n của mẫu VP01 với 06 loài ngân hàng gen đươ ̣c thể hiê ̣n ở hiǹ h 3.6 Hình 3.5: Cây quan ̣ di truyền giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa trình tự đoa ̣n gen MatK Dựa vào hình 3.6 ta thấy quan hệ chia thành 02 nhóm Nhóm thứ gồm mẫu VP01 lồi Cinnamomum parthenoxylon, khơng có sai khác 02 trình tự gen (tương đồng 100%) Nhóm thứ hai gồm 05 lồi Cinnamomum aromaticu, Cinnamomum yabunikkei, Cinnamomum reticulatum, Cinnamomum polyadephum, Cinnamomum chekiangense có trình tự gen giống Cây quan ̣ di truyề n này góp phầ n làm rõ giả thuyế t về nguồ n gố c chung của các loài Như vâ ̣y, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch matK có khả giám đinh ̣ loài Xá xi ̣với đô ̣ chính xác cao và tương đồ ng với sự phân loa ̣i dựa theo hiǹ h thái Tuy nhiên, đoa ̣n trình tự này không thể hiêṇ sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể Xá xi ̣ cùng xuấ t xứ 34 3.3.2 Kết phân tích và so sánh trình tự gen rbcL Kết nhân đoạn gen rbcL thực tế cúng tơi thu sản phẩm PCR có kích thước gần 600 bp Nhưng phân tích trình tự đoa ̣n gen phầ n mề m BioEdit, nhâ ̣n thấ y đoạn gen rbcL với kích thước 526 bp có chất lượng tốt, khơng có sai khác 07 mẫu nghiên cứu (VP01,VP02,VP03,VP05,VP06,VP07,VP12), kết tương đồng 100% Cho nên chúng tơi sử dụng kết trình tự mẫu VP01 làm đại diện để so sánh số trình tự NCBI Kết giải trình tự nucleotide đoa ̣n gen rbcL mẫu VP01 đươ ̣c thể hiê ̣n hình 3.7 Hình 3.6: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen rbcL được nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ̣ta ̣i Tam Đảo, Vin ̃ h Phúc Khi sử du ̣ng triǹ h tự đoa ̣n gen rbcL của mẫu VP01 làm đa ̣i diêṇ để so sánh với các trình tự tương đồ ng ngân hàng gen quố c tế Kế t quả cho thấ y mẫu VP01 có sự tương đồ ng rấ t cao với loài Xá xi ̣ (Cinnamomum parthenoxylon) và mô ̣t số loài thuô ̣c chi Long naõ (Cinnamomum) Lựa cho ̣n 06 loài có trình tự đoa ̣n gen matK tương đồ ng cao nhấ t với mẫu VP01 ở bảng 3.2 để xây dựng quan ̣ di truyề n 35 Bảng 3.1: Mợt số lồi có trình tự gen matK tương đồng với trình tự gen rbcL mẫu VP01 ngân hàng gen NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỉ lệ tương đồng Cinnamomum parthenoxylon KX546848.1 100% Cinnamomum burmannii KX546826.1 99.81% Cinnamomum aromaticum KP094936.1 99.81% Cinnamomum dubium MK243402.1 99.62% Cinnamomum heyneanum KY945255.1 99.62% Cinnamomum malabatrum KY945245.1 99.62% Nhìn vào bảng 3.2 ta thấy trình tự gen rbcL mẫu VP01 tương đồng 100% với lồi Cinnamomum parthenoxylon (KX546848.1) có mức độ sai khác nhỏ so với hai loài Cinnamomum burmannii (KX546826.1); Cinnamomum aromaticum ( KP094936.1) 0.19% Cịn với lồi Cinnamomum dubium (MK243402.1), Cinnamomum heyneanum (KY945255.1); Cinnamomum malabatrum (KY945245.1) 0.38%.% Sự sai khác về trình tự đoa ̣n gen rbcL của mẫu VP01 và 06 loài tương đồ ng ngân hàng gen đươ ̣c thể hiê ̣n hin ̀ h 3.8 36 Hình 3.7: So sánh trình tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng ngân hàng gen C.par: Cinnamomum parthenoxylon; C.bur: Cinnamomum burmannii; C.aro: Cinnamomum aromaticum; C.dub: Cinnamomum dubium; C.hey: Cinnamomum heyneanum; C.mal: Cinnamomum malabatrum Kế t quả so sánh trình tự đoa ̣n gen rbcL cho thấ y sự tương đồ ng 100% của mẫu VP01 với loài Cinnamomum parthenoxylon Còn với lồi khác có sai khác vị trí thể bảng 3.3 37 Bảng 3.2: Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL Vị trí Lồi 38 45 46 261 VP01 A G A T Cinnamomum parthenoxylon A G A T Cinnamomum burmannii C G A T Cinnamomum aromaticum A G A C Cinnamomum dubium A A G T Cinnamomum heyneanum A A G T Cinnamomum malabatrum A A G T Bảng 3.3 cho thấy mẫu VP01 05 loài C parthenoxylon, C aromaticum, C dubium,C heyneanum, C malabatrum vị trí 38 nucleotide loại A có lồi C burmannii nucleotide loại C Ở vị trí 45 46 mẫu VP01 03 loài C parthenoxylon, C burmannii, C aromaticum nucleotide loại G nucleotide loại A Cịn 03 lồi C dubium,C heyneanum,C malabatrum vị trí 45,46 nucleotide loại A nucleotide loại G Vị trí 261 mẫu VP01 05 loài C parthenoxylon, C burmannii, C dubium,C heyneanum, C malabatrum nucleotide loại T, loài C aromaticum nucleotide loại C Qua phân tích sự khác ta ̣i các vi ̣ trí nucleotide cho thấ y mẫu VP01 và loài C parthenoxylon có trin ̀ h tự tương đồ ng 100%, loài C Burmannii và C aromaticum có mức đô ̣ tương đồ ng rấ t cao (chỉ khác nucleotide), còn ba loài C dubium,C heyneanum và C malabatrum tương đồ ng 100% Mố i quan ̣ di truyề n của các loài này dựa trình tự đoa ̣n gen rbcL phản ánh rõ ràng về sự tương đồ ng và đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.9 38 Hình 3.8: Cây quan ̣ di truyền giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa trình tự đoa ̣n gen rbcL Dựa vào hình 3.9 ta thấy quan hệ di truyền chia thành 02 nhóm Nhóm thứ gồm 03 lồi Cinnamomum dubium, Cinnamomum heyneanum, Cinnamomum malabatrum, có trình tự gen tương đồng nhau, khơng có sai khác vị trí trình tự gen Nhóm thứ hai gồm 04 loài, đó mẫu VP01 lồi Cinnamomum parthenoxylon có trình tự gen giống nên khoảng cách di truyề n bằ ng 0, đồ ng thời có sai khác với loài còn la ̣i nhóm là Cinnamomum burmannii và Cinnamomum aromaticum Tuy nhiên, vì các loài đề u thuô ̣c chi Cinnamomum nên có quan ̣ di truyề n rấ t gầ n thể hiêṇ ở chỉ số khoảng cách di truyề n rấ t thấ p Như vậy, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch rbcL có khả giám đinh ̣ loài Xá xi.̣ Tuy nhiên, đoa ̣n trình tự này không thể hiêṇ sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể cùng xuấ t xứ 3.3.3 Kết phân tích và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA Thực tế nhân đoa ̣n gen trnH-psbA thu sản phẩ m PCR có kích thước 400 bp Nhưng phân tích trình tự đoa ̣n gen phầ n mề m BioEdit, nhâ ̣n thấ y đoạn gen trnH-psbA với kích thước 374bp có chất lượng tốt Vì vậy, chúng tơi sử dụng đoa ̣n trình tự có kích thước 374bp đoạn gen trnH-psbA để phân tích, so sánh Kế t quả so sánh 07 trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA 07 mẫu Xá xi ̣ VP01, VP02, VP03, VP05, VP06, VP07, VP12 thể hình 3.10 39 Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣ Từ hình 3.10 ta thấy trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA mẫu Xá xi ̣có sai khác ta ̣i vi ̣trí nucleotide Ta ̣i các vi ̣trí sai khác có thể nhâ ̣n thấ y mẫu VP06 và VP07 có trình tự tương đồ ng 100%, còn các mẫu khác có sự sai khác mô ̣t cách ngẫu nhiên Đây có thể là quá trình đô ̣t biế n điể m diễn mô ̣t cách ngẫu nhiên quầ n thể Các nucleotide sai khác ở từng mẫu đươ ̣c thố ng kê bảng 3.4 40 Bảng 3.3: Các vị trí sai khác 07 mẫu nghiên cứu Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Vị trí 133 175 207 265 300 314 339 351 VP01 A A A A C G G G VP02 A A G A A T G T VP03 G G G A A G A T VP05 A A G G A G A T VP06 A A G G A T A T VP07 A A G G A T A T VP12 G G G G A T G T Sau có kết so sánh trình tự nucleotide 07 mẫu Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc với để thấy rõ đa hình mẫu Xá xị, sử dụng công cụ BLAST để tìm kiếm lồi có trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI từ xác định đa quan hệ di truyền loài với 07 mẫu Xá xị Tam Đảo Do tấ t cả 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo đề u có trình tự nucleotide khác nên chúng thực hiê ̣n viê ̣c so sánh từng triǹ h tự của từng mẫu với các triǹ h tự tương đồ ng ngân hàng gen quố c tế Từ kết so sánh tìm tiếm riêng lẻ của 07 mẫu Xá xi,̣ lựa cho ̣n 07 lồi có trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA tương đồng cao với 07 mẫu Xá xi nghiên cứu đươ ̣c thống kê ở bảng 3.5 ̣ 41 Bảng 3.4: Mợt số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen trnH-psbA 07 mẫu Xá xị ngân hàng gen NCBI Mẫu VP01 VP02 VP03 VP05 VP06 VP07 VP12 Loài Cinnamomum parthenoxylon 97.49% 98.61% 98.61% 98.33% 98.61% 98.61% 99.44% Cinnamomum camphora 97.59% 98.86% 98.66% 98.40% 98.66% 98.66% 99.47% Cinnamomum burmannii 96.80% 97.87% 97.60% 97.60% 97.87% 97.87% 98.40% Cinnamomum tamala 96.53% 97.60% 97.33% 97.33% 97.60% 97.60% 98.13% Cinnamomum chekiangense 96.54% 97.61% 97.34% 97.34% 97.61% 97.61% 98.14% Cinnamomum bodinieri 96.53% 97.60% 97.60% 97.33% 97.60% 97.60% 98.40% Cinnamomum 97.49% 98.61% 98.61% 98.33% 98.61% 98.61% 99.44% longpipaniculatum Từ kế t quả so sánh và cho ̣n lựa trình tự đó, chúng xây dựng quan ̣ di truyền 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu 07 lồi tương đờ ng NCBI dựa trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA và kế t quả thể hình 3.11 42 Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền 07 mẫu nghiên cứu 07 lồi NCBI 43 Dựa vào hình 3.11 ta thấy quan hệ di truyền chia làm hai nhóm Nhóm thứ gồm 07 mẫu nghiên cứu VP01, VP02, VP03, VP05, VP06, VP07, VP12 với đô ̣ tin câ ̣y cao (boostrap 98%) Các mẫu Xá xị khơng có sai khác nhiều trình tự nucleotide chúng có xuất xứ Nhóm thứ hai gồm 07 loài ngân hàng gen Cinnamomum parthenoxylon, Cinnamomum camphora, Cinnamomum burmannii, Cinnamomum tamala Cinnamomum chekiangense, Cinnamomum bodinieri, Cinnamomum longpipaniculatum với giá tri ̣ boostrap là 97%, lồi thuộc chi Long não khơng có sai khác nhiều trình tự nucleotide Như vậy, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch trnH-psbA có khả giám đinh ̣ loài Xá xi ̣ không hiêụ quả bằ ng hai trình tự matK và rbcL Tuy nhiên, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch này la ̣i có hiêụ quả sự đánh giá đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể cùng x́ t xứ, có khả giám định lồi tốt Kế t quả này cũng tương tự kế t quả của dự án “Xây dựng bô ̣ sở dữ liêụ DNA mã va ̣ch phu ̣c vu ̣ công tác quản lý giố ng lâm nghiêp̣ đã đươ ̣c công nhân là giố ng Quố c gia” PGS TS Hà Vă Huân chủ nhiê ̣m đã khẳ ng đinh ̣ đoa ̣n triǹ h tự trnH-psbA là triǹ h tự hiêụ quả nhấ t nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n ở mức dưới loài 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luâ ̣n - Tách chiế t thành công DNA tổ ng số từ 07 mẫu lá Xá xi ̣ sử du ̣ng bô ̣ kit tách chiế t DNA thực vâ ̣t của hañ g Qiagen Hàm lươ ̣ng DNA tổ ng số không cao đủ tiêu chuẩ n để thực hiêṇ phản ứng PCR - Nhân bản thành công 03 đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch là matK, rbcL, trnHpsbA ở 07 mẫu Xá xi co ̣ ́ xuấ t xứ ta ̣i vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc - Giải trình tự nucleotide của các đoa ̣n triǹ h tự DNA mã va ̣ch ở 07 mẫu Xá xi phu ̣ ̣c vu ̣ đăng ký bản quyề n ngân hàng gen quố c tế - Giám đinh ̣ đươ ̣c loài Xá xi ̣ có xuấ t xứ ta ̣i tỉnh Vĩnh Phúc sử du ̣ng các triǹ h tự DNA mã va ̣ch matK, rbcL, trnH-psbA Trong đó, đoa ̣n trình tự matK, rbcL có hiê ̣u quả giám đinh ̣ loài hiê ̣u quả nhấ t so với đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch còn la ̣i - Xác đinh ̣ đươ ̣c sự đa da ̣ng di truyề n của các cá thể Xá xi ̣ quầ n thể Xá xi ̣ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo sử du ̣ng chỉ thi ̣DNA mã va ̣ch trnH-psbA 4.2 Kiến nghi ̣ Do thời gian thực hiêṇ đề tài bi ̣ ̣n chế nên chưa nghiên cứu đươ ̣c nhiề u mẫu Xá xi ̣ ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo, tỉnh Viñ h Phúc Cầ n tiế p tu ̣c phân tích thêm các mẫu ta ̣i xuấ t xứ để khẳ ng đinh ̣ về sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể cùng mô ̣t xuấ t xứ và giữa các xuấ t xứ với Từ đó có sở khoa ho ̣c cho sự bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen Xá xi ̣ta ̣i miề n Bắ c, Viê ̣t Nam 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Khoa học Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) - Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập II, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 2003 Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, 1999 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., DNA Vincent S (2005), “LDNA plants DNA DNA mã vạchs: short-term DNA long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Gens, genomics, DNA bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 Richards, P.W 1996 The Tropical rain forest (2nd edition) Cambride, University Press 10 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., DNA Eske W (2007),” Power DNA limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 11 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 12 Vijayan K DNA Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 – 13 Vijayan K DNA Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 14 Wu Zhengyi DNA Piter H Reven (Co-chairs of the Editorial Committee), 1994-2010 Flora of China Volume 1-25, Science Press (Beijing) DNA Missouri Botanical Garden Press (St Louis) 15 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants DNA animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 16 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L DNA Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 WEBSITE 17 https://caythuoc.org/cay-xa-xi-vu-huong-va-nhung-gia-tri-dang-chu-y.html 18 http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-va-huongnghien-cuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html 19.http://thuvienso.vanlanguni.edu.vn/bitstream/Vanlang_TV/15365/9/SA5644_ D8763_9_L%C3%AA%20Th%E1%BB%8B%20H%E1%BB%93ng%20 Nhung-S152573%20_%20CHUONG%202.pdf