Giám định và đánh giá đa dạng di truyền loài xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn)

Bài viết Giám định và đánh giá đa dạng di truyền loài xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) nghiên cứu sự đa dang di truyền loài xá xị tại Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc để đưa ra chiến lược bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây có giá trị này.

Công nghệ sinh học & Giống trồng GIÁM ĐINH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀ I XÁ XI ̣ ̣ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO BẰNG CHỈ THI ̣ ADN MÃ VẠCH Hà Bı́ch Hồ ng1, Nguyễn Thế Hưởng1, Nguyễn Thị Lan Anh2, Phùng Văn Phê1, Hoàng Văn Sâm1, Nguyễn Xuân Vinh3 Trường Đại học Lâm nghiê ̣p Công ty TNHH Vestergaard Frandsen Vietnam Trường THPT Chương Mỹ A TÓM TẮT Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) loài gỗ cao cấp cho giá trị kinh tế cao, có ng̀ n gen xếp nhóm IIA (Nghị định 06/2019/NĐ-CP Chính phủ năm 2019) và nhóm CR nguy cấp Loài này có khả tái sinh tự nhiên và bi ̣ khai thác bừa bãi để cất tinh dầu nên chúng đứng trước nguy tuyệt chủng và cầ n đươ ̣c bảo tồ n, phát triể n tự nhiên Trong nghiên cứu này, ba chı̉ thi ̣ ADN mã va ̣ch là matK, rbcL, và trnH-psbA đươ ̣c sử du ̣ng để giám đinh ̣ và phân tı́ch đa da ̣ng di truyề n của các Xá xi ̣ điề u tra đươ ̣c ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo, tı̉nh Vıñ h Phúc Kế t quả cho thấ y cả ba chı̉ thi ̣ ADN mã va ̣ch đề u cho hiê ̣u quả giám đinh ̣ loài Xá xi,̣ đó chı̉ thi ̣ trnH-psbA có hiê ̣u quả giám đinh ̣ loài thấ p so với chı̉ thi ̣ matK và rbcL Trı̀nh tự trnH-psbA đươ ̣c cho là chı̉ thi ̣ hiê ̣u quả phân tı́ch đa da ̣ng di truyề n giữa các Xá xi ̣ta ̣i Vườn quố c gia Tam Đảo, cu ̣ thể vi ̣trı́ nucleotide bảo thủ (không biế n đổ i) giữa 07 mẫu nghiên cứu là 453 nucleotide, còn số vi ̣trı́ biế n đổ i là 10 nucleotide với 06 vi ̣trı́ có ý nghıã tiế n hóa thể hiê ̣n sự khác biê ̣t giữa ba mẫu trở lên Chı̉ số đa da ̣ng haplotype tương đố i cao (Hd = 0,9524) và chı̉ số đa da ̣ng nucleotide thấ p (Pi = 0,00926) Kế t quả về giám đinh ̣ và đánh giá đa da ̣ng di truyề n loài Xá xi ̣ ta ̣i Vườn quố c gia Tam đảo là sở khoa ho ̣c để đưa giải pháp bảo tồ n và phát triể n hữu hiê ̣u loài này Từ khóa: đa da ̣ng di truyề n, ADN mã va ̣ch, Xá xi,̣ Cinnamomum parthenoxylon ĐẶT VẤN ĐỀ Xá xi ̣ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) là loài gỗ, kích thước trung bình lớn; thân hình trụ thẳng, cao 20-25 m, đường kính thân 40-70 cm; gốc phình to đơi có bạnh gốc Vỏ ngồi màu nâu, nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc bong mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt Lá đơn nguyên, mọc cách; phiến hình trứng hay hình bầu dục thn; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng; hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; cuống dài 1,2-3 cm Cụm hoa dạng chuỳ hay tán; mọc đầu cành hay nách lá; cụm mang khoảng 10 hoa Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,6-1 cm; đế hình chén, có khía răng, chín màu xanh vàng tím đen (Hı̀nh 1) Hın ̀ h Cành mang hoa Xá xị Tam Đảo, Vĩnh Phúc (Phùng Văn Phê, 2019) Ta ̣i Vườn quố c gia Tam Đảo tı̉nh Vĩnh Phúc, Xá xị phân bố rải rác chủ yếu thuộc kiểu rừng thứ sinh nhân tác Số lượng cá thể Xá xị tìm thấy cịn khoảng 10 (Phùng Văn Phê, 2019) Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khơ bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dày, phong thấp, mẩn ngứa da Quả dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà Tinh dầu Xá xị sử dụng rộng rãi công nghệ hoá mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm, đó có giá tri ̣ thương ma ̣i rấ t lớn thi ̣trường thế giới (Nguyễn Tiế n Bân, 2003; Pha ̣m Hoàng Hơ ̣, 1999) TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 13 Công nghệ sinh học & Giống trồng Là loài có giá tri ̣ kinh tế cao lại cộng thêm khả tái sinh tự nhiên kém, bi ̣ khai thác bừa bãi để cất tinh dầu làm cho loài Xá xi ̣ đứng trước nguy tuyệt chủng Do vậy, bảo tồn nguồn gen Xá xị việc làm cấp thiết Tuy nhiên, để cơng tác bảo tồn có hiệu quả, cần phối hợp đồng biện pháp bảo tồn ngoại vi bảo tồn nội vi Trong giải pháp tối ưu thiết thực nghiên cứu phát triển với chương trình trồng rừng (Sách Đỏ Viê ̣t Nam, 2007) Những nghiên cứu về đă ̣c điể m sinh ho ̣c, sinh thái và mô ̣t số biê ̣n pháp nhân giố ng của loài Xá xi ̣ đã đươ ̣c thực hiê ̣n (Lê Đı̀nh Khả, 2003; Phùng Văn Phê, 2012) Tuy nhiên, những nghiên cứu về đinh ̣ danh loài và đánh giá đa da ̣ng di truyề n dựa các chı̉ thi ̣ phân tử của Xá xi ̣ la ̣i chưa đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i Viê ̣t Nam Do đó, mu ̣c tiêu của đề tài là đinh ̣ danh và nghiên cứu sự đa da ̣ng di truyề n loài Xá xi ̣ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo, tın̉ h Vıñ h Phúc để đưa chiế n lươ ̣c bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen loài có giá tri ̣này Hiê ̣n nay, ADN mã va ̣ch đã đươ ̣c chứng minh là những chı̉ thi ̣ phân tử có đô ̣ chı́nh xác cao viê ̣c đinh ̣ danh loài và đánh giá đa da ̣ng di truyề n Đặc điểm quan trọng ADN mã va ̣ch phải phổ biến đặc hiệu biến dị dễ dàng sử dụng Điều có nghĩa đoạn gen sử dụng mã va ̣ch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có biến đổi lồi ổn định bảo thủ cao bên loài biến đổi khơng đáng kể Do đó, ADN mã va ̣ch lý tưởng đoạn ADN có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp với cặp mồi thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại PCR Ở thực vâ ̣t, các đoa ̣n ADN mã va ̣ch có thể là những đoa ̣n ADN nằ m ̣ gen nhân (28S rDNA, ITS,…) (Baharum, 2012; Chen, 2010; Schoch et al., 2012) hoă ̣c ̣ gen lu ̣c la ̣p (matK, rbcL, trnH – psbA, rpo, trnL-trnF, ycf, ) (Yu et al., 2011; Hollingsworth, 2011) Ba mã va ̣ch ADN là rbcL, matK, trnH-psbA đươ ̣c sử du ̣ng để đánh giá sự đa da ̣ng của các loài mô ̣t lô rừng mưa nhiê ̣t đới ta ̣i Queensland, Ú c 14 và kế t luâ ̣n rằ ng ADN mã va ̣ch là mô ̣t trơ ̣ giúp đáng kể đánh giá đa da ̣ng sinh ho ̣c và xác đinh ̣ các quầ n thể cả chúng không thể phân biê ̣t đươ ̣c tấ t cả các loài lô (Costion et al., 2011) ADN mã va ̣ch đươ ̣c sử du ̣ng để giải quyế t vấ n đề bảo tồ n đa da ̣ng sinh ho ̣c theo hai cách sau: (1) Là mô ̣t phương tiê ̣n giám sát đa da ̣ng sinh ho ̣c chıń h xác và nhanh chóng cả trước và sau các hành đô ̣ng bảo tồ n, (2) Cung cấ p dữ liê ̣u để hỗ trơ ̣ viê ̣c ước tıń h sự đa da ̣ng phát sinh loài để thiế t lâ ̣p các ưu tiên bảo tồ n (Krishnamurthy và Francis, 2012) Trên đố i tươ ̣ng các loài thuô ̣c ho ̣ Long Não (Lauraceae), nhóm nghiên cứu của Liu (Liu et al., 2016) đã sử du ̣ng 04 trıǹ h tự ADN mã va ̣ch là matK, rbcL, trnH-psbA và ITS2 để đánh giá hiê ̣u quả phân biê ̣t loài Kế t quả cho thấ y, trıǹ h tự ITS2 không phù hơ ̣p để làm mã va ̣ch cho các loài thuô ̣c ho ̣ Long naõ Trı̀nh tự matK và rbcL có tỷ lê ̣ đinh ̣ danh loài thành công lầ n lươ ̣t là 30,9% và 25,0% Trong đó trıǹ h tự trnH-psbA có khả xác đinh ̣ loài tố t với tỷ lê ̣ đa ̣t 84,0% Nghiên cứu cũng cho thấ y viê ̣c sử du ̣ng chı̉ thi ̣ trnH-psbA có hiê ̣u quả xác đinh ̣ loài ho ̣ Long naõ cao hẳ n các chı̉ thi ̣ matK, rbcL, hay sự kế t hơ ̣p của cả matK và rbcL Sudmoon et al (2014) đã sử dụng vùng rpoB, rbcL matK để xác định bảy loài biết Cinnamomum aromaum (dầu cassia), C camphora (dầu xá xị ho), C bejolghota, C tamala, C zeylanicum (C verum) C burmannii bảy loài chưa biết loài quế (họ Long não) So sánh với số trình tự từ Ngân hàng gen, khoảng cách di truyền vùng gen matK, rbcL rpoB 0,00 đến 0,52; 0,00 đến 0,36 0,00 đến 0,30 Nhưng ba vùng rpoB, rbcL matK sử dụng để xác định nhóm lồi Cinnamomum khơng có khác biệt trình tự nhiều lồi khác Mô ̣t số nghiên cứu về đa da ̣ng di truyề n các loài Cinnamomum dựa chı̉ thi ̣ RAPD đố i với loài C zeylanicum cho thấ y 89% biế n đổ i di truyề n giữa các mẫu nghiên cứu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng (Sandigawad và Patil, 2011), chı̉ thi ̣ EST-SSR đố i với loài C camphora ta ̣i miề n Nam Trung Quố c sử du ̣ng chı̉ thi ̣ EST-SSR cho thấ y sự khác biê ̣t di truyề n giữa các quầ n thể là thấ p, chı̉ 17% biế n đổ i đươ ̣c quan sát giữa các quầ n thể (Zhong et al., 2019), kế t hơ ̣p chı̉ thi ̣ ESTSSR và cpADN loài C chago ta ̣i tın ̉ h Vân Nam, Trung Quố c cho thấ y quầ n thể nghiên cứu có mức đa da ̣ng di truyề n thấ p sự khác biê ̣t di truyề n đáng kể giữa các quầ n thể đươ ̣c phát hiê ̣n (Zhang et al., 2021) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Lựa chọn mẫu cách lấy mẫu Lá của 07 Xá xi ̣đươ ̣c thu thâ ̣p từ Vườn Quố c gia Tam Đảo, tı̉nh Vıñ h Phúc Các mẫu đươ ̣c kı́ hiê ̣u sau: VP 01, VP 02, VP 03, VP 04, VP 05, VP 07, và VP 12 (Bảng 1) Bảng Điạ điể m và thời gian thu thâ ̣p các mẫu Xá xi ta ̣ ̣i vườn Quố c gia Tam Đảo STT Ký hiêụ mẫu Địa điểm thu nhận mẫu Thời gian thu mẫu Kinh độ (m) Vĩ độ (m) VP 01 Minh Quang – Tam Đảo 9/2019 565059 2372626 VP 02 Minh Quang – Tam Đảo 9/2019 565617 2371482 Tọa độ VP 03 Hồ Sơn – Tam Đảo 9/2019 565599 2371517 VP 05 Hồ Sơn – Tam Đảo 9/2019 565154 2371501 VP 06 Hồ Sơn – Tam Đảo 9/2019 565144 2372595 VP 07 Hồ Sơn – Tam Đảo 9/2019 563635 2371620 VP 12 Tam Quan – Tam Đảo 9/2019 565800 2373831 o (Sử dụng ̣ tọa độ VN2000 múi chiế u tı̉nh Vıñ h Phúc) Yêu cầ u về mẫu lá và cách bảo quản: cắ t những lá bánh tẻ, xanh và không bi ̣ sâu bê ̣nh Sau đó bảo quản mẫu lá túi nilon có chứa ̣t hút ẩ m silica gel, vâ ̣n chuyể n về phòng thı́ nghiê ̣m ngày Các mẫu lá đươ ̣c bảo quản tủ la ̣nh -20oC cho đế n đươ ̣c sử du ̣ng để tách chiế t ADN tổ ng số 2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổ ng số ADN tổ ng số tách chiết từ mẫu lá Xá xi theo hướng dẫn sử du ̣ng của bô ̣ kit tách chiế t ̣ ADN thực vâ ̣t “DNA mini kit Qiagen” của hañ g Qiagen, CHLB Đức Các mẫu ADN tổ ng số sau tách chiế t đươ ̣c bảo quản ở nhiê ̣t đô ̣ -20oC 2.3 Phương pháp khuyếch đại PCR xác đinh ̣ trình tự nucleotide Phản ứng PCR thực máy PCR TC1000-G (Biologix) với thành phần bao gồ m: 10l PCR master mix 2X, 1l mồ i xuôi (10M ) và 1l mồ i ngươ ̣c (10M), 1l ADN khuôn (50ng), bổ sung H2O deion tới 20l Chương trıǹ h nhiê ̣t đô ̣ của phản ứng PCR sau: biế n tı́nh ở 95oC phút; 35 chu kì lă ̣p la ̣i của ba bước 95oC – 30 giây, 51oC-52oC (tùy mồ i) – 30 giây, 72oC – phút; kế t thúc tổ ng hơ ̣p ở 72oC phút; bảo quản sản phẩ m PCR ở 4oC Tên mờ i, trình tự nucleotide mồi ADN mã va ̣ch và nhiê ̣t đô ̣ gắ n mồ i của các mồ i sử dụng nghiên cứu đươ ̣c thể hiê ̣n bảng Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,0% có bổ sung thuố c nhuô ̣m axit nucleic (Redsafe) Sau điện di, bản gel agarose soi dưới đèn UV và chụp ảnh Bảng Danh sách trình tự nucleotide cặp mồi Gen matK trnHpsbA rbcL Kí hiệu mồi matK_F matK_R trnH_F psbA_R rbcL_F rbcL_R Trın ̀ h tư ̣ mồ i (5’-3’) ACCCAGTCCATCTGGAAATCTGGTTC CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAACGTAATGCTC ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC GTAAAATCAAGTCCACCTCG 52 Kı́ch thước đoa ̣n gen (bp) 850 51 460 Sang et al., 1997 52 600 Kress and Erickson, 2007 Ta (OC) Tham khảo Kress and Erickson, 2007 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 15 Công nghệ sinh học & Giống trồng Những sản phẩm PCR sau khuếch đại thành công tinh sử du ̣ng bô ̣ kit Prification Kit của hãng InTRON – Hàn Quố c Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gửi cho phịng thí nghiệm 1st Base Malaysia để giải trình tự nucleotide theo cả hai chiề u xi và ngươ ̣c Trình tự nucleotide đoạn ADN xác định máy giải trình tự tự đô ̣ng dựa nguyên lý của Sanger, sử dụng Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 2.4 Phương pháp phân tích liệu ADN mã vạch Các trıǹ h tự nucleotide đươ ̣c phân tıć h và xử lý bằ ng phầ n mề m tin sinh BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), Mega7 (Kumar et al., 2015), và các công cu ̣ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây quan ̣ di truyề n đươ ̣c xây dựng dựa phương pháp Maximum likelihood, với số lầ n lă ̣p là 1000 Đa da ̣ng nucleotide (Pi) và đa da ̣ng haplotype (Hd) đươ ̣c tı́nh toán dựa phầ n mề m DnaSP v.5.0 (Librado và Rozas, 2009) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết ADN tổng số Bước đầ u thử nghiê ̣m phương pháp tách chiế t ADN tổng số từ mẫu theo phương pháp CTAB (Saghai-Maroof cộng sự, 1984), sử dụng hai nồ ng đô ̣ đệm CTAB khác là 2% 4% đề u không thu ADN tổ ng số Nguyên nhân có thể là lá Xá xị có nhiều tinh dầu, ủ nhiệt độ 65oC với đệm CTAB thı̀ hỗn hơ ̣p trở nên đặc quánh, dich ̣ thu đươ ̣c sau ly tâm cũng có đô ̣ nhớt rấ t cao Do đó, hiê ̣u quả thu nhâ ̣n ADN tổng số không cao ở các bước tiế p theo Kế t quả tách chiế t ADN tổ ng số không thành công này đã đươ ̣c kiể m nghiê ̣m thông qua phản ứng PCR sử du ̣ng că ̣p mồ i matK_F/R (như bảng 1) Chúng thực hiê ̣n phản ứng PCR với các nồ ng đô ̣ ADN tổ ng số khác đề u không thành công Qua có thể thấ y phương pháp CTAB không phù hơ ̣p để tách chiế t ADN tổ ng số từ mẫu lá loài Xá xi.̣ Sau q trình tách chiết ADN thực theo dẫn Kit tách chiết ADN tổng số “DNA mini kit Qiagen” Đức Khi sử dụng phương pháp ADN tổ ng số thu không còn nhớt, dung dich ̣ ADN hòa tan có màu chứ không có màu vàng nâu phương pháp CTAB Do đặc tính Xá xị (trong có tinh dầu) nên trình tách chiết ADN tổng số thu lượng ADN, đó hiển thị băng ADN tổng số gel agarose 1,0% Khi đo các mẫu ADN tổ ng số tách chiế t đươ ̣c bằ ng phương pháp quang phổ máy Scandrop cho kế t quả về nồ ng đô ̣ và đô ̣ tinh sa ̣ch cũng không tố t (nồ ng đô ̣ rấ t thấ p chı̉ từ 1,0 đế n 3,0 ng/µl và ̣ tinh sa ̣ch tương ứng với chı̉ số A260/A280 đa ̣t dưới 1,5) nên chúng phải tiế n hành kiểm tra hiê ̣u quả của viê ̣c tách chiế t ADN phản ứng PCR với cặp mồi matK_F/R Kết thu tất mẫu ADN tổng số xuấ t hiê ̣n sản phẩ m PCR là băng ADN có kích thước khoảng 850bp Từ kế t quả PCR này khẳng định đã tách chiết thành công ADN tổng số từ 07 mẫu lá Xá Xị sử du ̣ng Kit “DNA mini kit Qiagen” Đức Các mẫu ADN này đươ ̣c sử du ̣ng trực tiế p cho thı́ nghiê ̣m nhân bản các trıǹ h tự ADN mã va ̣ch ở loài Xá xi ̣nghiên cứu 3.2 Kết nhân gen với đoạn ADN mã vạch kĩ thuật PCR 07 mẫu ADN tổng số tách chiết từ lá của 07 Xá xi ̣ sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Hın ̣ ̣i Tam Đảo, Vıñ h Phúc ̀ h Kết nhân bản 03 đoa ̣n trın ̀ h tư ̣ ADN mã va ̣ch của 07 mẫu Xá xi ta ((A): Trı̀nh tự matK, (B): Trı̀nh tự rbcL, (C): Trı̀nh tự trnH-psbA Giế ng 1-7: mẫu VP 01, VP 02, VP 03, VP 04, VP 05, VP 07, và VP 12; M: Thang đo ADN 100bp) 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Că ̣p mồ i matK_F/R đươ ̣c sử du ̣ng để thực hiê ̣n phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen matK 07 mẫu Xá xi,̣ kế t quả PCR đươ ̣c thể hiê ̣n hı̀nh 2A Từ kế t quả điê ̣n di sản phẩ m PCR nhân bản đoa ̣n gen matK cho thấ y cả 07 mẫu Xá xi ̣ đề u xuấ t hiê ̣n mô ̣t băng ADN đă ̣c hiê ̣u với kıć h thước khoảng 850 bp dự kiế n Mẫu đố i chứng âm, đó ADN khuôn đươ ̣c thay bằ ng nước không xuấ t hiê ̣n băng ADN Kế t quả này thể hiê ̣n că ̣p mồ i matK_F/R rấ t đă ̣c hiê ̣u và đoa ̣n gen matK đươ ̣c nhân bản thành công ở tấ t cả các mẫu Xá xi ̣nghiên cứu Từ kế t quả điê ̣n di sản phẩ m PCR nhân bản đoa ̣n gen rbcL cho thấ y cả 07 mẫu Xá xi ̣ đề u xuấ t hiê ̣n mô ̣t băng ADN đă ̣c hiê ̣u với kı́ch thước khoảng 600 bp, băng ADN tương đố i rõ nét tương đồng dự kiế n (Hı̀nh 2B) Kế t quả này thể hiê ̣n că ̣p mồ i rbcL_F/R rấ t đă ̣c hiê ̣u và hiê ̣u quả nhân bản rấ t cao ở các mẫu Xá xi ̣nghiên cứu Hıǹ h 2C cho thấy 07 mẫu Xá xi ̣đều xuất băng sản phẩ m PCR đă ̣c hiê ̣u của că ̣p mồi trnH_F/psbA_R, băng ADN rõ tương đồng nhau, kích thước băng ADN khoảng 460 bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 100 bp) Kết cho thấ y cặp mồi trnH_F/psbA_R đặc hiệu có khả nhân bản thành công tấ t cả mẫu Xá xị nghiên cứu 3.3 Phân tích trình tự nucleotide đoạn ADN mã vạch Các sản phẩm PCR tinh kit PCR Purification Kit InTRON – Hàn Quố c theo hướng dẫn của nhà sản xuấ t trình tự nucleotide của các đoa ̣n gen đươ ̣c xác đinh ̣ bởi công ty 1st BASE - Malaysia 3.3.1 Phân tı́ch trình tự nucleotide đoa ̣n gen matK Sau xác đinh ̣ trıǹ h tự nucleotide bằ ng phương pháp tự đô ̣ng và xử lý trı̀nh tự phầ n mề m BioEdit, thu đươ ̣c đoạn gen matK với kích thước 784 bp với chấ t lươ ̣ng giải trı̀nh tự tớ t Vì vậy, chúng tơi sử dụng đoa ̣n trıǹ h tự có kích thước 784 bp đoạn gen matK để thực hiê ̣n phân tích, so sánh Kế t quả so sánh 07 trình tự đoa ̣n gen matK 07 mẫu Xá xi ̣ (VP 01, VP 02, VP 03, VP 05, VP 06, VP 07 VP 12) cho thấ y tấ t cả 07 mẫu có sự tương đồ ng 100% Các trı̀nh tự này đươ ̣c đăng ký lên GenBank với mã số MZ821041 Từ kế t quả này, lựa cho ̣n trình tự đoa ̣n gen matK của mẫu VP 01 làm đa ̣i diê ̣n để so sánh với các trình tự tương đờ ng GenBank Kết so sánh trình tự đoạn gen matK các mẫu Xá xi ̣ta ̣i Tam Đảo (đa ̣i diê ̣n là mẫu VP 01) và 06 trıǹ h tự matK của các loài thuô ̣c chi Cinnamomum đươ ̣c thể hiê ̣n hıǹ h Trình tự đoa ̣n gen matK mẫu VP 01 có tỉ lệ tương đồng 100% với loài Cinnamomum parthenoxylon (KJ510895.1) Mẫu VP 01 có mức độ sai khác nhỏ so với loài Cinnamomum aromaticum (NC046019.1); Cinnamomum yabunikkei (NC044864.1); Cinnamomum reticulatum (MF651971.1); Cinnamomum polyadephum (AB924731.1); Cinnamomum chekiangense (HQ427409.1) với tỷ lê ̣ phầ n trăm sai khác về trıǹ h tự nucleotide cùng 0.13% Vi ̣ trı́ sai khác của mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu với 05 loài khác cùng thuô ̣c chi Cinnamomum đươ ̣c thể hiê ̣n ta ̣i vi ̣ trı́ số 414, đó mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu và loài C parthenoxylon (KJ510895.1) là nucleotide loa ̣i T, còn 05 loài còn la ̣i là nucleotide loa ̣i G Sự khác về mô ̣t vi ̣ trı́ nucleotide nhấ t giữa mẫu VP 01 và loài Cinnamomum parthenoxylon với 05 loài còn la ̣i có thể giả thuyế t là mô ̣t đô ̣t biế n thay thế đồ ng nghıã đã dẫn đế n sự hıǹ h thành các loài mới chi Long Naõ và các loài này có cùng nguồ n gố c Như vâ ̣y, đoa ̣n trıǹ h tự mã va ̣ch matK sử du ̣ng nghiên cứu này không phân biê ̣t đươ ̣c loài chi Cinnamomum GenBank (C aromaticum (NC046019.1); C yabunikkei (NC044864.1); C reticulatum (MF651971.1); C polyadephum (AB924731.1); C chekiangense (HQ427409.1)) la ̣i có khả phân biê ̣t đươ ̣c loài Xá xi ̣ với đô ̣ chıń h xác cao và tương đồ ng với kế t quả đinh ̣ danh dựa theo hıǹ h thái Phùng Văn Phê mô tả (2012) Ta ̣i Viê ̣t nam, nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n mô ̣t số giố ng hhañ dựa trıǹ h tự matK cho thấ y mô ̣t vi ̣ trı́ đô ̣t biế n di ̣ hoán (T>G) đã có ý nghıã viê ̣c nhâ ̣n da ̣ng 11 giố ng nhañ (Nguyễn Thi ̣ Ngo ̣c Lan et al., 2019) Vı̀ vâ ̣y, đoa ̣n trı̀nh trự matK sử du ̣ng nghiên cứu này có hiê ̣u quả đố i với mu ̣c tiêu giám đinh ̣ loài đoa ̣n trı̀nh tự này không phân biê ̣t đươ ̣c các Xá xi ̣ ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo vı̀ trı̀nh tự nucleotide của tấ t cả các mẫu đề u giớ ng 3.3.2 Phân tı́ ch trình tự nucleotide đoa n ̣ gen rbcL TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 17 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Sau xử lý trıǹ h tự, doạn gen rbcL với kích thước 526 bp của 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu (VP 01, VP 02, VP 03, VP 05, VP 06, VP 07, VP 12) đươ ̣c so sánh và cho kết tương đồng 100% về trıǹ h tự nucleotide, đươ ̣c đăng ký GenBank với mã số MZ821043 Vı̀ vâ ̣y, mẫu VP 01 đươ ̣c sử du ̣ng làm đại diện cho tấ t cả 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu để so sánh với các trình tự Genbank Mẫu VP 01 05 lồi C parthenoxylon, C aromaticum, C dubium, C heyneanum, C malabatrum vị trí 38 nucleotide loại A có lồi C burmannii nucleotide loại C Ở vị trí 45 46 mẫu VP 01 03 loài C parthenoxylon, C burmannii, C aromaticum nucleotide loại G nucleotide loại A Cịn 03 lồi C dubium,C heyneanum,C malabatrum vị trí 45,46 nucleotide loại A nucleotide loại G Vị trí 261 mẫu VP 01 05 loài C parthenoxylon, C burmannii, C dubium,C heyneanum, C malabatrum nucleotide loại T, loài C aromaticum nucleotide loại C (Hıǹ h 4) Qua phân tı́ch sự khác ta ̣i các vi ̣ trı́ nucleotide cho thấ y mẫu VP01 và loài C parthenoxylon có trı̀nh tự nucleotide đoa ̣n gen rbcL tương đồ ng 100%, loài C burmannii và C aromaticum có mức đô ̣ tương đồ ng rấ t cao (chı̉ khác nucleotide), còn ba loài C dubium,C heyneanum và C malabatrum tương đồ ng 100% Hın ̀ h So sánh trın ̀ h tư ̣ nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP 01 với 06 trın ̀ h tư ̣ tương đồ ng ngân hàng gen 18 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Kế t quả cho thấ y mẫu VP 01 có sự tương đồ ng rấ t cao với loài Cinnamomum parthenoxylon (KX546848.1) (100%) và cao với mô ̣t số loài thuô ̣c chi Cinnamomum (99,62% đế n 99,81%): tương đồ ng với C burmannii (KX546826.1) và C aromaticum (KP094936.1) 99,81%; với loài C dubium (MK243402.1), C heyneanum (KY945255.1), và C malabatrum (KY945245.1) 99,62% Sự sai khác về trı̀nh tự nucleotide của hai đoa ̣n gen matK và rbcL giữa các mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu với các loài chi Cinnamomum GenBank không nhiề u, sự tương đồ ng 100% của 07 mẫu Xá xi ̣ với loài C parthenoxylon đươ ̣c thể hiê ̣n rấ t rõ ràng hı̀nh và hı̀nh so sánh trı̀nh tự nucleotide Do đó, quan ̣ di truyề n thể hiê ̣n sự tương đồ ng di truyề n cũng mố i quan ̣ gầ n gũi của 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu với loài C parthenoxylon và các loài khác thuô ̣c chi Cinnamomum là không cầ n thiế t Hın ̀ h So sánh trın ̀ h tư ̣ nucleotide đoa ̣n gen rbcL của mẫu VP 01 với 06 trın ̀ h tư ̣ tương đồ ng ngân hàng gen ADN mã va ̣ch đươ ̣c sử du ̣ng rô ̣ng raĩ sinh ho ̣c thực vâ ̣t để phân loa ̣i các đơn vi ̣ phân loa ̣i gầ n Sự sai khác về trı̀nh tự nucleotide các vùng tiêu chuẩ n đủ để phân biê ̣t thâ ̣m chı́ cả những đơn vi ̣ phân loa ̣i gầ n Tuy nhiên, vài trường hơ ̣p, sự sai khác về trıǹ h tự nucleotide các vùng tiêu chuẩ n là không đủ để phân biê ̣t các đơn vi ̣ phân loa ̣i có quan ̣ gầ n (Chen et al., 2015) Sudmoon et al (2014) cho rằ ng đoa ̣n trı̀nh tự matK và rbcL có hiê ̣u quả thấ p viê ̣c phân biê ̣t các loài chi Cinnamomum vı̀ rấ t nhiề u loài không có sự sai khác về trıǹ h tự nucleotide Chandrasekara et al (2021) ghi nhâ ̣n mô ̣t vi ̣ trı́ nucleotide sai khác nhấ t vùng rbcL giữa mơ ̣t mẫu của loài C TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 19 Công nghệ sinh học & Giống trồng ovalifolium với mô ̣t số loài khác thuô ̣c chi Cinnamomum ta ̣i Sri Lanka và đó là mô ̣t sự thay thế đồ ng nghıã Trıǹ h tự matK cho thấ y sự sai khác ta ̣i vi ̣ trı́ nucleotide đó trı̀nh tự trnH-psbA xuấ t hiê ̣n 11 vi ̣ trı́ sai khác nucleotide giữa các loài Cinnamomum nghiên cứu Cả ba trıǹ h tự ADN mã va ̣ch đề u không đủ để phân loa ̣i loài Cinnamomum đă ̣c hữu ta ̣i Sri Lanka mă ̣c dù kế t quả phân tı́ch trı̀nh tự nucleotide của từng chı̉ thi ̣ ADN mã va ̣ch cho thấ y sự gầ n gũi về mă ̣t di truyề n của loài nghiên cứu và sự đa da ̣ng bên loài khá cao ở mô ̣t số loài Trong nghiên cứu này hai đoa ̣n trı̀nh tự matK và rbcL cũng cho thấ y sự sai khác rấ t nhỏ giữa các loài chi Cinnamomum, các gen này đề u là những gen chức nên trıǹ h tự rấ t bảo thủ, các vi ̣ trı́ sai khác đề u là những đô ̣t biế n thay thế đồ ng nghıã Trı̀nh tự matK chı̉ sai khác mô ̣t vi ̣ trı́ nucleotide giữa loài Xá xi ̣ C parthenoxylon với 05 loài khác thuô ̣c chi Cinnamomum GenBank, mă ̣c dù cả 05 loài này tương đồ ng 100% về trıǹ h tự nucleotide của đoa ̣n gen matK Còn trı̀nh tự rbcL cho thấ y sự sai khác từ mô ̣t đế n hai nucleotide Kế t quả này bổ sung thêm những bằ ng chứng về viê ̣c sử du ̣ng hiê ̣u quả các trıǹ h tự ADN mã va ̣ch ở các loài khác là rấ t khác nhau, cho dù là các loài cùng thuô ̣c mô ̣t chi Tuy nhiên, cầ n tiế p tu ̣c nghiên cứu thêm mô ̣t số trıǹ h tự ADN mã va ̣ch khác để có thể khẳ ng đinh ̣ về sự phân biê ̣t giữa loài C parthenoxylon với các loài khác cùng chi 3.3.3 Phân tı́ch trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA Đa da ̣ng di truyề n giữa 07 mẫu Xá xi dư ̣ ̣a trın ̀ h tự trnH-psbA Trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA mẫu Xá xi ̣ có sai khác ta ̣i 10 vi ̣ trı́ nucleotide (Hı̀nh 5) Ta ̣i các vi ̣ trı́ sai khác có thể nhâ ̣n thấ y mẫu VP 06 và VP 07 có trıǹ h tự tương đồ ng 100%, còn các mẫu khác có sự sai khác mô ̣t cách ngẫu nhiên Phân tı́ch trı̀nh tự nucleotide của vùng trnH-psbA ở các mẫu Xá xi ̣ cho kế t quả vùng bảo tồ n là 453/463 nucleotide, vùng biế n đổ i là 10/463 nucleotide, đó có vi ̣ 20 trı́ nucleotide khác biê ̣t trı̀nh tự của mô ̣t mẫu VP01 với tấ t cả các mẫu còn la ̣i (vi ̣ trı́ 207, 300, 351, và 436) và vi ̣ trı́ nucleotide có sự khác biê ̣t từ hai mẫu trở lên và là vi ̣ trı́ nucleotide biế n đổ i mang thông tin tiế n hóa (parsimony informative sites) ta ̣i các vi ̣ trı́ nucleotide số 133, 175, 265, 314, 339 và 408 Trıǹ h tự trnH-psbA là trıǹ h tự không mã hóa nên có sự biế n đổ i giữa các cá thể cùng loài cũng biế n đổ i lớn giữa các loài (Kress and Erickson, 2007) Chı̉ số haplotype (h) là 6, bao gồ m haplotype 1: VP 01, haplotype 2: VP 02, haplotype 3: VP 03, haplotype 4: VP 05, haplotype 5: VP 06 và VP07, haplotype 6: VP 12 Đa da ̣ng haplotype (Hd) là 0,9524, chı̉ số đa da ̣ng nucleotide (Pi) là 0,00926 Kế t quả này cho thấ y đa da ̣ng di truyề n của quầ n thể Xá xi ̣ ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo tương đố i cao, đó loài này vẫn có tiề m phát triể n ngoài tự nhiên môi trường thay đổ i Đa da ̣ng di truyề n bi ̣ ảnh hưởng bởi mô ̣t số yế u tố tuổ i đời, pha ̣m vi phân bố , khả sinh sản và ̣ thố ng sinh sản của loài (Nybom, 2004; Wu et al., 2015) Đố i với quầ n thể Xá xi ̣ ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo, có thể hoa ̣t đô ̣ng khai thác quá mức và khả tái sinh kém mà loài này có số lươ ̣ng cá thể ıt́ và phân bố rải rác Zhang et al (2021) nghiên cứu đoa ̣n trı̀nh tự trnH-psbA dài 452 bp của quầ n thể loài C chago ta ̣i Trung Quố c cho thấ y sự đa da ̣ng nucleotide ta ̣i 13 vi ̣ trı,́ có haplotype các quầ n thể nghiên cứu Đa da ̣ng di truyề n của loài C chago thấ p nhiề u so với các loài phân bố rô ̣ng ho ̣ Long naõ C camphora Trong nghiên cứu này, tác giả cho rằ ng các hoa ̣t đô ̣ng gây xáo trô ̣n thường xuyên của người sự tàn phá và phân cách môi trường số ng tự nhiên quầ n thể có tương quan chă ̣t chẽ với mức đô ̣ đa da ̣ng di truyề n thấ p của loài C chago Giám đinh ̣ loài Xá xi ̣ dưạ trın ̀ h tự trnH-psbA Sử du ̣ng trı̀nh tự trnH-psbA của 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu để BLAST, chúng xác đinh ̣ đươ ̣c 07 loài thuô ̣c chi Cinnamomum TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng GenBank có mức đô ̣ tương đồ ng cao để xây dựng quan ̣ di truyề n Cây quan hệ di truyền chia làm hai nhóm Nhóm thứ gồm 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu VP 01, VP 02, VP 03, VP 05, VP 06, VP 07, VP 12 và 05 loài của chi Cinnamomum với đô ̣ tin câ ̣y cao (boostrap 100%) Các mẫu Xá xị nghiên cứu khơng có sai khác nhiều trình tự nucleotide chúng có xuất xứ Trong đó, 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo có mố i quan ̣ gầ n nhấ t với loài C parthenoxylon, sau đó là hai loài C aromaticum và C chago, và xa là hai loài C camphora và C micranthum Loài Cascabela thevetia đươ ̣c sử du ̣ng mô ̣t loài bên ngoài (outgroup) để thể hiê ̣n rõ mố i quan ̣ gầ n gũi giữa các loài cùng thuô ̣c chi Cinnamomum (Hı̀nh 6) Hın ̀ h So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo Như vậy, đoa ̣n trıǹ h tự mã va ̣ch trnH-psbA cũng cho thấ y hiê ̣u quả viê ̣c giám đinh ̣ loài Xá xi ̣ tỷ lê ̣ lương đồ ng với loài C parthenoxylon không cao hai trı̀nh tự matK và rbcL ở Tuy nhiên, đoa ̣n trı̀nh tự mã va ̣ch này la ̣i có hiê ̣u quả sự đánh giá đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể cùng xuấ t xứ, cùng mô ̣t vùng điạ lý các cá thể khác có sự sai khác về trıǹ h tự nucleotide Kế t quả này cũng tương tự kế t quả của dự án “Xây dựng bô ̣ sở dữ liê ̣u ADN mã va ̣ch phu ̣c vu ̣ công tác quản lý giố ng lâm nghiê ̣p đã đươ ̣c công nhân là giố ng Quố c gia” Hà Văn Huân chủ nhiê ̣m đã khẳ ng đinh ̣ đoa ̣n trıǹ h tự trnH-psbA là trıǹ h tự hiê ̣u quả nhấ t nghiên cứu đa da ̣ng di TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 21 Công nghệ sinh học & Giống trồng truyề n ở mức dưới loài Trı̀nh tự trnH-psbA là trıǹ h tự không mã hóa và biế n đổ i nhiề u nên viê ̣c kế t hơ ̣p với mô ̣t trıǹ h tự mã hóa và bảo thủ rbcL sẽ làm giảm bớt những sai sót (Kress và Erickson, 2007) Hın ̣ ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo ̀ h Cây qua hệ di truyền 07 mẫu Xá xi ta 05 lồi tương đờ ng Genbank KẾT LUẬN - Đã xác đinh ̣ đươ ̣c 03 trıǹ h tự ADN mã va ̣ch là trıǹ h tự matK (mã GenBank: MZ821041), rbcL (MZ821043), trnH-psbA (MZ821045 và MZ821046) cho loài Xá xi ̣ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) Trong đó, bước đầ u đánh giá hai trıǹ h tự matK và rbcL có thể sử du ̣ng để giám đinh ̣ loài Xá xi ̣ mă ̣c dù sự sai khác chı̉ là hoă ̣c nucleotide, còn trı̀nh tự trnH-psbA cho thấ y khả giám đinh ̣ loài Xá xi ̣thấ p - Bước đầ u đánh giá đươ ̣c sự đa da ̣ng di truyề n của các Xá xi ̣ ta ̣i Vườn Quố c gia Tam Đảo, tı̉nh Vıñ h Phúc dựa trı̀nh tự trnH-psbA, đó vi ̣ trı́ nucleotide bảo thủ (không biế n đổ i) giữa 07 mẫu nghiên cứu là 453 nucleotide, còn số vi ̣ trı́ biế n đổ i là 10 nucleotide Trong số 10 vi ̣ trı́ nucleotide sai khác thı̀ có 04 vi ̣ trı́ khác biê ̣t giữa hai mẫu và 06 vi ̣ trı́ khác biê ̣t giữa mẫu trở lên, đa da ̣ng haplotype tương đố i cao (Hd = 0,9524) và đa 22 da ̣ng nucleotide thấ p (Pi = 0,00926) Hai trıǹ h tự matK và rbcL không thể hiê ̣n bấ t kỳ sự đa da ̣ng di truyề n nào giữa các Xá xi ̣ nghiên cứu Lời cảm ơn Kinh phı́ thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi nhiê ̣m vu ̣ cấ p Quố c gia “Bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen Xá xi ̣ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) ta ̣i mô ̣t số tı̉nh miề n Bắ c” với mã số NVQG-2019/ĐT.14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Đình Khả (2003) Chọn tạo giống nhân giống cho số loài trồng rừng chủ yếu Việt Nam Nhà xuấ t bản Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thi ̣ Ngo ̣c Lan, Nguyễn Thi ̣ Lan Hoa, Nguyễn Thi ̣ Thanh Thủy, Lã Tuấ n Nghıã (2019) Nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n của đoa ̣n gen matK ở mô ̣t số nguồ n gen nhãn Viê ̣t Nam Ta ̣p chı́ KH&CN Viê ̣t Nam 61 (2): 61-64 Nguyễn Tiến Bân (2003) Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập II Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt Nam, Quyển Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng Phùng Văn Phê (2012) Nghiên cứu giâm hom Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) làm sở cho công tác bảo tồn Vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50 (6): 645-652 Chandrasekara CHWMRB, Naranpanawa DNU, Bandusekara BS, Pushpakumara DKNG, Wijesundera DSA, Bandaranayake PCG (2021) Universal barcoding regions, rbcL, matK and trnH-psbA not discriminate Cinnamomum species in Sri Lanka PLoS ONE 16(2): e0245592 Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., Berg C.V.D., Madriñán S., Petersen G., Seberg O., Jørgsensen T., Cameron K.M., Carine M., Pedersen N., Hedderson T.A.J., Conrad F., Salazar G.A., Richardson J.E., Hollingsworth M.L., Barraclough T.G., Kelly L., Wilkinson M (2007) A proposal for a st ADN ardised protocol to barcode all DNA plants Taxon 56 (2): 295299 Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS One (1): e8613 Chen J., Erickson D L., Xia N., Kress W J (2015) Testing DNA barcodes in closely related species of Curcuma (Zingiberaceae) from Myanmar and China Mol Ecol Resour 15 (2): 337-348 10 Costion C, Ford A, Cross H, Crayn D, Harrington M, Lowe A (2011) Plant DNA barcodes can accurately estimate species richness in poorly known floras PLoS ONE 6: e26841 11 Hall TA (1999) BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98 12 Hollingsworth M.L., Clark A (2009) Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven cDNAidate loci with species‐level sampling in three divergent groups of land plants Molecular Ecology Resources (2): 439-457 13 Kumar S., Stecher G., Tamura K (2015) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729 14 Kress WJ., Erickson DL (2007) A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region PLoS ONE 2(6): e508 15 Krishnamurthy PK, Francis RA (2012) A critical review on the utility of DNA barcoding in biodiversity conservation Biodiversity and Conservation 21: 1901– 1919 16 Librado P., Rozas J (2009) DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data Bioinformatics 25: 1451–1452 17 Liu Z F., Ci X.Q, Li L., Li H.W., Conran J G., Li J (2016) DNA barcoding evaluation and imlication for phylogenetic relationships in Lauraceae from China PLoS ONE 12 (4): e0175788 18 Nybom H (2004) Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants Mol Ecol 13: 1143–1155 19 Saghai-Maroof M A, Soliman K M, Jorgensen R A, Allard R W (1984) Ribosomal DNAsepacerlength polymorphism in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proc Natl Acad Sci 81: 8014–8019 20 Sandigawad A.M., Patil C.G (2011) Genetic diversity in Cinnamomun zeylanicum Blume (Lauraceae) using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers African Journal of Biotechnology 10: 3682-3688 21 Sang T., Crawford D.J., Stuessy T.F (1997) Chloroplast DNA phylogeny, reticulate evolution, and biogeography of Paeonia (Paeoniaceae) Am J Bot 84: 1120-1136 22 Schoch C.L., Seifert K.A (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Proceedings of the National Academy of Sciences 109 (16): 62416246 23 Sudmoon R., Chaveerach A., Sanublo A., Monkheang P., Kwanda N., Aungkapatatamgul S., Tanee T., Noikotr K., Chuachan C., Kaewdoungdee N (2014) Identifying Efficiency in Herbal Medicine Cinnamomum Species (Lauraceae) Using Banding Patterns and Sequence Alignments of rpoB, rbcL and matK Regions Chiang Mai J Sci 41(5.1): 1094-1108, Contributed Paper 24 Wu F.Q., Shen S.K., Zhang X.J., Wang Y.H., Sun W.B (2015) Genetic diversity and population structure of an extremely endangered species: the world’s Rhododendron AoB Plants 7: 10696–10700 25 Yu, J., Xue J.H., Zhou S.L (2011) New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms Journal of Systematics DNA Evolution 49 (3): 176-181 26 Zhang X., Yang L., Liu Y.H., Zhou X L., Zhang L.Q., Wang Y.H., Shen S.K (2021) Genetic diversity, genetic structure, and demographic history of Cinnamomum chago, a plant species with extremely small populations in China Global Ecology and Conservation 31: e01808 27 Zhong Y., Yang A., Li Z., Zhang H., Liu L., Wu Z., Li Y., Liu T., Xu M., Yu F (2019) Genetic diversity and population genetic structure of Cinnamomum camphora in South China revealed by EST-SSR markers Forests 10: f10111019 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 23 Công nghệ sinh học & Giống trồng IDENTIFICATION AND GENETIC DIVERSITY ASSESSMENT OF CINNAMOMUM PARTHENOXYLON IN TAM DAO NATIONAL PARK BY DNA BARCODE MARKERS Ha Bich Hong1, Nguyen The Huong1, Nguyen Thi Lan Anh2, Phung Van Phe1, Hoang Van Sam1, Nguyen Xuan Vinh3 Vietnam National University of Forestry Vestergaard Frandsen Vietnam Company Limited Chuong My A High School SUMMARY Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) is a high-grade tree with high economic value, with rare genetic resources, classified in group IIA (Decree 06/2019/ND-CP of the Government in 2019) and critically endangered CR group (Vietnam Red Book 2007) This species has a poor natural regeneration ability along with the indiscriminate exploitation of C parthenoxylon to store essential oil, making this tree species in danger of extinction Therefore, this species should be preserved and developed in the wild In this study, three DNA barcode markers matK, rbcL, and trnH-psbA were used to identify and analyze the genetic diversity of C parthenoxylon investigated in Tam Dao National Park, Vinh Phuc Province The results showed that all three DNA barcode markers showed high efficiency in the identification of C parthenoxylon species, in which the trnH-psbA marker had lower species identification efficiency than matK and rbcL markers The trnH-psbA sequence was found to be an effective marker in the analysis of genetic diversity among C parthenoxylon plants in Tam Dao National Park, specifically, the conserved nucleotide position between 07 samples is 453 nucleotides, and the number of variable sites is 10 nucleotides with parsimony informative sites showing differences between three or more samples The haplotype diversity index was relatively high (Hd = 0.9524) and the nucleotide diversity index was low (Pi = 0.00926) The results of the genetic diversity assessment of C parthenoxylon in Tam Dao National Park are the scientific basis for an effective conservation solution for this plant Keywords: Cinnamomum parthenoxylon, Genetic diversity, DNA barcode Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng 24 : 23/8/2021 : 20/9/2021 : 22/10/2021 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 ... (2014) đa? ? sử dụng vùng rpoB, rbcL matK để xác định bảy loài biết Cinnamomum aromaum (dầu cassia), C camphora (dầu xá xị ho), C bejolghota, C tamala, C zeylanicum (C verum) C burmannii bảy loài. .. Chí Minh TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Phùng Văn Phê (2012) Nghiên cứu giâm hom Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) làm sở cho... Tam Đa? ?o 9/2019 565599 2371517 VP 05 Hồ Sơn – Tam Đa? ?o 9/2019 565154 2371501 VP 06 Hồ Sơn – Tam Đa? ?o 9/2019 565144 2372595 VP 07 Hồ Sơn – Tam Đa? ?o 9/2019 563635 2371620 VP 12 Tam Quan – Tam Đa? ?o