Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học: Nghiên cứu quy trình nuôi trồng loài Cordyceps Militaris đạt hàm lượng Cordycepin cao trên giá thể nhân tạo thể rắn

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NUOI TRONG

LOÀI CORDYCEPS MILITARIS ĐẠT HÀM LƯỢNGCORDYCEPIN CAO TREN GIÁ THE NHÂN TẠO THE RAN

CHUYEN NGANH: CÔNG NGHỆ SINH HỌCMÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC.‘TS NGUYEN THỊ MINH HANG

Hà Nội, 2023

CONG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMĐộc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệukết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong.bắt kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bắt kỳ công trình nghiêncứu nảo đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luậnđánh giá luận văn của hội đồng khoa học.

Hà nội, ngày - tháng - năm 2023

NGƯỜI CAM DOAN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến.

‘TS Nguyễn Thị Minh Hằng - Trường Đại học Lâm nghiệp, đã tận tình.chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn“Thạc sỉ

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, ViệnCông nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trưởng Đại học Lâm Nghiệp đã trang bịkiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập.

‘i xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn tinh luận văn này.

-Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đỉnh, bạn bè và đồng nghiệpđã luôn sát cánh hỗ trợ va động viên tôi về cả vật chất và tinh than trong quátrình học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày thing - năm 2023TÁC GIÁ

Pham Thị Loan

DAT VAN DI

Chương 1 TONG QUAN VAN DE NGHIÊN CUU

1.1 Tông quan về Đông trùng hạ thao 3

1.1.1 Nguồn gée và phân loại: 31.1.2 Sự phân bổ của nắm Đông Trùng hạ thảo trong tự nhién 41.1.3 Cấu tạo hình thái của một số loài nắm thuộc chi Cordyceps soe1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm vào ký chủ của nắm Đông trùng hạ thảo Š1.1.5 Nắm Đăng trằng hạ thảo Cordyceps militaris 61.2 Giá trị dược liệu của nim Đồng trùng hạ thảo Cordyceps militaris 31.2.1 Giá trị dược liệu 7

1.2.2 Giá trị dịnh đường „"

1.3, Các yếu tổ ảnh hưởng tới sinh trường, phát triển nim Cordycepsmilitarism 131.3.1 Vai trồ của giống "`1-32 Yếu tổ dinh dưỡng 141Á3ØÑÙiRlùuảng của điều kiện nuôi cấy H

1.4 Tình hình nghiên cứu Đông trùng hạ thảo 1S14.1 Trong nước 151.4.2 Thể giới 18

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP.

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 212.2 Nội dung nghiên cứu os 212.3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu nghiên cứ 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết qua anh hưởng giá thể gạo nuôi trồng Đông (rừng ha thảo

3.2 Kết quả ảnh hướng của him lượng Cacbon đến khả năng sinh trưởng vaphát triển của qua thé nắm C, Militaris 353.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Nito đến khả năng sinh trưởng và373.4 Kết quả anh hưởng của nguồn muối khoáng đến khả năng sinh trưởng,phát triển của quả thé nắm Cuniliraris:

phát triển và ham lượng Cordycepin của nim C miliaris 39

3.5 Kết quả ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi trồng đến sinhtrưởng, phát triển Vá hàm lượng Cordycepin của nấm C miliari 443.6, Kết quả nghiên cứu các phương pháp sấy quả thể C militaris

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊTÀI LIỆU THAM KHẢO.

Carrot extract Sucrose AgarĐông trùng ha thio

+ Malt Extract AgarPotato Dextrose Agar

Peptone Yeast Extract Glucose

DANH MỤC CAC BẢN:

Bảng 1.1: Mô tả hình thái một số loài nắm thuộc chi Cordycei 5Bang 1.2: Thành phần dinh dưỡng nắm Cordyceps militaris 12Bang 2.1: Công thức đối chứng CTO trên giá thể nhân tạo thể rắn củanghiên cứu 24Bang 2.2: Điều kiện môi trường nuôi cấy Đông trùng hạ thảo đối chứng 25Bảng 2.3: Các loại gạo làm giá thể nuôi Đông tring ha thảo 25Bảng 2.4: Khảo sát nguồn Cacbon bổ sung đến sinh trưởng, phát triển và hàm.lượng Cordycepin của nắm € militaris 26

Bang 2.5: Khảo sit nguồn Nito bổ sungtriển và hàmlượng Cordycepin của nắm C milfaris 26

Bang 2.6: Khao sát nguồn muối khoáng bé sung đến sinh trưởng, phát triển và27Bảng 2.7: Khảo sát điều kiện nhiệt độ môi trường đến sinh trưởng, phát triểnhàm lượng Cordycepin của nắm € militaris

và him lượng Cordycepin của nấm C miilitaris ses 27Bang 2.8: Khảo sát điều lện chiếu sáng của môi trường đến sinh trưởng, pháttriển và ham lượng Cordycepin của nấm C militaris 28Bảng 29: Khảo sit điều kiện độ âm của mỗi trường đến sinh tướng, pháttriển va ham lượng Cordycepin của nắm C militaris : MBảng 2.10; Khảo sát giai doạn cấp đông sản phẩm ở phương pháp sấy thănghoa tới mẫu ma, ham lượng Cordycepin 31

Bảng 3.1: Danh gid khả năng ăn lan của hệ sợi nắm Đông trùng hạ thảo trên

Bang 3.2; Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo tới sự hìnhthành mam quả thé nắm Đông trùng ha thao 34Bang 3.3: Ảnh hưởng của các loại Cacbon đến kích thước quả thé và năng.suất sinh học nắm Đông trùng hạ thảo 36

Bang 3.4: Ảnh hưởng của nguồn Cacbon bổ sung tới ham lượng Cordycepincủa nắm Đông trùng hạ thảo _ _- 36Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn Nito đến kích thước quả thể và năng suấtsinh học của nắm Đông tring hạ thảo gã 38Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nito tới ham lượng Cordycepin trong qua thénắm đông tring ha thảo z : ` 39Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các loại muối khoáng đến kích thước quả thể vànăng suất sinh học của Đông trùng hạ thảo „40Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới him lượng Cordycepintrong quả thể nấm đông trùng hạ thảo 4Bang 3.9: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức thay đổi các yêu tố dinh dưỡng.giá thể nuôi Đông tring hạ thảo nản — we ADBảng 3.10: Kết qua nghiên cứu sự tác động của các nguồn đỉnh dưỡng trong sinh4Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi trồng đến sinh trưởng,trưởng, phát triển và hàm lượng Cordycepin của nim Đông trùng ha thảo phát triển và ham lượng Cordycepin của nắm DTHT 44Bảng 3.12: Ảnh hướng của cường độ ánh sáng đến đến sinh trưởng, phát triểnvà hàm lượng CofldyEepin của nấm Đông trùng hạ thảo .46Bảng 3.13: Kết quả khảo sắt ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh.trưởng, phát triển và hàm lượng Cordycepin của nắm Đông trùng hạ thảo 48Bang 3.14: Kết quả nghiên cứu nuôi trồng Đông trùng hạ thảo chủng VG2 ởđiều kiện dinh đường và môi trường nuôi trồng tối tru 50Bảng 3.15: Hình thái, được chất của nắm Đông trùng hạ thảo sau khi sấy 52Bang 3.16: Chất lượng của nắm C.militaris say bằng máy sấy thăng hoa 53

triển của nắm Đông trùng hạ thảo.

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nguồn Nito đến thời gian sinh trưởng và phát tri

của quả thể nắm Đông trùng hạ tháo 37Hình 3.3: Ảnh hưởng của ham lượng Muối khoáng đến khả năng sinh trưởng.và phát triển của nắm Đông trùng hạ thảo 40Hình 3.4: Mật độ quả thể của chủng nắm Đông trùng hạ thảo VG2 khi chiếusáng ở ngưỡng 250 ux ATHình 3.5: Giá thé nắm Đông trùng ha thảo VGI và VG2 nuôi ở điều kiện độ

ấm 90% ym 49Hình 3.6: Giá thé nắm đông trùng hạ thảo VG2 khi nudi ở wonđiều kiện tối ưu sỊHình 3.7: Kích thước quả thể nắm đông trùng ha thảo VG2 khi nuôi trongđiều kiện lý tưởng 51Hình 3.8: Hình thái quả thé nắm Đông trùng hạ thảo sau khi sấy s2Hình 3.9: Hình thái nấm DTHT sấy bằng máy sấy thăng hoa 5S

DAT VAN DE

Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là tên gọi chung chỉ những loài nim thuộc.lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chỉ Thitarodes.'Tên gọi của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tẾ: vào mùa Đông bao tirnắm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thé u trùng (Đông trừng), đến mùa hè quảthể nắm mọc chai tir đầu con sâu nhô lên khỏi mặt dat trông giống một loạithực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.

Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nướcphát triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị được lý của Đông trùng hạ thảo.€ militaris [1] [12] Nhiều hợp chất sinh học đã được tách chiết từ nắm C.

miliris, chẳng hạn như Polysacarit, Cordycepin, Adenosine, axit amin,Ergosterol, Superoxide effutase (SOD), Selen hữu cơ và vitamin tổng hợp[56] Các nghiên cứu cho thấy C miliaris có nhiều chức năng được lý như:chống viêm [25], chống xơ hóa [43], ức chế tăng trưởng của các tế bào ungthư bach cầu U937 [pete], điều hòa miễn dich [27], cải thiện bài tiết Insulin

18), tăng cường chức năng gan [43], than (20), phéi [59].

Do có cOngdiung tt nên nha cầu sử dụng ĐTHT ngày cảng tăng cao,trong khi đó nguén cung cắp tử tự nhiên mỗi năm chỉ đáp ứng được một phannhỏ nhu cầu thị trường, Bên cạnh đó, hoạt động khai thác quá mức có thékhiến loài nắm này có nguy cơ bị tuyệt chúng Trước tinh hình đó, các nhaĐTHT trên môikhoa học trên thế giới như đã tiến hành nghiên cứu nui

trường nhân (ạo Trong các loài thuộc chỉ Cordyceps, Cordyceps sinensis và

ụ nhiều hơn cả

Cordyceps miliiaris là hai loài phổ biển và được nghiê

Các hướng nghiên cứu hiện nay chủ yếu theo ba con đường: Một là ĐTHTđược nuôi trên ký chủ côn trùng, mặc dit sản lượng đã được cải thisong

vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chỉ phí sản xuất vẫn còncao Hai là, nuôi cấy ĐTHT trên môi trường dịch lỏng với mục tiêu là nang

tách chiết thu hồi hoạt chad

chất, đồng thời vic còn phức tạp và giá thành.cao, Hướng thứ ba là nuôi trên giá thé rắn nhân tạo, đây là một hướng di đầytiém năng do: Việc thu hoạch quả thể nắm trên giá thể nhân tạo không những.có thé thu hoạch được hoạt chất sinh học von quý trong nắm mà còn có thêmcác acid amin và các vitamin thiết yếu khác Bên cạnh đó, nguồn cơ chất nhân.tạo còn lại có thể tận dung phục vụ cho công tắc chăn nuôi.

Việt Nam, cho đến nay mặc dù đã có nhiều cơ sở và đơn vị nhân.nuôi thành công nắm Đông trùng hạ (hảo, tuy nhiên nuôi trồng Đông trùng hạthảo trên môi trường nhân tạo gặp phải những khó khăn: nắm C militaris có

tính thoái hóa cao nên việc sản xuất nắm không 6n định, hoặc ở một vai nơimặc dit nuôi trồng thành công nhưng him lượng hoạt chất sinh học khôngcao Xuất phát từ những thực tế trên, tôi tiến hành thực hiện dé tài: “Nghiêncứu quy trình nuôi trồng loài Cordyeps militaris có hàm lượng

Cordycepin cao trên giá thé nhân tạo thể rắn”.

Chương 1

TONG QUAN VAN DE NGHIÊN CUU1,1 Tong quan về Đông trùng hạ thảo.

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại.

Đông trùng Ha thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng,những loài nắm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh.phan thuộc chỉ Thitarodes Tên gọi chúng xuất phát từ quan sát thực tế: vàomùa đông bào tử nắm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng),đến mùa hè quả thể nắm mọc chỗi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông,giống một loại thực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông tring hạ thảo |8]

Hình 0.1: Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

DTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyê:của Nepal, An Độ, Trung Quốc và Bhutan, trung bình các cao nguyên này.có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt nước biển [5] Dựa trên đặcđiểm hình thai cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảođược xếp vào:

Gist: Fungi

Ngành : SordariomycetesBO: HypocrealesHo: CodycipitaceaeChỉ :Cordyceps

Lodi: militaris/sinensis/

ilitaris có giá trị được liệu tốt với con người

1.12 Sự phân bồ của nắm Đông Trùng hạ thảo trong tự nhiên

Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chiCordyceps phụ thuộc vào nhiệt độ, độ âm và ánh sáng của môi trường Chúngthường phân bố ở ving núi có độ cao từ 2000-3000m so với mực nước biển.Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về thông tin di truyền, các.loài nấm thuộc họ này bao gồm các chỉ chủ yếu là: Cordyceps,

Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps [47] Nắm Đông trùng

hạ thảo dùng để sản xuất dược liệu được xác định gồm hơn 680 loài khác

hơn 60 loài [43]

“Trong công bố của các nhà khoa học Hàn Quốc, 25 loài nắm thuộc chỉCordyceps phan bỗ ở Hàn Quốc được mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnhbao gồm: C adaesanensis, C agriota Kawamura, C bifisispora, C.nhau, chi riêng Trung Quốc đã tim t

crassispora, C discoideocapiata, © formicarum, C gemiculata, C gracilis,© heteropoda, C ishikariensis,-C kyushuensis, C martialis, C militaris, C.nutans, C ochracéostromata, C ophioglossoides, C oxycephala, C.

pentatoni, C,-pruinosa, C rosea, C scarabacicola, C sinensis, C.

sphecocephala, C tricentri, C yongmoonensis [53] Và theo một số nghiêncứu cho thấy, các loài của chỉ nắm Cordyceps còn được tìm thấy ở Thái Lan,Nhật Bản và Việt Nam [1] (28) Như vậy, có thể thấy thành phần loài nắm.

Đông trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và

nhiều loài có phạm vi phân bé rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữucho từng vùng.

1.1.3 Câu tạo hình thái của một số loài nắm thuộc chi Cordyceps

“Trong tự nhiên, nắm Cordyceps để hoàn thành chu kỳ sinh trưởng củamình chúng phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển phức tạp, từ giai đoạn

ig trong đất tới sau khi lây nhiễm vào cơ thể ấu trùng, chúng chịu sự cạnhtranh với các vi khuẩn khác, thậm chí cạnh tranh với các loài trong chỉCordyceps.

“Trong tự nhiên,côn tring do chúng ký s

Loài Âu trùng | Qua thé

Phin cơ thé ấu trùng giống nit Quả thé hình tra manh, 4-7camensig | ng tắm có chiên di 35 em chiễu đã và khoảng 3

cơm đường in ừ Y8 mm, |, với nh nhọn‘ing độn 6 vàng nâu

Song plea sesf [Ba tà SLT

con tim mice đi 2 Ẽ,- lũ dường kh, với phầm

€ gracilis | em và đường kính 2 — 5 mm; ig kính, với pl‘mau vàng nâủ›tím, nâu Roặc nâu | Phình ra ở đình, có hình

mà ồ cậy Qn tế bản khôn

Cad rằng cong inh,

€ bamesii án, 1,5-2 cm chiêu dai, đầu.

nhỏ Xi một cp âm Khong? mm đườn

Co thé âu trùng giống con tim, | Quả thể dang sợi, phânc day, chiều dai 3-6 em, đường nhánh hoặc không phânliangshanensi kính 6-10 mm; Bẻ mặt bên nhánh, 10-30 em chiều đài

` ngoài với mau nâu để màng màu | và đường kính 1-2 mm.

im Đông trùng hạ thảo được coi là ni

“wchế xâm nhiễm vào ký chủ của nam Đông trùng hạ thao

n gây bệnh choih trên cơ thể ấu trùng hoặc côn trùng đã trưởngthành Các loài thuộc chỉ Cordyceps khác nhau lây nhiễm ở giai đoạn nhộng

ic ký chủ khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thé ký chủ Vào cuối thu hoặc

ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase,chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và Xâm nhập vào bên trongcot

sự phát tán bào tử một cách tối đa Sau đó các bào tử bắt đầu hình thành hệMột vài loài Cordyceps còn có khả năng tác động tới hành vi vật chủ,chúng phai leo lên cây và gắn mình vào đó trước khi chết để đảm bảosợi, hệ sợi nắm hút đinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ gây chết ký chủ Khithời tiết ấm áp hơn, hệ sợi nắm bắt đầu phát triển một cách mạnh mẽ hình.

thành quả thé và chỗi lên khỏitần bào tử.

Hình 0.2: Vòng đời sinh trưởng của nắm Đông trùng hạ thảo

(Nguồn: internet)

1.1.5 Nim Đông trùng hq thảo Cordyceps miliaris

“Trong cây phân loại loài, Đông tring hạ thảo Cordyceps miliaris đượcxem là loài có đặc điểm tiến hóa nhất chỉ Cordyceps do có phô ki chủ rộng.Chúng có thé kí sinh trên cả sâu non, nhộng hoặc cá thể trưởng thành của mộtsố loại côn trùng Cordyceps militaris có khả năng sinh sản vô tính, sau khiphát uthành thục có thể hình thành các nang bào tử; bên trong các nang bào,

tử là tập hợp các bào tử đơn và phát tán vào trong không khí Các bảo tử nàytrong điều kiện thích hợp sẽ nảy chdi tạo thành các sợi nắm sơ cấp Các sợinắm sơ cấp một mặt không ngừng phát tr tạo hệ sợi thứ cấp, một mặt tiếp.tục xâm nhập vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh đưỡng trong cơ thể côntrùng Kết thúc giai đoạn sinh trường, các hệsợi thứ cấp được iên kết với nhautạo thành một khối thống nhất gọi là quả thẻ nấm Quả thé nam có màu vàng.cam hoặc cam hồng dai khoảng từ 2 - 8 cm Quả thê n tigp tục phát triểnđến giai đoạn thành thục và phát tán bào tứ bắt đầu chu kì sinh trưởng và pháttriển mới.

So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng đễ hơn trongtrường nhân tạo Gin day, Cordyceps militaris ngày càng được xem như.là một nguồn thay thé cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh.học và tính chat dược liệu tương tự nhau Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng.đã chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều loại thành phần có hoạttính sinh học như Cordycepin, Ergosterol, Mannitol và Polysaccharides.

12 Gi dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris1.2.1 Giá trị được liệu

a Theo y học cỗ truyền

Nam Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của.Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y Theo y học cổ truyền của‘Trung Quốc, nắm Đông tring hạ thảo được dùng để điều trị thành công cácchứng rối loạn lipit mau, viêm phế quản mạn, hen phế quan, viêm thận mạntính, sly thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B

mạn tính, ting thư phổi va thiểu nang sinh đục.

Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh đượcnhững công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đãsử dụng do các hoạt chất sinh học quý trong quả thé nắm: Cordycepin (3`-deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nắm, kháng u, hoạt động.

tiểu, chống các chứng ho ra máu [39] và nhiều loại vitamin khác.b Theo y học hiện đại

Đã có những nghĩ ấtcócứu phân tích được một số thành phần có hoạt cl

trong nấm Đông trùng hạ thảo như Cordycepin (3-deoxyadenosine),Ergothioneine, Ergosterol, D-mannitol,

aminobutyric acid (GABA), vàaccharides Do có nhiễu hoạt tính hữu ích nên đã được sử dụng chonhiều mục đích y học [42] Đến nay, hơn 10 nucleoside và các thành phần liênquan của nó (bao gồm adenine, adenosine, cytidine, cytosine, guanine,

guanosine, uracil, uridi„ hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, 2`deoxyuridine, 2°-deoxyadenosine, cordycepin N6-methyladenosine, và 6-hydroxyethyl-adenosine) đã được xác định và tách chiết [15]

Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị được liệu

Cordycepin (3-deoxyadenosine)

Cordycepin là thành phần hoạt chất chính có trong qua thé Cordycepsmilitaris, cô hàm lượng cao gắp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%)I25], được phát hiện lần đầu tiên từ Cordyceps militaris và sau đó tìm thấy có.mặt trong Cordyceps sinensis (19] và Cordyceps kyushuensis [40]

Vé tác dụng tị liệu của Cordycepin, một nghiên cứu mới đây tai Đại học vềCordycepin trong Đông trùng Ha thảo cho thấy Cordycepin có hai tác dụngtrên tế bào: (1) Ở liễu thấp, Cordycepin ức chế tăng trưởng không kiểm soátvà phân hóa 48 bao; (2) 6 liều cao Cordycepin chặn đứng tế bào không chodi h chặt với nhau nên sẽ ức chế tăng trường Cả hai tác dụng này có lẽ cùngdưới một eo chế là Cordycepin can thi sự tổng hợp protein của tế bào.

thấp, Cordycepin can thiệp vào sản xuất ribonucleic acid messenger vàở liễu cao, Cordycepin tác dụng trực tiếp lên sự sản xuất protein, các nhà khoa.học cho rằng Đông trùng hạ thảo có tác dụng mạnh trong việc chống ung thư.Các nghiên cứu của một số nhà khoa học khác cho rằng, Cordycepin khi di

vào bên trong tế bao sẽ được chuyển hóa thành mono, di, hoặc tri-phosphatetác dụng ức chế các enzyme tổng hợp purine [32] Bên cạnh đó, nghiêncứu cũng cho thấy Cordycepin có tác dụng kích hoạt sự kết thúc quá trìnhtổng hợp DNA hoặc RNA bên trong tế bào [41].

chế chống ung thư quan trọng nhất của nắm ĐTHT là hoạt hóa lạicquá trình apoptosis (tế bào tự chét) của các tế bảo ung thư Trong một nghiêncứu của Park và cộng sự (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sựtăng trưởng tế bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dang hình tháicủa tế bao hoặc làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình.tự chết của tế bào) [44] Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng ức.chế ting trường và gây ra sự chế tế bào của Nude chiết nấm Cordycepsmilitaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594 [34].

Ngoài ra, Cordycepin cũng được ứng dụng vào lĩnh vực chăm sóc sứckhỏe và lâm đẹp thông qua các chế phẩm thực phẩm chức năng bảo vệ sức.khỏe từ đồng tring hạ thảo.

Adenosine (CoHs:NsO.)

Nucleotides (bao gồm Adenosine, Uridine, Cytidine, Uracil vàGuanosine) là các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris [36]Adenosine có nhiễu tác dụng được lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính và

ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương Cac

bệnh khác nhau.nucleosides khác cũng có thể được sử dụng đẻ điều trị nỉ

Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ than kinh kích.thích Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy ring Adenosine là một bộ điều.biển có tác dụng ức el é va tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó bao

gôm quy định của giấc ngủ và mức độ hưng phan, rồi loạn thin kinh, quy.định về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động củaethanol và chất gây nghiện Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính củaphân nhóm của các thụ thể Adenosine trong mạch máu, cũng như ảnh hưởng.của các thụ thể Adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên, Năm 2005, Carlezonvà công sự nhận thấy rằng Cytidine có tác dung chống trim cảm ống như.trong các thử nghiệm boi ở chuột [10]

Cordycepic acid (D-mannitol): C6H Os

Cordycepic acid, một chất đồng phân của axit quinic, là một trongnhững thành phin dược phẩm chính hoạt động Cordycepic acid đã được xácđịnh là D-mannitol Mannitol là một chế phẩm sinh học với hoạt động sinhhọc quan trọng Hàm lượng của Mannitol trong loài Cordyceps thay đổi theomôi trường sống Nghiên cứu cho thấy, có khoảng 25-80 mg/g ở trong quả thénắm [41].

Một số Polysaccharides và đường khác đã được xác định có trong chiếtxuất Cordyceps militaris và các hoạt động dược lý của chúng đã được nghiêncứu, Những Polysaccharides có hiệu quả trong việc điều chinh lượng đườngtrong Maiti, Rgăn ngừa di căn, chống ung thư cũng như bảo vệ gan và tác dụng.hạ huyết áp [33] [58].

Ergosterol (CHO)

Ergosterol là sterol duy nhất có trong nắm và là một tiền chất quan trọng củavitamin D2, nó có giá trị chữa bệnh quan trọng [45].

Lovastatin

Lovastatin, một trong những chất chuyển hóa thứ cap trước đây tìmthấy ở các loài nắm mốc thuộc chỉ, là một 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol va đã đượcchứng minh là có hiệu quả chống viêm, chống oxy hóa, và tínhnh xơ

profibrinolytic và để ngăn chặn hội chứng mạch vành cấp tính và

vữa động mạch [I0].GABA

GABA là một trong những el Khẩu lỀnh ức chế trong hệthống thần kinh trung ương và ức chế dẫn truyén thần kinh giao cảm ngoạibiên Một vai trò quan trọng đổi với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần.

kinh trung ương và ngoại vi đến huyết áp đã được chứng minh [51].

GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần kinh.chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng [11].

‘hau như chỉ được sản xuất bởi nắm và mội

nhiên, Ergothioneine nh vậtnhân sơ [13| Ergothioneine chỉ có thé được hap thụ từ chế độ ăn uống vàkhông thể tự sinh tong hợp được ở người.

1.2.2, Giá trị định dưỡng

Bên cạnh các giá tị được liệu đã được y học hiện đại chứng minh, cáphân tích dịch chiết nắm Đông trùng ha thảo cũng cho thấy trong thành phancủa nắm có nhiều acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố.

khoáng (Se, Zn, Cu )

Tác giả Hyun Hur 2008 cũng công bố một số kết quả nghiên cứu về thànhphần hóa học của nắm DTHT Cordyceps militaris như sau [30]:

Bảng 0.2: Thành phần dinh dưỡng nắm Cordyceps milifari

Thành phần Hàm are

Quả thể Hệ sợi‘Amino acid (ng/g) 69432 1403

Tinoleie 613 33.0

Adenosine (%) | 0418 0,06

Cordycepin (%) 097 0,36

đó là giống nắm và cơ chất có nguồn Cacbon, Nito Trong đó, giếng nắm làyếu tố quyết định đến sản lượng và chất lượng của nắm làm ra Một giống.khỏe mạnh sẽ sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau

và có khả năng hình thành quả thé tốt Mỗi giống lại cổ một khoảng thời giansử dụng nhất định, vượt qua ngưỡng thời gian này sức sinh trưởng của nắm ségiảm, giống bị suy thoái Một số dấu hiệu của giống thoái hóa bao gồm: giảm.tỷ lệ sinh trưởng, mật độ hệ sợi thấp, năng suất thấp hoặc hình thái quả thể bịbiến dang Các chủng thoái hóa có hoạt tinh dehydrogenase giảm, quả thểsắc tố Bản chất của thoái hóa giống ở các chủng DTHT nóiloại nắm khác nói chung là do đột biết DNA [38] Càng nuôiDNA càng lớn dẫn đến các tìnhtrồng qua nhiều thế hệ thi th số đột

trạng thoái hóa càng cao.

Một trong những nguyên nhân di nh trạng thoái hóa giống là dophương pháp phân lập, Hiện nay có 3 phương pháp phân lập được sử dụngrông rãi là: phân lập mô tế vào, phân lập đơn bào tir và phân lập bào tir phức.Giếng được tạo ra bằng phương pháp phân lập mô tế bào hoặc bào tử phức cóthời gian thoái hóa nhanh hơn, có thé sau 1, 2 lần cay chuyền [46] Để hạn chế

quá trình thoái b6a giống, người ta sử dụng các chủng phân lập từ đơn bảo tử.Ngoài ra, vật liệu nuôi trồng giống cũng có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và

cơ chit Có 2 loại giống được sử dụng trong nuôiáL triển của nam

trồng Đông trùng ha thảo Cordyceps militaris là giống dang rắn và giống dich

thể Cho đến nay, việc sử dụng giống dạng dịch thể là công cụ mang lại hiệu‘qua cao nhất [46] Giống nắm trên cơ chất rắn có xu hướng chuyển sang màu.

vàng và có tốc độ lan hệ sợi chậm hơn, thời gian cảm ứng hình thành qua thécũng lâu hơn.

1.3.2 Yếu tổ dinh dưỡng.

1.3.2.1 Nguén dinh dưỡng Cacbon

Nắm ĐTHT cần một lượng lớn Cacbon trong quả trình sinh trưởng pháttriển Nguồn cacbon cung cấp vật chất cho quá trình sinh trưởng, tổng hợphop chuyển hóa năng lượng cho các hoạt động của tế bảo, Ham lượng Cacbonchiếm khoảng 50% trọng lượng khô quả thể nấm Nguồn Cacbon thích hợp.cho nắm phát triển gồm các Monosacharide và Polysacharide Nắm có sự.khác biệt rất lớn trong việc sử dụng các nguồn Cacbon khác nhau.

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn Cacbon có thể sử dụng dénuôi trồng nắm DTHT là các loại đường tỉnh bột trong đó thích hợp nhất là

những loại có cấu trúc phân fir nhỏ [49].1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng Nito.

Nito là nguyên tố bắt buộc để tông hợp acid nucleic và protein cấu trúc.nên tế bào Dinh dưỡng ni tơ có thê được lấy từ nguồn Nito hữu cơ tự nhiên,nguồn Nito tổng hop, nguồn Nito vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni.‘Theo Gao và cộng sự cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượngNito tương đối thấp Nếu ham lượng Nito quá nhiều trong môi trường sẽ làm.

chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể [24]

1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng.

Một số muối khoáng như K*, Mg?* và Ca? ở nồng độ 0,1 g/lít có thélàm tăng năng suất quả thể Một vài nguyên tố có thé làm tăng hoạt chất sinh.học của Cozdycepx militaris (21.

1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy1.3.3.1.Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh tới quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợpcác chất trong đông trùng hạ thảo Nhiệt độ mỗi giai đoạn sinh trưởng và phát

1.3.3.3.D6 âm

Độ âm va độ thoáng khí ảnh hưởng rất nhiễu tới quá trình phát triển củaquả thé nim đông trùng hạ thảo Độ thoáng khí tốt giúp kích thích su sinhtrưởng của tơ nắm va sinh khối nấm Biên độ giao động của độ ẩm tối ưu.trong nuôi trồng đông trùng hạ thảo là 75-90% tùy giai đoạn Độ ẩm thắp làm.lốc độ phái triển sinh khối giảm, chậm lại Độ ẩm cao kích thích nắm pháttriển nhanh, mạnh mé Độ thoáng khí tốt giúp quả thé nắm phát triển đồngđều nhau [29],

1.4 Tình hình nghiên cứu Đông trùng hạ thảo1.4.1 Trong nước

6 nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới dat

được một số kết quả Việc nghiên cứu mang tính chất điều tra, phát hiện, thuthập và bước đầu phân lập chúng trong điều kiện Việt Nam.

Nghiên cứu vễ thành phan loài: Năm 1996, Tác giả Trịnh Tam Kiệt đã nêudanh mục các loài nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họClavicipitaceae có 3 loài thuộc chỉ Cordyceps đó là Cordyceps manialisSpeg., Cordyceps sinensis và loài Cordyceps sobolifera Các tác giả đã ghỉ

nhận nắm Đông trùng hạ thảo có phan

Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn,Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh,Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận,

‘Tay Ninh [8],

Nam 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Vi

Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nắm DTHT (Cordyceps nutans) tạikhu bảo tổn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tác gia Phạm Quang Thu.đã thông báo phát hiện được loài nim DTHT và được giám định là loàiNam và trường Đại học

Cordyceps nutans, Đây là loài nắm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phânbố tại Việt Nam [5].

Tai vườn Quốc gia Tam Đảo, tinh Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát hiệnnắm DTHT Cordyceps gunnii |6].

‘Tai vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nắm BTHTCordyceps militaris |6]-

Nam Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở ViệtNam Loài nắm này phân bổ ở rừng tự nhiên có độ cao tir 1.900 m đến 2.100m so với mực nấÖÈ iển Ký cú của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẫyLepidoptera, nắm dài 2 — 6.5 cm, hình chuy, phần thân và cuống nhỏ, phanđầu( phan sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm Màu sắc của phancuống nắm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nắm nhẫn có màu da camnhạt, phần sinh sản có mâu da cam đậm va nhiều mụn nhỏ Thể quả dang chai

được cắm rất lồng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nắm ở phần sinh

san, Túi bào từ có kích thước 300 ~ 510 um x 3,5 ~ Sm, phần mũ gắn trên

ti thé quả có kích thước 3,5 ~ 5 wm [6]

Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tim kiếm và nghiêncứu nắm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bổ ở những khurừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m.

Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung,Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordycepsmiliarris PGS.TS Phạm Thị Thuy, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trìph

triển nắm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho.người Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nắm Đông trùng hạthảo đó là

Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc.Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh.

Cordycep spl & Sơn Động, Bắc Giang.

Tic giả cũng đã xác định được một số giá trị được liệu của nắm Đôngtrùng hạ thảo Cordyceps miliamis'gồm chất:Cordycepin, HEAA, một sốvitamin và một số nguyên tổ vi lượng [7].

Nam 2015, tác gia Lê Văn Vẻ đã nêu sơ bộ về môi trường nhân giống,kỹ thuật nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nắm Cordycepsmilitaris, giống nhập nội ở Trung Quốc |3].

Pham Quang Thu (2009) đã thử nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể

nhân tạo chủng nắm CMI loài Cordyceps militaris, chủng giống đang nuôitrồng với quy mồ công nghiệp tại Quảng Châu, Trung Quốc Kết quả đã thụđược thé quả nấm phát triển bình thường trên giá thé [7].

Nam 2015, Trung tâm Công Nghệ Sinh học - Viện Di truyền Nôngnghiệp công bố bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng Nhộng trùng thảo.( Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho biết loạisao Lift có thé sử dụng làm cơ chất nền phù hợp trong môi trường nuôi trồngnhợnệ tÌỂhg ThoŠ với năng suốt sinh học cao nhất [3]

Để làm chủ công nghệ sản xuất và cung cấp sản phẩm chất lượng caođến tay người dân trong tỉnh, từ năm 2017 đến năm 2019 Viện Nông nghiệpThanh Hóa đã tiếp nhận chuyển giao các quy trình công nghệ sản xuất giống.và nuôi trồng nắm Đông tring hạ thảo (Cordyceps Militaris L.ex), đầu tu xây

dựng cơ sở vật chất, máy móc, thiết bị hiện đại, phù hợp với yêu edu côngnghệ như: nhà xưởng sản xuất, phòng ươm sáng, ươm tối, hệ thống nhà lạnhiy Kết quả ứng dụng công.nuôi trồng, đèn chiếu sáng công nghệ cao, máy s

lo sản xuất thử nghiệm đã đạt được 2500 ống giống

tổng hợp có thé dé đàng mua bán, do vay càng ngày càng nhiễu cúc công ty

mỡ rộng sản xuất, quy tình khép Âđñitỗi ưu, ác nghiên cứu chuyên siu vềsản xuất Đông trùng hạ thảo được ghi nhận.

Trén đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu Đông trùng hạthảo Cordyceps militaris ở Việt Nam Qua các nghiên cứu trên cho thấy việctiếp tục nghiên cứu và di sâu hơn vào kỹ thuật trồng loài nắm này để cung cấp.nguyên liệu cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng là hoàn toàn cần thiếttại Việt Nam Đáp ứng nhu cầu bảo vệ sức khỏe con người

1.4.2 Thế giới

Nuôi trồng thé quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris đượctiến hành ở nhiều nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản vàMỹ Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở.các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ

tính một trang trại nuôi trồng loài nim này tại Kaiping, Quảng Châu, sản

lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm Đông tring ha

thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thể giới kể cả cácnước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và ngườinuôi trồng nắm Tại Thái Lan, Wongsa P và cs (2005) đã nghiên cứu phân lậpvà sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành bào tử chéi của nắm Cordyceps ký

sinh kiến Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone YeastExtract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA(Malt Extract Agar) được dùng dé phân lập và nuôi cấy hệ sợi [57].

Jae Sung Kim và đồng tác gia (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộngtằm để mui trồng thé quả nắm Cordyceps miliaris Nhông tằm được đựng trongtrong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở 121°C trong thời gian 90 phút, để nguội, cấyim, 20 ngày sợi nắm ăn kin toàn bộ giá thé, trong điều kiện nhiệt độ 20-25°C, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thé quả Nuôi cấythu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh.lành phần như sau; 40 g/lt đường Glucose, 10 g/lit Cao nắm

K,HPO,:3H,0, và 0,5 gilit MgSO,.7H,0 [32].đường long với

KH,PO,, 0,5 gilmen, 0,5 g/

Hai loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris được tập trung nghiên cứunuôi lấy sinh khối hệ sợi nhiều nhất Duck-Hyun Cho và đồng tác giả (2003),tại Hàn Quốc, đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủngký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 của loài Cordyceps militaristrên môi trường dinh đường và quá trình hình thành thể quả nắm Cordycepsmilitaris với giá thê là sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus Kết quả

sự sinh trưởng của hệ

nuôi cấy thuần khiết Chỉ có 2 chủng CHO-7208 và CHO-7846 hình thành thể

ñ của các chủng khác nhau là khác nhau trong

‘qua khí sử dung sâu non Ailomyrina dichotoma Linnaeus làm giá thé Chiều dicủa thé quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy [46].

“Tại thành phd Hayward, bang California, Mỹ, Công ty côi 1g nghệ sinh

học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordycepsmiliaris Sản phẩm được tiêu thụ trong nước và thi trường quốc tế

Năm 2016, Nurmila Sari và cộng sự đã nghiên cứu cải thiện sản xuấty

từ chủng hoang đã Trong nghiéi

Cordycepin trong nuôi nat lỏng của nắm Cordyceps militaris phân lập

sản xuất và năng suất của

cứu nay, vi

Cordycepin đã được cải thiện đáng kể ở loại hoang đã Cordyceps militarisbằng cách phân lập tế bào duy nhất và các chat phụ gia mà không áp dụng bắtkỳ công nghệ đột biến nào Ching Cordyceps militaris NBRC 10352-3 này cóthể được sử dụng như một chủng siêu sản xuất cordycepin mới, thay vì đột

biến Cordycepin-hyperproducing [43]

Si Young Ha và cộng sự (2021) đã nghiên cứu tác dụng của min cưathông (Pinus densiflora) đối với sản lượng Cordycepin từ nấm thuốcCordyceps militaris trong nuôi cấy ngập nước Kết quả đã chứng minh tácdụng của min cưa cây khác nhau đối với quá trình sinh tong hợp củacordycepin dưới dạng các chất hoạt tính sinh học và việc thay thé môi trường.truyền thống (môi trường SDB) bằng min cưa thông được xử lý trước 1%NaOH có thé làm tăng năng suất của cordycepin Sau khi tối ưu hóa sản xuấtcordycepin từ Cordyceps militaris được tring trong môi trường chứa 1% mincưa thông được xử lý trước NaOH sử đụng RSM (phương pháp bề mặt đápứng) BBD (thiết kế Box-Behnken) ở dạng chuẩn, sự kết hợp tối tru là: kíchthước hạt, 113,7 lưới; trọng lượng đầu vào, 11,9 g /lít; và thời gian ú, 67,8.giờ Mô hình dự đoán năng suất tối đa là 922,6 wg /ml đối với đông tringhạ thảo [54].

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VAT LIEUVA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

= Xác định được các điều kiện nuôi trồng tối wu chó sinh trưởng của C.miliaris đạt him lượng Cordycepin tối thiêu 5 mg/g khô

~ Xác định được phương pháp tối ưu sấy quả thé C militaris đảm bảođược mẫu sắc, hương vị nắm và giữ được ham lượng Cordycepin cao.

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu giá thể và quy trình nuôi trồng nắm C.

-_ Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn muối khoáng đến sinh trưởng, phát

triển của C miliiaris

= Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi trồng: Nhiệtđộ, độ âm, ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của C militairs

Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật sấy khô quả thể nắm € militaris2.3, Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu.

Hai chúng giống Cordyceps militaris được cung cấp bởi công ty TNHH

VGI và VG2.thảo dược Vũ Gia được ký hiệu.

Các thiết bị: Tủ cấy vô trùng, máy lắc, nồi hap, máy xay, tủ

Dung cụ: Bình trụ, ống nghiệm, que cấy, xi lanh, túi nilon bịt miệng,

bình, đèn cồn, panh kéo, bông sạch, dao,

Hóa chit: Đường Glucose, Sacarose, Maltose, Cao niMgSO,7H:O, KH;PO,, NaOH, Agar,

Các nguyên liệu khác: Gao lứt, nhộng tim tươi,2.3.2 Địa điểm nghiên cứu.

Nghiên cứu này được thực hiện tại Công ty TNHH thảo được Vũ Gia“Thời gian nghiên cứu: 10/2021-10/2022

men, Pepton,

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu.

2.3.3.1 Phương pháp nhân giống cấp 1Chuẩn bị mí

Bé sung Pepton, Cao nắm men, Glucose, mudi Kali, muối Magie và

Agar theo tỷ lệ 10 g/lít Dịch môi trường dé vào Bình ống nghiệm thủy tỉnh.chịu nhiệt 65 ml, mỗi bình chứa 10 ml dung dịch, đậy nắp và hấp khử trù ng ở

121°C trong 30 phút Sau khi hấp khử trùng, ông nghiệm được đặt nghiêng.

Bật đền UV và quạt gió cho đến khi môi trường đông thành dang thạch, vàbảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi được sử dụng.

Cay giống

Giống gốc Đông trùng hạ thảo được cấy chuyên bằng phương pháp datthạch Dùng dao cắt miếng thạch chứa hệ sợi nắm ở giống gốc, kích thước.miếng thạch 0,3 x 0;ã cm, đặt miếng thạch vào ống nghiệm chứa môi trườngdinh dưỡng đã chuẩn bị Ong giống được nuôi tối ở điều kiện 22°C trong 7ngày, sau đó chiếu sáng 12 h/ngày trong 3- 7 ngày.

Hình 2.1: Giống nắm Đông trùng ha thảo cấp 1 ở môi trường thạch nghiêng.

Hình 2.2: Giống nấm Đông trùng hạ thảo cấp 2 dang dịch thểCấy giống

in, dùng que cấy gạt đều trên bề mặtng tơ kích thước 0,5x1 em đượcSử dụng đĩa giống cấp 1 để cấy chuy

thạch để tách bào tử nắn ra khỏi hi

cho vào bì ig dịch thé đã chuẩnh thủy tỉnh chứa 350 ml môi trường dinh dưỡibị trước đó Cuối cin;ng cấp 2 được nuôi cấy ở tủ nuôi lắc tròn,

trong điều kiện nhiệt độ 22°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, trong 7 ngày.

2.3.3.3 Phương pháp nuôi trồng Đông tring hạ thảo trên môi trường giá thểnhân tạo thé rắn

Chuẩn bị môi trường đinh dưỡng

Cân chính xác 40 gram gạo list và 65 ml dung dịch dinh dưỡng vào trong hộp

nhựa chịu nhiệt 700 ml, thành phần dung dịch dinh dưỡng được thay đổi theo

kiện thí nghiệm Sau đó, dùng túi nilon PE buộc kín miệng hộp vàkiện 12 trong 30 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi

cấy giống.

Cay giống nắm Đông trùng hạ thảo vào giá thé

Dùng xi lanh tiệt tùng hút 7 mi giống từ bình giống cắp 2 phun’ đều lên bề

mặt môi trường giá thể nhân tạo, sau đó buộc kín miệng bình và nuôi ở điềukiện 22°C, không chiếu sáng từ 3-7 ngày tùy chủng giống.

Phuong pháp nuôi trồng tạo quả thé Đông tring ha thio

Các bình môi trường giá thé nhân tạo sau khi được cấy giống, được nuôi.trồng ở điều kiện 22°C, không chiếu sáng trong 3 ~7 ngày dé phát sinh hệ soi.

n có hệ sợi pl

môi trường chiếu sáng liên tục (500 lux) ở 21°C, độ dim 85 % để tạo quả thé.Sau dé, các bình n ít triển bông kín bề mặt được chuyển sang2.3.3.4 Phương pháp xác định ham lượng Cordycepin

Qua thé nắm Đông tring hạ thảo được thu và sấy khô bằng các phương.pháp sấy khác nhau: sấy lạnh, sấy nhiệt và sấy thăng hoa.

Mẫu vật được xét nghiệm hàm lượng được chất Cordycepin theo phương

pháp HPLC.

2.3.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Bảng 2.1: Công thức đối chứng CTO trên giá thể nhân tạo thể rắn

của nghiên cứu.

Las 65 ml Dung dich | — tim

a Cay CTÔI dinh dưỡng Cacton 63 |

( dinh dưỡng cung |—_ sungcấp và nước) Nho bộ sung

Muỗi khoán; 9

Bảng 2.2: Điều kiện môi trường nuôi cấy Đông trùng hạ thảo đối chứng.

Yếu tổ môi trường |_ Nhiệt độ : Độ âm (%)

Điều kiện nuôi trồng 2Is€ 500 80

* Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của gid thé nẫm C militarisNghiên cứu ảnh hưởng của các loại gạo khác nhau dùng làm giá thể nuôitới khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm € militaris

Gao được nhiều nghiền cứu chứng minh là nguồn nguyên liệu làm giá.thể nuôi trồng đông trùng hạ thảo phù hợp nhất, dem lại năng suất cao hơn.

han các nguyên liệu khác như: ngõ, đỗ, lúa mì Bên cạnh đó nguồn gạo tại

Việt Nam rất nhiều và đa dạng vẻ hình thái, độ dinh dưỡng cũng như độ tơixốp Do vậy này tôi lựa chọn các loại gạo có đặc tính khác nhau dé nghiêncứu [28]

Bảng 2.3: Các loại gạo làm giá thể nuôi Đông trùng hạ thioLoại gạo Dic tính chín, xốp.

Gao Khang dan Xếp, nở

Gao Huyếtrồng Khô, xốp.

Gạo Nấp cảm Déo nhiều

Gao Bắc Thom Deo vừa

Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng Cacbon đến đến khả năng sinhtrưởng, phát triển và ham lượng Cordycepin của nắm C militaris.

Cacbon là dinh đưỡng ảnh hưởng xuyêntốt trình sinh trưởng của hệ sợinắm Đó là yếu tổ quan trọng quyết định tới sự sinh trưởng và chất lượng.

Bang 2.4: Khảo sát nguồn Cacbon bố sung đến sinh trướng, phát triển và.hàm lượng Cordycepin của nấm C militaris

"Tên công thức Loại cacbon Ham lượng (git)

lồi Glucose 20

œ Sacarose | 20

C3 Maltose | 20,

Cả Lactose 205 Fructose 20

Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng Nito đến đến khả năng sinhtrưởng, phát trién và hàm lượng Cordycepin của nắm C militaris

Cùng với Cacbon, Nito là nguồn dinh dưỡng không thẻ thiểu trong nhângiống nim Cordyceps militaris Nito đồng vai tro trong quá trình sinh tổnghợp các enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp của.nắm Hiện tại trên thé giới có nhiều cơ sở sử dụng nguồn Nito thiên nhiên vanguồn Nito tổng hợp để nuôi trồng đông trùng hạ thảo cho năng suất, hiệu quả.và dược tính khác nhau

Bang 2.5: Khảo sát nguồn Nito bỗ sung đến sinh trưởng, phát triển vàham lượng Cordycepin của nắm € militaris

én công thứ vi Ni Hàm lượng bé sung

"Tên công thức Loại Nito om

NI Bot nhộng tim 20Nà — Pepton thịt 20N3 Cao nam men 20

Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng mudi khoáng đến sinh trưởng, pháttriển và hàm lượng Cordycepin của nắm C militaris

Nguyên tố khoáng cũng đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của.

sợi tắm trong mỗi trường dịch thé Các nguyên tố khoáng có vai trò xúc tictổng hợp cho một vài loại enzyme cho quá trình sinh trưởng của sợi nắm.Nguyên tổ khoáng được khảo sát bao gồm KH;PO, và MgSO,.7H:O theo tylệ khác nhau:

Bang 2.6: Khảo sát nguồn muối khoáng bé sung đến h trưởng, phát

triển và hàm lượng Cordycepin của nắm €: militaris

ái Hàm lượng mui

Ten công thức | Tên muốikhoáng _ vu nee oniKI KH:PO, 1

"Nhiệt độ môi trường nuôi trồng: Dé kha ảnh hưởng của nhiệt

độ môi trường nuôi trồng nắm Đông trùng hạ thảo, tién hành nuôi trồng nắm.ở giai đoạn hình thành quả thé trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau:

Bảng 2.7: Khảo sát điều kiện nhiệt độ môi trường đến sinh trưởng, pháttriển và hàm lượng Cordycepin của nắm C militaris

“Tên công thức Nhiệt độ khảo sátTl 16°C

Cường độ chiếu sáng: Để khảo sát ảnh hưởng của cường độ chiếusáng nắm Đông trùng hạ thảo, tiến hành nuôi trồng nắm ở giai đoạn hình.thành quả thé trong các điều kiện ánh sáng khác nhau ( thời gian chiếu sáng

12 tiếng/ ngày).