Nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris trên ký chủ nhộng tằm sắn ở môi trường bán tự nhiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyceps militaris TRÊN KÝ CHỦ NHỘNG TẰM SẮN Ở MÔI TRƯỜNG BÁN TỰ NHIÊN” Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Minh Hằng Sinh viên thực : Bùi Thị Trang Mã sinh viên : 1653070178 Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, tháng năm 2021 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài nghiên cứu em hướng dẫn giúp đỡ nhiều thầy bạn bè để hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Minh Hằng- giảng viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp, trực tiếp hướng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời thắc mắc truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất thầy cô giáo, giảng viên cán nhân viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, giảng dạy, tạo điều kiện, hướng dẫn, bảo tận tình giúp em có lượng kiến thức định để hồn thành môn học đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình động viên, hậu phương vững giúp em có động lực học tập Cuối xin cảm ơn tất bạn bè bên cạnh, học tập giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Thị Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm “Đông trùng hạ thảo” 1.1.1 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng 1.1.3 Thành phần hoạt chất sinh học nấm đông trùng hạ thảo 1.1.4 Giá trị dược liệu nấm C militaris 1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 12 PHẦN II 15 ĐỐI TƯỢNG- MỤC TIÊU- NỘI DUNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 15 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 16 2.3 Địa điểm thời gian bố trí thí nghiệm 16 2.4 Nội dung nghiên cứu 16 2.4.1 Nội dung nghiên cứu phịng thí nghiệm 16 2.4.2 Nội dung nghiên cứu điều kiện tự nhiên 16 2.5 Phương pháp nghiên cứu 17 2.5.1 Phương pháp nhân giống cấp 17 2.5.2 Phương pháp nhân giống cấp – giống sản xuất 18 ii Thành phần môi trường lỏng nhân giống cấp 2, bao gồm: Pepton g/l, cao nấm men g/l Glucose 20 g/l, Dịch chiết khoai tây 100 g/l, MgSO4.7H2O g/l, KH2PO4 0,5 g/l, Vitamin B1 0,1 g/l; pH = 6,0 - 6,5 18 2.5.3 Phương pháp gây nhiễm nấm theo độ tuổi nhộng sắn 18 2.5.4 Phương pháp gây nhiễm nấm theo vị trí tiêm nhộng sắn 19 2.5.5 Phương pháp gây nhiễm nấm C.militaris theo thể tích dịch giống tiêm 19 2.5.6 Phương pháp xác định thời gian gây nhiễm nhộng giai đoạn tối đến khả bật mầm thể chuyển sang nuôi sáng tự nhiên 20 2.5.7 Phương pháp tạo độ ẩm giá thể cát đặt nhộng nuôi phát triển thể điều kiện tự nhiên 20 Tạo giá thể cát để nuôi trồng: Dùng hộp nhựa hình chữ nhật, kích thước dài x rộng x cao = 24 cm x 12 cm x 10 cm, bỏ lớp cát vàng khô với chiều dày khoảng cm, tạo ẩm cát cách tưới phun lên bề mặt cát với lượng nước khác nhau: 25 ml, 50 ml, 100 ml 150 ml, buộc túi bóng hấp vơ trùng nhiệt độ 121oC thời gian 20 phút Sau để nguội hoàn toàn trước đặt nhộng 20 Nhộng sau nuôi tối ngày, chọn nhộng cứng hoàn toàn đặt giá thể cát với mức độ tạo ẩm khác Sau chuyển ni điều kiện tự nhiên: nơi ẩm ướt, tán với độ tàn che >75%, nhiệt độ dao động trung bình ngày đêm 250C, thời vụ nuôi, đông xuân 21 Chỉ tiêu đánh giá: đánh giá tỷ lệ nhộng bật mầm thể thành công, số lượng thể, kích thước thể, màu sách thể 21 2.5.8 Các phương pháp thu thập xử lý số liệu 21 PHẦN III 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Gây nhiễm nấm vào ký chủ nhộng sắn 22 3.1.1 Ảnh hưởng tuổi nhộng sắn đến khả nhiễm nấm 22 3.2.2 Ảnh hưởng độ tạo ẩm giá thể cát đến phát triển thể nấm 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng tuổi nhộng sắn đến khả nhiễm nấm 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng vị trí tiêm nhộng đến khả nhiễm nấm 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung dich giống tiêm vào nhộng sắn đến khả nhiễm nấm 26 Bảng 3.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi tối sau gây nhiễm nấm đến khả nhộng bật mầm thể chiếu sáng tự nhiên 27 Bảng 3.5: Ảnh hưởng độ ẩm giá thể cát đến phát triển thể nấm 30 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái nấm Đơng trùng hạ thảo C militaris ký sinh nhộng tự nhiên (Nguồn: http://www.namduoclieu.com) Hình 1.2: Sự lây nhiễm nấm C sinensis sâu non (Nguồn: Internet) (1) Bướm để trứng, (2) Sâu non hình thành di truyển đất, (3) Sâu non bị nhiễm nấm ký sinh, (4) Nấm sinh trưởng, hút chất dinh dưỡng từ thân sâu phát triển thể nấm Hình 2.1: Tằm sắn nhộng sắn 15 Hình 3.1: Nhộng nhiễm nấm thành cơng 26 Hình 3.2 Nhộng sắn nhiễm nấm thành công đặt giá thể cát vàng 28 Hình 3.3 Nhộng sắn nhiễm nấm bật mầm thể sau 10 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên 28 Hình 3.4 Nhộng sắn nhiễm nấm bật thể sau 20 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên 28 Hình 3.5 Nhộng sắn nhiễm nấm bật thể công thức bổ sung 100 ml nước sau 40 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên 30 Hình 3.6 Hình thái, kích thước thể nấm Đơng trùng hạ thảo C militaris nuôi ký chủ nhộng sắn 31 Hình 3.7: Sản phẩm thu hoạch nấm Đơng trùng hạ thảo C militaris nuôi ký chủ nhộng sắn điều kiện bán tự nhiên 31 v ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm “Đơng trùng hạ thảo” thuộc chi Cordyceps lồi nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trưởng thành số lồi trùng, lớp nhện Vào mùa Đông nấm xâm nhiễm ký sinh vào thể côn trùng, phát triển hệ sợi làm cho côn trùng bị chết, đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí tăng cao, hệ sợi nấm phát triển thành thể nấm nhú lên khỏi mặt đất Vào mùa đơng nhìn cặp cá thể giống sâu (cơn trùng), đến mùa hè chúng giống lồi thực vật.Chính vậy, mà lồi nấm có tên gọi Đơng trùng hạ thảo, mùa đơng con, mùa hạ Đến nay, có 400 phân lồi nấm thuộc chi Cordyceps tìm thấy mơ tả, nhiên có khoảng 36 lồi nuôi trồng điều kiện nhân tạo cho phát triển thành thể (Wang, 1995; Sung, 1996) Trong số lồi này, có lồi Cordyceps militaris nghiên cứu nhiều nuôi trồng thành công quy mô lớn (Li et al, 2006) Trong chi Cordyceps có hai loài Cordyceps militaris Ophiocordyceps sinensis (hay Cordyceps sinensis) nghiên cứu nhiều ni trồng có hoạt chất sinh học quý (adenosine, cordycepin, v.v.) với giá tri šdược liệu cao Lồi nấm Đơng trùng hạ thảo C sinensis có phân bố hạn chế tự nhiên, chủ yếu vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao 4000 m so với mực nước biển vùng Tây Tạng (Trung Quốc), số vùng Nepan Butan; loài nấm chưa nuôi trồng thành công môi trường nhân tạo, sản lượng nấm thu khơng đáp ứng đủ nhu cầu thị trường, có giá thành cao Lồi Đơng trùng hạ thảo C militaris tìm thấy vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc nước khu vực Đơng Nam Á; lồi nấm C militaris có chứa hoạt chất sinh học tương tự loài nấm C sinensis, dễ dàng ni trồng mơi trường nhân tạo Hiện nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu quy trình ni trồng nấm C militarisis môi trường tổng hợp nhân tạo điều kiện phịng thí nghiệm chưa có cơng trình nghiên cứu ni trồng điều kiện tự nhiên Việc ni trồng trồng hồn tồn phịng thí nghiệm nhiệt độ lạnh, độ ẩm ánh sáng nhân tạo nên chí phí sản xuất cao làm tăng giá thành sản phẩm Với mục tiêu giảm chi phí sản xuất, tạo sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C militaris giống với tự nhiên đáp ứng nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu quy trình ni trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ký chủ nhộng tằm sắn môi trường bán tự nhiên” Kết đề tài góp cung cấp thêm sở khoa học thực tiễn cho việc sản xuất loài nấm quý PHẦN I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm “Đông trùng hạ thảo” Nấm “Đông trùng hạ thảo” thuộc chi Cordyceps loài nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trưởng thành số lồi trùng, lớp nhện Nấm đặt tên Đông trùng hạ thảo dựa vào trình phát sinh, phát triển vòng đời chúng Sâu non, nhộng, sâu trưởng thành số lồi trùng nằm đất mặt đất bị nấm ký sinh Các loài nấm sử dụng chất hữu thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết Vào mùa đông, nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi phát triển Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể Như vậy, mùa đơng nấm ký sinh sâu, tồn giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành nấm nên có tên gọi Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris loài nấm thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, šHypocreales, họ Cordycipitaceae, giống/chi Cordyceps Loài Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris Cordyceps chi đa dạng họ š Clavicipitaceae số lượng lồi phổ ký chủ Ước tính có 400 lồi chi phát mô tả (Mains, 1958; Kobayasi, 1982; Stensrud et al., 2005) Loài C militaris nấm ký sinh bướm sâu bướm, thể có màu cam, chiều dài - 10 cm Đầu thể nấm có đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng nhộng, măt cắt ngang thể có màu nhạt, rỗng Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rơng µm Các bào tử nang hình sợi, khơng màu phân đoan, kích thước 3,5 - x - 1,5 µm (Hình 1.1.) Các bào tử nang điều kiện nghèo dinh dưỡng đứt nảy chồi tạo bào tử thứ cấp Lồi Nấm có phân bố rộng Bắc Mỹ, châu Âu châu Á (Paul et al, 2008) Hình 1.1: Hình thái nấm Đông trùng hạ thảo C militaris ký sinh nhộng tự nhiên (Nguồn: http://www.namduoclieu.com) 1.1.1 Sự phân bố nấm Đơng trùng hạ thảo Chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác phát mơ tả, tính riêng Trung Quốc tìm thấy khoảng 60 loài Tuy nhiên, có lồi nấm Cordyceps sinensis Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với người nghiên cứu nhiều Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps thường tìm thấy vào mùa hè, lồi nấm C sinensis phân bố chủ yếu vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao 4000 m so với mực nước biển vùng Tây Tạng (Trung Quốc), số vùng Nepan Butan; loài nấm C militaris tìm thấy vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc nước khu vực Đông Nam Á (Wang, 1995) 1.1.2 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng Theo sách Bách khoa tồn thư lồi nấm thuộc chi Cordyceps lây nhiễm vào thể sâu hại đến chưa rõ nguyên nhân Những sâu ăn phải bào tử nấm chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ lỗ thở thể Đến sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào mô cáo In-Pyo Hong et al (2010), nghiên cứu nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo chủng C militaris Cmb233 ký chủ nhộng tằm dâu, cho thấy gây nhiễm nấm vào giai đoạn nhộng từ – ngày tuổi cho tỷ lệ nhiễm nấm thành công thấp từ 76 – 80%; nhộng từ - 11 ngày tuổi cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công cao (100%) Kết tỷ lệ nhiễm nấm vào nhộng thành cơng phụ thuộc vào độ tuổi nhộng Gây nhiễm nấm với thể nhộng non cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công thấp so với gây nhiễm nấm vào thể nhộng trưởng thành chín Điều này, giải thích: nhộng cịn non quan chưa phát triển hoàn thiện, đặc biệt lớp vỏ kitin bên mềm, màu trắng vàng (nhộng vận động yếu) nên tiên gây nhiễm nấm vào thể nhộng, nhộng bị chết trước 24h sau tiêm, lúc hệ sợi nấm chưa phát triển mạnh dẫn đến vi sinh vật đường ruột phát triển phân hủy thể nhộng, nhộng bị hỏng (thối) Ngược lại, nhông – 10 ngày tuổi, phát triển hoàn chỉnh, lớp vỏ kitin cứng, màu nâu đen (nhộng vận động khỏe); tiên gây nhiễm nấm vào thể nhộng, nhộng chết sau thời gian 24h tiêm nên cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công cao Sau khoảng 11 ngày đóng kén, nhộng biến thái thành bướm Vì vậy, chọn khoảng thời gian gây nhiễm nấm nhộng sắn phù hợp giai đoạn từ – 10 ngày tuổi Bảng 3.1 Ảnh hưởng tuổi nhộng sắn đến khả nhiễm nấm Tuổi nhộng sắn(a) (ngày) Số lượng nhộng sắn thí nghiệm (Con) 135 Số lượng nhộng sắn nhiễm nấm thành công(b) (Con) 65 Tỷ lệ nhiễm thành công (%) 48,15 125 83 66.40 132 102 77,27 128 117 91,41 10 145 132 91,03 23 (a) Tuổi nhộng tính từ ngày đóng kén hồn tồn (b) Nhộng nhiễm nấm thành công nhộng sau 12 ngày nuôi tối, thể cứng hoàn toàn, vỏ kitin bên có màu vàng nâu, cắt dọc nhộng có hệ sợi nấm ăn trắng phần khoang bụng 3.1.2 Ảnh hưởng vị trí tiêm đến khả nhiễm nấm Tiêm 75 µl dung dịch giống vào vị trí khác thể nhộng từ – 10 ngày tuổi (phần đầu, ngực, bụng của), sau chuyển ni tối hồn tồn điều kiện nhiệt độ trì 200C, độ ẩm 60% Sau 12 ngày nuôi tối, thống kê số liệu thu bảng 3.2 Kết thu cho thấy khơng có khác biệt rõ rệt vi trí tiêm nhộng, vị trí khác cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành cơng > 90% Ở vị trí tiêm vào phần đầu phần ngực nhộng cho kết thành công (>92%) cao không đáng kể so với tiêm vào phần bụng đôi nhộng (>90%) Khi tiêm chủng nấm C militaris Cmb233 vào vị trí đầu, ngực bụng nhộng, In-Pyo Hong et al (2010) thu kết nhiễm thành công cao vị trí tiêm (97,6 – 99,4%) Từ kết thu cho thấy, nhộng sắn vị trí tiêm khơng ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nhộng nhiễm thành công Bảng 3.2 Ảnh hưởng vị trí tiêm nhộng đến khả nhiễm nấm Vị trí tiêm Số lượng nhộng sắn thí nghiệm (Con) Số lượng nhộng sắn nhiễm nấm thành công (Con) Tỷ lệ nhộng nhiễm thành công (%) Đầu 127 117 92,13 Ngực 130 120 92,31 Bụng 132 121 91,67 Đuôi 138 125 90,58 24 3.1.3 Ảnh hưởng dung dịch giống đến khả nhiễm nấm Chúng tiến hành gấy nhiễm nấm vào nhộng sắn (9 – 10 ngày tuổi) với công thức dung dịch giống nấm tiêm khác nhau: 25 µl, 50 µl, 75 µl,100 µl, 150 µl vào thể nhộng sắn ni điều kiện tối hồn tồn nhiệt độ trì 200C, độ ẩm 60% Sau 12 ngày ni tối, thống kê số liệu thu trình bày bảng 3.3 Kết cho thấy tiêm lượng dịch giống 75 đến 100 µl tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành cơng cao (>90%), Ngược lại, với thể tích dung dịch giống tiêm 25, 50 150 µl cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công thấp (95%) 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung dich giống tiêm vào nhộng sắn đến khả nhiễm nấm Thể tích giống tiêm (µl) Số lượng nhộng sắn thí nghiệm (Con) Số lượng nhộng sắn nhiễm nấm thành công (Con) Tỷ lệ nhộng nhiễm thành công (%) 25 150 77 51,33 50 145 85 58,62 75 157 144 91,72 100 138 132 95,65 150 152 56 36,84 Hình 3.1: Nhộng nhiễm nấm thành công 3.2 Kết nghiên cứu thời gian ni tuối độ ẩm giá thể cát thích hợp cho giai đoạn ni sáng ngồi tự nhiên 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối giai đoạn gây nhiễm nấm đến khả bật mầm thể Nhộng sắn sau gây nhiễm nấm đem nuôi tối hồn tồn phịng ni từ đến 12 ngày với điều kiện nhiệt độ trì 200C, độ ẩm 60%; sau đó, chuyển sang giá thể cát nuôi sáng điều kiện tự nhiên (dưới tán rừng, nơi ẩm ướt, nhiệt độ trung bình giao động ngày đêm 18 – 250C, độ tàn che> 75%) Sau theo dõi hàng ngày thống kê số liệu, số liệu thu trình bày 26 bảng 3.4 Kết cho thấy, với thời gian nuôi tối khác ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian nhộng sắn bật mầm thể, số lượng nhộng sắn bật mầm thể Sau gây nhiễm nấm, nhộng sắn nuôi tối từ 7, ngày (nhộng cứng hoàn toàn) chuyển sang ni sáng tán rừng thời gian nhộng bật mầm thể sau 10 nuôi sáng Nhưng tỷ lệ nhộng bật mầm công thức nuôi tối ngày đạt 92,59 %; công thức nuôi tối từ đến ngày cho tỷ lệ nhộng bật mầm thể 100% Sau gây nhiễm nấm, nhộng nuôi tối đến ngày thứ 10 12 thời gian nhộng bật mầm thể dài so với ngày thứ - tỷ lệ nhộng bật mầm thể sau nuôi tối đến ngày thứ 12 thấp, đạt 76,69% Kết giải thích ngun nhân nuôi tối từ – ngày, hệ sợi nấm phát triển mạnh thể nhộng độ ẩm thân nhộng cịn cao, kích thước nhộng chưa bị teo (kích thước tương đương khoảng 90% so với nhộng sống) nên chuyển sang ni sáng việc nảy mầm thể nhanh Ngược lại, nuôi tối dài ngày > 10 ngày độ ẩm thể nhộng giảm mạnh, lớp vỏ kitin bên ngồi bị khơ cứng phịng ni bật điều hịa trì 200C, kích thước nhộng cịn < 75% so với nhộng cịn sống nên chuyển sang ni sáng nhộng bất mầm thể chậm tỷ lệ nảy mầm đạt thấp Bảng 3.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi tối sau gây nhiễm nấm đến khả nhộng bật mầm thể chiếu sáng tự nhiên Thời gian ( ngày ) Số lượng nhộng sắn thí nghiệm (Con) Thời gian bật nầm thể 10 12 135 140 130 125 133 10 10 10 14 16 27 Số lượng Tỷ lệ nhộng sắn nhộng sắn bật mầm bật mầm thể (%) thể (Con) 125 140 130 119 102 92,59 100,00 100,00 95,20 76,69 Hình 3.2 Nhộng sắn nhiễm nấm thành cơng đặt giá thể cát vàng Hình 3.3 Nhộng sắn nhiễm nấm bật mầm thể sau 10 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên Hình 3.4 Nhộng sắn nhiễm nấm bật thể sau 20 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên 28 3.2.2 Ảnh hưởng độ tạo ẩm giá thể cát đến phát triển thể nấm Nhộng sắn sau gây nhiễm nấm nuôi tối - ngày chuyển sang hộp nhựa có sẵn giá thể cát tạo ẩm cách phun nước với thể tích khác đưa nuôi sáng điều kiện tự nhiên (dưới tán rừng, nơi ẩm ướt, nhiệt độ trung bình ngày đêm dao động từ 18 – 250C, độ tàn che >75%) Kết thu sau 40 ngày nuôi sáng tán rừng trình bày bảng 3.5 Kết cho thấy, mức độ gây ẩm giá thể cát khác ảnh hướng rõ rệt đến thời gian tỷ lệ nhộng bật mầm thể, số lượng thể/con chiều dài thể nấm Ở công thức cát vàng không tạo ẩm nước cho tỷ lệ nhộng bật mầm thể thấp (38,95%), thời gian nhộng bật mầm thể dài sau 18 ngày nuôi sáng, số thể đạt thấp 1,6 thể/con nhộng, chiều dài thể trung bình ngắn 1,8 cm; thể bị bung hệ sợi phần đầu Khi phun 25 – 50 ml nước vào hộp cát cho tỷ lệ nhộng bật mầm thể đạt < 80%, thời gian nhộng bật mầm thể từ 10 – 13 ngày sau nuôi sáng, số lượng thể chiều dài thể nấm đạt không cao Phun 100 – 150 ml nước vào hộp giá thể cát thu kết nhộng nảy mầm thể 100%, thời gian nảy mầm 10 ngày sau nuôi sáng đạt số lượng thể, chiều dài thể nấm lớn Tuy nhiên từ kết nghiên cứu thực tế cho thấy phun tạo ẩm đến 150 ml nước vào cát, cát có độ ẩm cao nên nuôi trồng phần đuôi nhộng bị úng nhũn có mầu đen đậm Vì vậy, xác định mức độ phun nước tạo ẩm thích hợp vào hộp cát 100 ml, cát ẩm dùng tay bóp khơng bị chảy nước Từ kết bước đầu nghiên cứu này, cho thấy hoàn toàn ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo ký chủ nhộng sắn điều kiện bán tự nhiên; giai đoạn gây nhiễm nuôi cấy hệ sợi nên tiến hành phịng thí nghiệm để đảm bảo mức độ nhiễm thành cơng cao, cịn giai đoạn ni trồng phát triển thể ni điều kiện tự nhiên phù hợp; nơi có nhiệt độ bình qn giao động từ 18 – 250C, độ ẩm ≥ 85% độ tàn che > 70% 29 Bảng 3.5: Ảnh hưởng độ ẩm giá thể cát đến phát triển thể nấm Lượng Số lượng Thời nước phun nhộng gian nhộng vào giá thể thí cát vàng nghiệm bật nầm (ml) (con) thể Số lượng nhộng bật mầm thể (con) Tỷ lệ nhộng bật mầm thể (%) Số lượng thể TB (quả thể) Chiều dài TB (cm) ( ngày ) 95 18 37 38,95 1,6 1,8 25 102 13 58 56,86 2,8 3,0 50 98 10 79 80,61 3,5 3,9 100 105 10 105 100,00 4,6 5,2 150 92 10 92 100,00 4,5 4,8 Hình 3.5 Nhộng sắn nhiễm nấm bật thể công thức bổ sung 100 ml nước sau 40 ngày nuôi sáng điều kiện tự nhiên 30 Hình 3.6 Hình thái, kích thước thể nấm Đơng trùng hạ thảo C militaris ni ký chủ nhộng sắn Hình 3.7: Sản phẩm thu hoạch nấm Đông trùng hạ thảo C militaris nuôi ký chủ nhộng sắn điều kiện bán tự nhiên 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1) Kết luận: Từ kết bước đầu nghiên cứu nuôi trồng Đông trùng hạ thảo C militaris nuôi ký chủ nhộng sắn điều kiện bán tự nhiên thu được, đưa số kết luận sau: - Nhộng sắn giai đoạn từ – 10 ngày tuổi dùng để gây nhiễm cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công >91% - Gây nhiễm nấm vào nhộng sắn phương pháp tiêm 75 - 100 µl dung dịch giống nấm vào phần đầu ngực bụng nhộng cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm thành công cao - Nhộng sau tiêm giống nuôi phịng tối hồn tồn điều kiện nhiệt độ phịng trì ổn định 20oC, độ ẩm 60%, từ – ngày, sau chuyển sang giá thể cát vàng ẩm đặt nuôi điều kiện tự nhiên (dưới tán rừng, nhiệt độ trung bình dao động từ 18 – 250C, nơi ẩm ướt độ tàn che ánh sáng >70%), cho tỷ lệ nhộng nhiễm nấm bất thể cao thể phát triển tốt Kiến nghị Do thời gian thực đề tài khóa luận ngắn nên chưa thực thêm nhiều cơng thức thí nghiệm, nghiên cứu ni trồng địa điểm vụ đông xuân, nên tiếp tục cần nghiên cứu thêm để hoàn thiện: - Tiếp tục nghiên cứu nuôi trồng mùa vụ khác năm, địa điểm vườn quốc gia có điều kiện khí hậu thích hợp cho nấm C militaris phát triển - Phân tích so sánh hàm lượng hoạt chất sinh học, thành phần dược liệu chủng nấm giá thể nhộng sắn nuôi điều kiện phịng thí nghiệm ni điều kiện bán tự nhiên 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tài liệu nước Đái Duy Ban (2009), Nghiên cứu phát lồi Đơng trùng Hạ thảo Isaria cerambycidae NSP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học Đông trùng Hạ thảo - Thông tin y học Bộ y tế, tháng 8/2009 Phạm Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tạp trí nơng nghiệp phát triển nơng thơn số - tháng 4/2009 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 6/2009 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK vườn quốc gia Hồng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 9/2009 Phạm Thị Thuỳ (2004) Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội B Tài liệu tiếng anh 10 Gu Y.X., Wang Z.S., Li S.X., 2007 Effect of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris Food Chemistry 102:1304–1309 11 Huang S.J., Tsai S.Y., Lee Y.L., 2006 Nonvolatile taste components of fruiting bodies and mycelia of Cordyceps militaris Food Science Technology 39:577–583 12 Huang N.L., Lin Z.B., Chen G.L., 2010 Medicinal and edible fungi Shanghai Scientific and Technological Literature, Shanghai 33 13 Hur H., 2008 Chemical Ingredients of Cordyceps militaris Mycobiology 36(4):233-235 14 Jae-Sung K., Kumar S., Se -Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T H., Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., Hong-Sung C., Yeal P., Sung-Jun K., 2006 A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris Journal of Microbiology 44(6):622-31 15 Kobayasi Y., 1982 Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York 16 Kwon J.S., Lee J.S., Shin W.C., 2009 Optimization of culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides with Cordyceps militaris in liquid culture Biotechnology and Bioprocess Engineering 14:756–762 17 Li C.R., Nam S.H., Geng D.G., 2006 Artificial culture of seventeen Cordyceps spp Mycosystema 25:639–645 18 Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K., Lai M.N., Jeng K.C., 2007 Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris The American Journal of Chinese Medicine.35(4):631-641 10 19 Liu Z.Y., Yao Y.J., Liang Z.Q., 2001 Molecular evidence for the anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis Mycological Research 105: 827–832 11 20 Mains E.B., 1958 North American entomogenous species of Cordyceps Mycologia 50:169–222 12 21, Mizuno T., 1999 Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi, “Tochukaso” (Review) International Journal of Medicinal Mushrooms 1:251-261 13 22 Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A., 2008 Dictionary of the Fungi; CABI 34 14 23 Sato H and Shimazu M., 2002 Stromata production for Cordyceps militaris (Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host insects Applied Entomology and Zoology 37:85–92 15 24 Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-Kil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K., 2009 Cordycepin Suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharide-induced Inflammation in Macrophages Immune Network 9(3):98-105 16 25 Shonkor K D., Shinya F., Mina M and Akihiko S., 2010 Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant Lecture Notes in Engineering and Computer Science 20-22 17 26 Shrestha B., Lee W.H., Han S.K., Sung J.M., 2006 Observations on Some of the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of Cordyceps militaris Isolates Mycobiology 34(2):83-91 18 27 Stensrud Ø., Hywel- Jones N.L., Schumacher T., 2005 Towards a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm divergent lineages and paraphyly Mycological Research 109: 41–56 19 28 Stone R., 2008 Last stand for the body snatcher of the Himalayas? Science 322:1182 20 29 Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006 Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34: 131–137 21 30 Wang J.F., Yang C.Q., 2006 Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17:268–269 22 31 Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-Dong L., Sang-Wha L., Su-Yeong S and Min-Ho J., 2010.The Antiinflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage Mycobiology 38(1): 46-51 35 23 32 Xie C.Y., Gu Z.X., Fan G.J., 2009a Production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture Applied Biochemistry and Biotechnology 158:483–492 24 33 Xie C.Y., Liu G.X., Gu Z.X., 2009b Effects of culture conditions on mycelium biomass and intracellular cordycepin production of Cordyceps militaris in natural medium Annua Microbiology 59:293–299 25 34 Xiong C.H., Xia Y.L., Zheng P., 2010 Developmental stage-specific gene expression profiling for a medicinal fungus Cordyceps militaris Mycology 1:25–66 26 35 Young-Joon A., Suck- Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S and Don- Ha C., 2000 Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 2744−2748 27 36 Yu H.M., Wang B.S., Huang S.C., 2006 Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage Journal of Agriculture and Food Chemistry 54:3132–3138 28 37 Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., Dong-Ki P and Toshimitsu H., 2007 In Vivo Anti-influenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated Soybeans Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 10194–10199 29 38 Zhang Z., Lei Z., Lu Y., 2008 Chemical composition and bioactivity changes in stale rice after fermentation with Cordyceps sinensis Journal of Bioscience and Bioengineering 106: 188–93 30 39 Zhang Y.J., Li E., Wang C.S., 2012.Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology Mycology 3:2–10 36 31 40 Zheng P., Xia Y.L., Xiao Ch.H., 2011 Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome Biology 23; 12 32 Byung-Tae P., Kwang-Heum N., Eui-Cha J., Jae-Wan P., Ha-Hyung K., 2009 Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom Cordyceps militaris Korean Journal of Physiol Pharmacology 13: 49 - 54 33 Che Z.M., 2003 Assessment on edible safety of artificially cultivated Cordyceps militaris fruiting bodies Edible Fungi 25(3): 45–46 34 Das S.K., Masuda M., Mikio S., 2010 Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81:961–968 35 Dong JZ, Lei C, Ai XR et al., 2012 Selenium enrichment on Cordy-ceps militaris Link and analysis on its main active components Applied Biochemistry and Biotechnology 166:1215–1224 36 Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G and Zhongzheng G, 2011 Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris African Journal of Microbiology Research 5(18): 2743-2751 37 Filipa S Reis, Lillian Barros, Ricardo C Calhelha, Ana Ćirić, Leo J.L.D van Griensven, Marina Soković , Isabel C.F.R Ferreira, 2013.The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties Food and Chemical Toxicology Volume 62, December 2013, Pages 91–98 38 In-Pyo Hong, Pil-Don Kang, Ki-Young Kim, Sung-Hee Nam, Man- Young Lee, Yong-Soo, Choi,Nam-Suk Kim, Hye-Kyung Kim, Kwang-Gill Lee, and Richard A Humber., 2010 Fruit Body Formation on Silkworm by Cordyceps militaris, Mycobiology 38(2): 128–132 37