TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về tảo xoắn Spirulina
Tảo xoắn Spirulina (tên khoa học Spirulina platensis) có hệ thống phân loại như sau:
Tảo Spirulina có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm đất, bãi rong cỏ, cũng như các thủy vực nước ngọt, nước lợ, nước mặn và ngay cả suối nước nóng.
Spirulina có khả năng phát triển mạnh mẽ trong những môi trường khắc nghiệt mà các loại tảo khác không thể tồn tại Trong các thủy vực nước ngọt, Spirulina nổi bật giữa nhiều loại tảo khác, cho thấy sự đa dạng và khả năng thích nghi của nó trong hệ sinh thái.
Spirulina Spirulina có thể tìm thấy ở cả những thủy vực có độ mặn 65 - 70 ppt
Hình dạng và cấu tạo
Spirulina là một loại tảo lam đa bào, có dạng sợi và bao gồm nhiều tế bào hình trụ xếp khối không phân nhánh Đường kính tế bào dao động từ 1 - 12 µm, với chiều dài tế bào có thể lên đến 10 µm và chiều dài chuỗi có thể đạt tới 110 µm Các sợi tảo này có tính di động, với dạng xoắn trong môi trường chất lỏng và hình xoắn trong môi trường agar Đặc điểm độ xoắn của tảo là một yếu tố quan trọng để phân loại các loài.
Trong giai đoạn sinh sản của chu kỳ sống, chuỗi xoắn bị vỡ thành nhiều đoạn tảo nhờ sự hình thành của tế bào mắc xích Các đoạn xoắn nhỏ ở mắc xích tạo thành hormogonia, sau đó phát triển thành chuỗi dài mới Tế bào trong hormogonia rời khỏi vị trí đính của tế bào mắc xích, trở nên tròn ở đầu và cuối Số lượng tế bào trong hormogonia tăng lên thông qua sự phân chia tế bào, với nguyên sinh chất trở nên có hạt Quá trình này làm cho chuỗi dài hơn và có dạng xoắn đặc thù.
Sự sinh trưởng của tảo phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng và sinh lý Với chế độ dinh dưỡng phù hợp và điều kiện sinh lý thuận lợi, quá trình sinh trưởng của tảo sẽ trải qua ít nhất các pha cần thiết để phát triển hiệu quả.
Pha tiềm phát là quá trình mà các enzyme bị vô hiệu hóa, dẫn đến sự giảm tốc độ trao đổi chất của tảo giống Trong giai đoạn này, tế bào gia tăng kích thước mà không có sự phân chia Một số yếu tố khuyếch tán do chính các tế bào tạo ra là cần thiết cho quá trình cố định carbon Hoạt động trao đổi chất của tế bào cũng đã ức chế sự hoạt động của các độc tố có mặt trong môi trường, hoặc do việc cấy tảo vào môi trường có chứa một số chất với nồng độ quá cao.
Pha lũy thừa là giai đoạn mà tế bào phân chia nhanh chóng và liên tục Tốc độ tăng trưởng trong giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước tế bào, cường độ ánh sáng và nhiệt độ.
Pha cân bằng xảy ra khi một số yếu tố như sự giảm sút dinh dưỡng, tỷ lệ cung cấp oxy và carbonic, thay đổi pH, hạn chế ánh sáng, và sự xuất hiện của chất độc trong môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tảo Đây là giai đoạn đầu của pha tăng trưởng chậm, nhưng quá trình này diễn ra nhanh chóng với sự cân bằng giữa tốc độ tăng trưởng và các yếu tố giới hạn, được gọi là pha quân bình.
Pha suy vong xảy ra khi các chất dinh dưỡng trong môi trường trở nên cạn kiệt, không đủ để hỗ trợ sự sinh trưởng và trao đổi chất của tảo Khi tình trạng này diễn ra, tảo sẽ giảm số lượng một cách đáng kể, dẫn đến tình trạng trở nên độc hại cho hệ sinh thái.
Clement (1975) đã chỉ ra rằng Spirulina có thành phần hóa học với hàm lượng dinh dưỡng vượt trội, cao hơn so với tảo Chlorella (Đặng Thị Men, 2013).
Theo Santillen (1982), Spirulina sp chứa nhiều thành phần khoáng chất với tỷ lệ cao, bao gồm canxi, photpho, sắt, natri, clo, magie, mangan và kali Ngoài ra, Spirulina còn cung cấp 18 loại acid amin thiết yếu cho cơ thể như isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, alanine, arginine, glycine, histidine, tyrosine và proline, được xác định theo trình tự trong các bảng 1.1, 1.2, 1.3 và 1.4 (trích dẫn bởi Đặng Thị Men, 2013).
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina (Santillen 1982)
STT Thành phần % chất khô tổng số
Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina (Santillen 1982)
STT Thành phần Số lượng (mg)
Bảng 1.3 Thành phần khoáng của tảo Spirulina (Santillen 1982)
STT Thành phần Số lượng (mg)
Bảng 1.4 Thành phần acid amin trong tảo Spirulina sp (Santillen 1982)
STT Thành phần àg/10g % acid amin tổng số
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Spirulina sp có tác dụng tích cực đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và chất lượng thịt của các loài động vật nuôi, đồng thời nâng cao khả năng miễn dịch và tiêu diệt virus Do đó, Spirulina sp từ lâu đã được coi là một loại thức ăn dinh dưỡng, được sử dụng để phòng và chữa bệnh cho cả người và động vật, cũng như trong xử lý môi trường (Belay, 2002).
Tổ chức Lương thực Thực phẩm Thế giới (FAO, 1996) đã công nhận tảo Spirulina sp là nguồn thực phẩm chức năng bổ sung rất tốt cho con người Tảo này chứa 4 loại axit amin thiết yếu quan trọng, bao gồm lysine, methionine, phenylalanine và tryptophan, trong đó tryptophan là nguyên liệu chính để tổng hợp vitamin B3.
Tảo Spirulina là nguồn cung cấp acid amin không thể thay thế và acid béo không bão hòa quan trọng, đặc biệt là acid γ-linolenic, giúp chống suy dinh dưỡng và béo phì Hàm lượng protein trong Spirulina đạt 56% - 77% trọng lượng khô, cao gấp ba lần thịt bò và gấp hai lần đậu tương, làm cho nó trở thành thực phẩm có giá trị dinh dưỡng vượt trội.
Các carotenoit chính trong tảo Spirulina sp bao gồm oscillaxanthin, mycoxanthophyll, zeaxanthin, hydro-echinenon, β-carotene, β-crytoxanthin và echinenon Lipid chủ yếu của Spirulina sp là mono-di-galactosyldiglycerrid và phosphatidyglycerol Đặc biệt, Spirulina sp nổi bật với hàm lượng β-carotene (tiền vitamin A) cao nhất, gấp 10 lần so với cà rốt, loại rau quả phổ biến nhất giàu β-carotene trong thực phẩm hàng ngày.
Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris hiện nay
1.3 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Cordyceps militaris hiện nay
Trong chi Cordyceps, hai loài nổi bật là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris, đã thu hút sự chú ý trong nghiên cứu và nuôi trồng Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phát triển thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi của chúng.
Nuôi trồng nấm Cordyceps militaris đang phát triển mạnh mẽ trên toàn cầu, đặc biệt là ở các quốc gia như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ Tại Trung Quốc, các trang trại lớn chuyên sản xuất nấm này có thể đạt sản lượng lên đến 100.000 kg mỗi năm, tập trung chủ yếu ở các tỉnh như Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy và Giang Tô.
Tập đoàn Dược phẩm Tasly (Trung Quốc) đã nhân giống thành công
Cordyceps militaris được thu hái từ vùng đầm lầy cao nguyên trên 4000 m, nơi đã phân lập và chiết xuất thành công các hoạt chất sinh học có giá trị dược liệu Sản phẩm nổi bật là viên nang Tasly Hoàng trùng thảo với hàm lượng polysaccharide cao Hướng đi này đã giúp Trung Quốc xây dựng thương hiệu nấm Cordyceps militaris, xuất khẩu ra toàn cầu.
Kim và đồng tác giả (2006) tại Hàn Quốc đã nghiên cứu việc sử dụng nhộng tằm để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris Họ đã khử trùng nhộng tằm ở 121ºC trong 90 phút và sau đó cấy giống nấm Kết quả cho thấy sau 20 ngày, sợi nấm đã phát triển kín toàn bộ giá thể trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25ºC và cường độ ánh sáng 500 - 700 lx, dẫn đến sự hình thành mầm thể quả Đồng thời, nhóm tác giả cũng tiến hành nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dinh dưỡng lỏng với các thành phần: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0,5 g/lít KH2PO4, 0,5 g/lít K2HPO4.3H2O, và 0,5 g/lít MgSO4.7H2O.
Nghiên cứu của Yuh và đồng tác giả (2011) cho thấy rằng, Cordyceps militaris phát triển tốt nhất và đạt hàm lượng cao nhất về adenosine và cordycepin khi được chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày.
Gregori (2014) đã thực hiện nghiên cứu đầu tiên về hệ sợi C militaris và cơ chế hình thành quả thể khi nuôi trồng trên giá thể rắn chứa ngũ cốc nhà máy bia đã qua sử dụng (SBG) Nghiên cứu đã thử nghiệm năm chủng C militaris khác nhau trên các chất nền chứa hạt lúa mạch đen và từ 0 đến 60% SBG Kết quả cho thấy sự hình thành quả thể trên SBG được chú ý với hai chủng C militaris, trong khi tất cả các chủng đều không phát triển trên chất nền có lượng SBG cao hơn 50% Chủng CM2 đạt nồng độ cordycepin cao nhất là 10,42 mg/g khi nuôi cấy trên 50% SBG, trong khi chủng CM11 có khả năng sản xuất 787,11 mg/g cordycepin từ 1 gam sinh khối nấm.
Wu và đồng tác giả (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của mô hình chiếu sáng trong quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris qua ba giai đoạn Giai đoạn xâm chiếm được thực hiện ở nhiệt độ 23ºC, trong khi giai đoạn kích bật mầm quả thể yêu cầu nhiệt độ 18ºC và chiếu sáng 12 giờ/ngày Giai đoạn đậu quả diễn ra ở 23ºC với điều kiện chiếu sáng tương tự Năng suất quả thể cao nhất đạt 4,06 g trọng lượng khô/chai và hiệu quả sinh học 86,83% dưới ánh sáng 1750 ± 250 lx trong giai đoạn hai và ba Hàm lượng C militaris cao nhất được ghi nhận trong giai đoạn hai và ba dưới ánh sáng 1250 ± 250 lx Ngoài ra, hàm lượng mannitol và polysaccharide cũng đạt tối đa lần lượt dưới 1250 ± 250 lx và 1750 ± 250 lx trong giai đoạn kích bật mầm và giai tạo quả thể.
Kaewkam và các đồng tác giả (2021) đã nghiên cứu nuôi cấy C militaris trong môi trường cảm ứng tạo quả thể (FIM) với nhiều nguồn protein khác nhau như Spirulina maxima, Chlorella vulgari, đậu tương, đậu xanh, cám gạo và trứng gà tươi Kết quả cho thấy, FIM chứa protein từ tảo xoắn S maxima mang lại trọng lượng tươi và trọng lượng khô (DW) của C militaris cao nhất cùng hàm lượng cordycepin tối ưu Nghiên cứu đã thử nghiệm nhiều công thức FIM với nồng độ khác nhau của S maxima, cả tươi lẫn khô, để tối ưu hóa năng suất và hàm lượng cordycepin C militaris được nuôi cấy trong 11 môi trường FIM khác nhau, trong đó FIM tốt nhất là với 1% S maxima tươi, cho năng suất và hàm lượng cordycepin cao hơn so với các sản phẩm thương mại.
Nghiên cứu của Iamtham và đồng tác giả (2022) về ảnh hưởng của hàm lượng tảo xoắn đến năng suất và hàm lượng hoạt chất trong nuôi trồng C militaris cho thấy rằng việc nuôi cấy C militaris trên môi trường cảm ứng tạo đậu quả thể (FIM) với 1% SBR khô mang lại lượng cordycepin cao nhất là 32,87 mg/g-DW Các mẫu được nuôi cấy trong điều kiện bóng tối ở 25 ± 2ºC trong 2 tuần, sau đó chuyển sang ánh sáng 50 μmol/m−2/s−1 ở 20 ± 2ºC trong 10 tuần Kết quả này cao hơn so với các nghiên cứu trước đó.
Hiện nay, nghiên cứu về nấm Cordyceps tại Việt Nam đang ở giai đoạn mới với một số kết quả đáng chú ý Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc điều tra, phát hiện và thu thập nấm Cordyceps trong điều kiện tự nhiên của Việt Nam.
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã thu thập mẫu Cordyceps tại một số Vườn quốc gia và Khu bảo tồn thiên nhiên Việc giám định mẫu được thực hiện dựa trên các khóa phân loại và chuyên khảo về Cordyceps của Yosio Kobayasi.
Theo tài liệu của Mo (2000) và Mao (2000), cùng tham khảo hệ thống phân loại của Sung và đồng tác giả (2007), tổng số 24 loài nấm Cordyceps đã được xác định, tất cả đều thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocriales, lớp Sordariomycetes, ngành phụ nấm túi Ascomycota Các loài nấm được xác định bao gồm: Aschersonia badia Patouillard, Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch, và Cordyceps annullata.
Kobayasi & Shimizu, Cordyceps cardinalis G.H Sung & Spatafora, Cordyceps crinalis Ellis ex Lloyd, Cordyceps formicarum Kobayasi, Cordyceps formosana Kobayasi & Shimizu, Cordyceps gunnii Berk,
Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophilla, Cordyceps nutans, Cordyceps oxycephala, Cordyceps pseudomilitaris, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps stylophora, Cordyceps takaomontana, Cordyceps tuberculata, Isaria cateniannulatus, and Isaria farinosa are notable species within the Cordyceps genus, known for their unique characteristics and potential medicinal benefits These fungi play significant roles in various ecosystems and have garnered attention for their applications in traditional medicine and modern health supplements.
(Holmsk.)Fr., Isaria japonica Yasuda, Isaria takamizusanensis Kobayasi, Isaria ternuipes Peck và Metarrhizium anisopliae (Metch.) Sorokin
Vào năm 2009, Phạm Quang Thu từ Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam đã tiến hành điều tra và thu mẫu nấm Cordyceps tại khu bảo tồn Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang Tác giả đã phát hiện và xác định được loài nấm Cordyceps nutans, đánh dấu đây là loài Cordyceps đầu tiên được mô tả và ghi nhận có mặt tại Việt Nam.
Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc, các nhà nghiên cứu đã phát hiện nấm Cordyceps gunnii, trong khi tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai, nấm Cordyceps militaris (nấm nhộng trùng thảo) cũng đã được tìm thấy.
Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập ở vườn Quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình nguồn nấm Cordyceps
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Nuôi cấy thành công chủng nấm Cordyceps militaris Cm3 trên môi trường dinh dưỡng bổ sung protein từ tảo xoắn Spirulina, thay thế cho nguồn protein từ nhộng tằm Việc này không chỉ mở ra hướng đi mới trong sản xuất nấm Cordyceps mà còn nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Sự kết hợp này hứa hẹn mang lại lợi ích cho cả sức khỏe con người và phát triển bền vững trong ngành nông nghiệp.
- Xác định thành phần dinh dưỡng của tảo xoắn Spirulina sử dụng làm nguồn nguyên liệu nuôi cấy chủng C militaris Cm3
- Xác định đặc điểm hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng
- Nghiên cứu nhân giống cấp 1 nấm C militaris Cm3 trên môi trường bổ sung tảo Spirulina
- Nghiên cứu nuôi trồng nấm C militaris Cm3 trên giá thể bổ sung nguồn protein từ tảo Spirulina thay thế thành phần nhộng tắm
Nghiên cứu nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng C militaris Cm3 trên giá thể bổ sung tảo Spirulina, tập trung vào việc xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi trồng và thời gian chiếu sáng trong ngày Kết quả sẽ giúp cải thiện hiệu suất sinh trưởng và chất lượng sản phẩm.
2.3.1 Vật liệu vi sinh vật
- Chủng nấm Cordyceps militaris Cm3 do Viện di truyền Nông nghiệp, trực thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cấp
Tảo xoắn Spirulina dạng khô được cung cấp bởi Trung tâm công nghệ sinh học IMC, Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ cao Hòa Lạc Tảo được nuôi trồng trong điều kiện dinh dưỡng tối ưu và khép kín, sau khi đạt các yếu tố sinh trưởng như hình thái, số vòng xoắn và mật độ, sẽ được thu hoạch Sinh khối tảo tươi được lọc qua hệ thống màng lọc, rửa và vắt ly tâm Sau thu hoạch, tảo tươi được tạo sợi, sấy lạnh và sấy nhiệt ở 55ºC để làm khô Tảo khô đạt độ ẩm 5% được đóng gói, hút chân không và bảo quản trong kho lạnh tối, phục vụ làm nguyên liệu cho nuôi cấy nấm C militaris.
- Các nguyên liệu: Khoai tây, nước dừa, nhộng tươi, pepton, cao nấm men, agar, sản xuất tại Việt Nam
- Các hóa chất, chất khoáng và vitamin: MgSO4; KH2PO4; (NH4)3C6H5O7; vitamin B1, aceton, ethanol, nhập khẩu ở Ấn Độ
2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học IMC – Khu công nghệ cao Hòa Lạc
- Thời gian nghiên cứu: 24 tháng
2.5.1 Xác định thành phần dinh dưỡng của tảo xoắn Spirulina
2.5.1.1 Xác định hàm lượng protein
Tảo khô được nghiền thành bột mịn và bột tảo Spirulina (10 g) được ly giải cơ học trong dung dịch đệm natri photphat (0,1 M; pH 7,0) bằng thiết bị siêu âm ở tần số 40 kHz trong 60 phút Sau đó, bột tảo được trộn với dung môi đệm natri photphat (0,1 M; pH 7,0) với tỷ lệ sinh khối/dung môi 1 : 20 (w/v) Tiếp theo, hỗn hợp dịch tảo trong dung dịch đệm được xử lý nhiệt ở 60ºC trong 120 phút, và cuối cùng, hỗn hợp này được ly tâm ở tốc độ thích hợp.
6000 vòng/phút trong 25 phút ở 4ºC và thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan (Vernès et al., 2019)
Hàm lượng protein trong dịch tảo được xác định bằng phương pháp Lowry cải tiến, theo mô tả của Peterson và đồng tác giả (1977) Phương pháp này dựa trên sự hình thành phức chất đồng protein khử với phosphomolybdic – phosphovonphramat (thuốc thử Folin Ciocalteu), tạo ra phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn (albumin), hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu có thể được xác định.
Chuẩn bị hóa chất xác định hàm lượng protein theo Lowry:
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 ml nước cất
- Dung dịch B: 0,5 g CuSO4 5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49 : 1 (pha trước khi dùng)
- Thuốc thử Folin–Ciocalteu 1N (dung dịch thuốc thử Folin–Ciocalteu pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1 : 1)
- Albumin huyết thanh 1mg/ml
Để tiến hành thí nghiệm, lấy chính xác 0,5 ml dung dịch chứa protein tảo đã được pha loãng đến nồng độ trong khoảng đường chuẩn, cho vào ống nghiệm Tiếp theo, thêm 2 ml dung dịch C vào ống nghiệm và lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, cho 250 µL thuốc thử Folin–Ciocalteu đã được pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:1 vào hỗn hợp.
1) được thêm vào và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối Khi đó, mầu vàng của dung dịch chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại So màu của hỗn hợp trên máy so màu quang phổ ở bước sóng
Mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu được xác định ở bước sóng 720 nm Để đảm bảo độ chính xác, mật độ quang được đo bằng máy ba lần lặp lại và lấy giá trị trung bình.
- Mẫu đối chứng: Bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm natri photphat (0,1 M; pH 7,0) vào ống nghiệm, thêm vào đó 2 ml dung dịch C, lắc đều để yên trong
20 phỳt ở nhiệt đụ̣ phũng Tiếp theo thờm 250 àL thuốc thử Folin–Ciocalteu đã pha loãng, và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm
Xây dựng đường chuẩn Albumin huyết thanh:
- Đường chuẩn được lập bằng cách sử dụng Albumin huyết thanh bò (0
- 120 àg/ml) để tớnh hàm lượng protein trong cỏc mẫu
Cân 0,05 g Albumin hòa tan trong 50 ml nước cất deion, tạo ra dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml Sau đó, pha loãng dung dịch Albumin gốc bằng nước cất để đạt các nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, 100, và 120 µg/ml nhằm xây dựng đường chuẩn.
Để xác định hàm lượng Albumin, lốy 0,5 ml dung dịch Albumin (nồng độ 0 – 120 àg/ml) cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml dung dịch C và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Tiếp theo, cho 0,25 ml thuốc thử Folin (1N) vào, và đo màu sắc tại bước sóng 720 nm Qua ba lần lặp lại thí nghiệm, đường hồi quy đã được xây dựng, thể hiện mối quan hệ giữa OD720nm và hàm lượng Albumin (xem Bảng 2.1, Hình 2.1 và Hình 2.2).
Bảng 2.1 Trị số OD 720nm đo được ở các nồng độ Albumin khác nhau Ống nghiệm số Nồng độ Albumin (àg/ml) Trị số OD 720nm
Hình 2.1 Phản ứng màu của Albumin (ở các nồng độ khác nhau) với thuốc thử Folin-Ciocalteu
Hình 2.2 Đồ thị chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa trị số OD 720nm và nồng độ Albumin (àg/ml)
Phương trình tương quan giữa nồng độ Albumin và trị số OD720nm được biểu diễn bằng công thức: y = 0,0016x + 0,0043, trong đó y đại diện cho giá trị OD720nm và x là nồng độ Albumin tính bằng (àg/ml).
Từ phương trình đường chuẩn, có thể xác định nồng độ protein hòa tan trong dịch mẫu và hàm lượng protein trong lượng mẫu cân, giúp xác định hàm lượng protein chính xác.
- Xác định hàm lượng protein theo phần trăm khối lượng khô:
Hàm lượng protein trong bột tảo khô được tính theo công thức: Hàm lượng protein (%) = Ps/Sw × 100 Trong đó, Ps là hàm lượng protein hòa tan trong mẫu (àg) và Sw là khối lượng mẫu lõy để xác định hàm lượng protein (àg).
2.5.1.2 Xác định hàm lượng amino acid
Mẫu tảo khô đã được gửi đến Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia để xác định hàm lượng amino acid tổng số, bao gồm các amino acid thiết yếu và không thiết yếu, nhằm bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Cm3.
2.5.1.3 Xác định hàm lượng chlorophyll
Hàm lượng chlorophyl trong sinh khối tảo khô được xác định theo phương pháp của Rinawati và cộng sự (2020)
- Cân 1 g (m1 g) sinh khối khô tảo đã được nghiền thành bột mịn vào ống ly tâm
Bổ sung 10 ml dung dịch aceton 80% và ngâm chiết qua đêm để đảm bảo chlorophyll được chiết xuất hoàn toàn từ mô tảo, cho đến khi mô tảo Spirulina không còn màu xanh lục.
- Ly tâm mẫu ở 5000 vòng/phút trong 20 phút
- Gạn dịch nổi sang ống mới và định mức bằng aceton 80% đến thể tích
10 ml Dịch nổi được sử dụng để xác định hàm lượng chlorophyll ngay hoặc bảo quản ở -10ºC cho tới khi xác định
Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu vi sinh vật
- Chủng nấm Cordyceps militaris Cm3 do Viện di truyền Nông nghiệp, trực thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cấp
Tảo xoắn Spirulina dạng khô được cung cấp bởi Trung tâm công nghệ sinh học IMC, Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ cao Hòa Lạc Tảo được nuôi trồng trong điều kiện dinh dưỡng tối ưu và khép kín, và được thu hoạch khi đạt các tiêu chí sinh trưởng như hình thái, số vòng xoắn và mật độ Sau khi thu hoạch, sinh khối tảo tươi được lọc qua hệ thống màng lọc, rửa và vắt ly tâm Tảo tươi sau đó được tạo sợi, sấy lạnh và sấy nhiệt ở 55ºC để làm khô Tảo khô đạt độ ẩm 5% được đóng gói, hút chân không và bảo quản trong kho lạnh, tối để sử dụng làm nguyên liệu cho nuôi cấy nấm C militaris.
- Các nguyên liệu: Khoai tây, nước dừa, nhộng tươi, pepton, cao nấm men, agar, sản xuất tại Việt Nam
- Các hóa chất, chất khoáng và vitamin: MgSO4; KH2PO4; (NH4)3C6H5O7; vitamin B1, aceton, ethanol, nhập khẩu ở Ấn Độ
2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học IMC – Khu công nghệ cao Hòa Lạc
- Thời gian nghiên cứu: 24 tháng
2.5.1 Xác định thành phần dinh dưỡng của tảo xoắn Spirulina
2.5.1.1 Xác định hàm lượng protein
Tảo khô được nghiền thành bột mịn và sau đó, bột tảo Spirulina (10 g) được ly giải cơ học trong dung dịch đệm natri photphat (0,1 M; pH 7,0) bằng thiết bị siêu âm ở tần số 40 kHz trong 60 phút Hỗn hợp này tiếp tục được trộn với dung môi đệm natri photphat để đạt tỷ lệ sinh khối/dung môi 1:20 (w/v) Tiếp theo, hỗn hợp dịch tảo trong dung dịch đệm được xử lý nhiệt ở 60ºC trong 120 phút và sau đó được ly tâm ở tốc độ cao.
6000 vòng/phút trong 25 phút ở 4ºC và thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan (Vernès et al., 2019)
Hàm lượng protein trong dịch tảo được xác định bằng phương pháp Lowry cải tiến, theo mô tả của Peterson và đồng tác giả (1977) Phương pháp này dựa trên sự hình thành phức chất đồng protein khử với phosphomolybdic và phosphovonphramat (thuốc thử Folin Ciocalteu), tạo ra phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Bằng cách so sánh mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn (albumin), có thể xác định hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Chuẩn bị hóa chất xác định hàm lượng protein theo Lowry:
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 ml nước cất
- Dung dịch B: 0,5 g CuSO4 5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49 : 1 (pha trước khi dùng)
- Thuốc thử Folin–Ciocalteu 1N (dung dịch thuốc thử Folin–Ciocalteu pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1 : 1)
- Albumin huyết thanh 1mg/ml
Để thực hiện thí nghiệm, lấy chính xác 0,5 ml dung dịch chứa protein tảo đã được pha loãng đến nồng độ trong khoảng đường chuẩn, cho vào ống nghiệm Sau đó, thêm 2 ml dung dịch C và lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, thêm 250 µL thuốc thử Folin–Ciocalteu đã pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:1.
1) được thêm vào và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối Khi đó, mầu vàng của dung dịch chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại So màu của hỗn hợp trên máy so màu quang phổ ở bước sóng
Mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu được xác định tại bước sóng 720 nm Để đảm bảo độ chính xác, mật độ quang được đo lặp lại 3 lần và sau đó tính toán giá trị trung bình.
- Mẫu đối chứng: Bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm natri photphat (0,1 M; pH 7,0) vào ống nghiệm, thêm vào đó 2 ml dung dịch C, lắc đều để yên trong
20 phỳt ở nhiệt đụ̣ phũng Tiếp theo thờm 250 àL thuốc thử Folin–Ciocalteu đã pha loãng, và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm
Xây dựng đường chuẩn Albumin huyết thanh:
- Đường chuẩn được lập bằng cách sử dụng Albumin huyết thanh bò (0
- 120 àg/ml) để tớnh hàm lượng protein trong cỏc mẫu
Cân 0,05 g Albumin hòa tan trong 50 ml nước cất deion để tạo ra dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml Tiến hành pha loãng dung dịch Albumin gốc bằng nước cất đến các nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, 100, và 120 µg/ml nhằm xây dựng đường chuẩn.
Để xác định nồng độ Albumin, 0,5 ml dung dịch Albumin (nồng độ 0 – 120 àg/ml) được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml dung dịch C và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Tiếp theo, thêm 0,25 ml thuốc thử Folin (1N) và tiến hành so màu ở bước sóng 720 nm Qua ba lần lặp lại thí nghiệm, đường hồi quy đã được xây dựng, thể hiện mối quan hệ giữa OD720nm và hàm lượng Albumin (xem Bảng 2.1, Hình 2.1 và Hình 2.2).
Bảng 2.1 Trị số OD 720nm đo được ở các nồng độ Albumin khác nhau Ống nghiệm số Nồng độ Albumin (àg/ml) Trị số OD 720nm
Hình 2.1 Phản ứng màu của Albumin (ở các nồng độ khác nhau) với thuốc thử Folin-Ciocalteu
Hình 2.2 Đồ thị chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa trị số OD 720nm và nồng độ Albumin (àg/ml)
Phương trình tương quan giữa nồng độ Albumin và trị số OD720nm được biểu diễn bằng công thức y = 0,0016x + 0,0043, trong đó y là giá trị OD720nm và x là nồng độ Albumin tính bằng (àg/ml).
Từ phương trình đường chuẩn, có thể xác định nồng độ protein hòa tan trong dịch mẫu và hàm lượng protein trong lượng mẫu cân, từ đó tính toán hàm lượng protein chính xác.
- Xác định hàm lượng protein theo phần trăm khối lượng khô:
Hàm lượng protein trong bột tảo khô được xác định bằng công thức: Hàm lượng protein (%) = Ps/Sw × 100 Trong đó, Ps là hàm lượng protein hòa tan trong mẫu (àg) và Sw là khối lượng mẫu lôi để xác định hàm lượng protein (àg).
2.5.1.2 Xác định hàm lượng amino acid
Mẫu tảo khô đã được gửi đến Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia để xác định hàm lượng amino acid tổng số, bao gồm các amino acid thiết yếu và không thiết yếu, nhằm bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Cm3.
2.5.1.3 Xác định hàm lượng chlorophyll
Hàm lượng chlorophyl trong sinh khối tảo khô được xác định theo phương pháp của Rinawati và cộng sự (2020)
- Cân 1 g (m1 g) sinh khối khô tảo đã được nghiền thành bột mịn vào ống ly tâm
Bổ sung 10 ml dung dịch aceton 80% và ngâm chiết qua đêm để đảm bảo chlorophyll được chiết xuất hoàn toàn khỏi mô tảo, cho đến khi mô tảo Spirulina không còn màu xanh lục.
- Ly tâm mẫu ở 5000 vòng/phút trong 20 phút
- Gạn dịch nổi sang ống mới và định mức bằng aceton 80% đến thể tích
10 ml Dịch nổi được sử dụng để xác định hàm lượng chlorophyll ngay hoặc bảo quản ở -10ºC cho tới khi xác định
Dung dịch chứa chlorophyll cần được pha loãng trong dung dịch aceton 80% đến khi đạt giá trị OD ở bước sóng 645 nm và 663 nm trong khoảng 0,2 - 0,8 đơn vị hấp phụ Sau đó, ghi lại thể tích cuối (V0 ml) của dung dịch sau khi pha loãng.
- Hút dịch mẫu sau pha loãng, đo OD ở bước sóng 645 nm và 663 nm (dung dịch aceton 80% được sử dụng làm blank)
- Tính toán xác định hàm lượng chlorophyll:
+ Xác định nồng độ chlorophyll trong dịch mẫu đo OD
Nồng độ chlorophyll a (mg/ml) = 12,7 A663nm – 2,69 A645nm
Nồng độ chlorophyll b (mg/ml) = 22,9 A645nm – 4,68 A663nm
Nồng độ chlorophyll tổng số (mg/ml) = nồng độ chlorophyll a + nồng độ chlorophyll b
Trong đó: A 663nm và A645nm lần lượt là mật độ quang của mẫu đo ở bước sóng 663 nm và 645 nm
+ Công thức xác định hàm lượng chlorophyll
Hàm lượng chlorophyll (mg/g) = (nồng độ chlorophyl tổng số (mg/ml) x V0 (ml))/m1 (g)
V0 (ml) là thể tích của dung dịch sau khi pha loãng, trong khi m1 (g) là khối lượng của sinh khối tảo khô được cân để xác định hàm lượng chlorophyll, với m1 được quy định là 1 g.
2.5.1.4 Xác định hàm lượng phycocyanin
Hàm lượng c phycocyanin trong sinh khối tảo khô được xác định theo phương pháp của Khandual và cộng sự (2021)
Phương pháp xử lý số liệu
3.1 Thành phần dinh dưỡng của tảo xoắn Spirulina
Spirulina khô chứa nhiều thành phần dưỡng chất quan trọng, bao gồm hàm lượng protein tổng số, các amino acid thiết yếu và không thiết yếu, cùng với chlorophyll và phycocyanin, như được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Cm3
Thành phần Hàm lượng (trong 100 g Spirulina khô)
Amino acid không thiết yếu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xác định một số đặc điểm sinh học của chủng Cordyceps militaris Cm3
Trong thành phần protein của Spirulina có đủ cả 9 loại amino acid thiết yếu với hàm lượng cao, như isoleucine (2940 mg/100 g), leucine (4660 mg/100 g), phenylalanine (2880 mg/100 g), valine (3370 mg/100 g)
Sắc tố đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp hormone cần thiết để điều chỉnh các hoạt động của cơ thể Hàm lượng sắc tố trong sinh khối ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng sinh lý và sức khỏe tổng thể.
Spirulina chứa nhiều sắc tố quan trọng như carotenoid, chlorophyll và phycocyanin, trong đó phycocyanin đóng vai trò thiết yếu trong sự sinh trưởng của tảo Ngoài ra, Spirulina còn chứa các nguyên tố vi lượng như Fe và Mg, giúp cung cấp chất dinh dưỡng bổ sung cho con người và động vật Nghiên cứu cho thấy hàm lượng phycocyanin trong Spirulina đạt 20,700 mg/100 g và chlorophyll là 251 mg/100 g, chứng tỏ giá trị dinh dưỡng cao của loại tảo này.
Với hàm lượng protein và dưỡng chất cao, nguyên liệu này có thể so sánh với nhộng tằm, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn protein cho việc nuôi trồng nấm dược liệu.
C militaris hiện nay), việc sử dụng tảo xoắn Spirulina thay thế nguồn protein từ nhộng tằm đã được nghiên cứu thử nghiệm trong một số công bố khoa học (Kaewkam et al., 2021; Iamtham et al., 2022)
3.2 Xác định một số đặc điểm sinh học của chủng Cordyceps militaris Cm3
Chủng C militaris Cm3 được nuôi cấy trên môi trường PDA, và quá trình tạo thành bào tử túi (ascospore) cùng với sự nảy mầm của ascospore được quan sát định kỳ dưới kính hiển vi quang học với vật kính 100X.
C militaris Cm3 cũng như các chủng nấm C militaris khác, thuộc lớp
Nấm túi (Ascomycetes) có hai phương thức sinh sản chính: sinh sản hữu tính thông qua việc tạo ra bào tử hữu tính gọi là bào tử nang (ascospore), nằm trong nang bào tử (ascus) Bào tử nang sẽ nảy mầm và phát triển thành hệ sợi nấm Ngoài ra, nấm túi còn sinh sản vô tính bằng cách tạo ra bào tử đính (conidispore) trên cuống sinh bào tử, được biết đến với tên gọi là bào tử trần.
Kết quả quan sát tế bào chủng C militaris Cm3 dưới kính hiển vi quang học cho thấy bào tử chủ yếu có hình dạng cầu, kích thước từ 1,5 - 2 µm Các bào tử có thể nằm đơn lẻ hoặc kết nối với nhau tạo thành hình dạng xoắn ốc Khi bào tử cầu bắt đầu nảy mầm, chúng chuyển thành hình bầu dục và sau đó là dạng trụ Bào tử nảy mầm có đường kính lớn hơn so với bào tử không nảy mầm Quá trình nảy mầm của bào tử thành sợi nấm có thể diễn ra theo một hoặc hai hướng ở hai phía đối diện, nhưng chủ yếu diễn ra theo một hướng (đơn hướng) ở một đầu bào tử.
Các nang bào tử có kích thước dài từ 300 - 510 µm và bề rộng từ 3 - 4 µm Chúng có hình dạng sợi, không màu và phân đoạn, với kích thước từ 3,5 - 6 µm, đường kính 1 - 1,5 µm Trong điều kiện dinh dưỡng nghèo, bào tử nang sẽ đứt ra và nảy chồi tạo thành các bào tử thứ cấp.
Kết quả nghiên cứu hình thái chủng C militaris Cm3 phù hợp với các công trình nghiên cứu đặc điểm hình thái của chi nấm Cordyceps militaris trong các công bố của Shrestha và cộng sự (2005), Xiong và cộng sự (2010), cùng với Zheng và cộng sự (2011).
Hình 3.1 Đặc điểm hình thái chủng C militaris Cm3 sau 72h nuôi cấy trên môi trường PDA agar
Bào tử của vi sinh vật thường tồn tại dưới dạng cầu và có khả năng nảy mầm theo một hoặc hai hướng khác nhau Cụ thể, bào tử có thể nảy mầm theo một hướng (mũi tên màu đỏ) hoặc hai hướng (mũi tên màu xanh) Quá trình nảy mầm này diễn ra trong nang bào tử, dẫn đến sự phát triển của bào tử nang.
3.2.2 Hoạt tính enzyme ngoại bào
Enzyme đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật, giúp tăng tốc độ các phản ứng trao đổi chất và năng lượng Chúng hoạt động như chất xúc tác, cho phép các phản ứng diễn ra nhanh hơn và điều hòa các con đường chuyển hóa để thích ứng với những thay đổi trong môi trường.
Việc xác định hoạt tính của các enzyme phân giải cơ chất cụ thể sẽ giúp nhận diện chất dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể sử dụng hiệu quả để thu nhận năng lượng Đặc điểm hoạt tính enzyme ảnh hưởng đến loại và hàm lượng thức ăn mà vi sinh vật yêu cầu, cũng như cách thức hấp thụ thức ăn của chúng Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định khả năng hấp thụ nguồn cơ chất của chủng nấm C militaris Cm3 từ ba nguồn: protein, tinh bột và carbohydrate Để thực hiện điều này, khảo sát hoạt tính ba loại enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase) của nấm C militaris Cm3 đã được tiến hành, với kết quả được trình bày trong Bảng 3.2 và Hình 3.2.
Bảng 3.2 Hoạt tính protease, amylase, cellulase ngoại bào của chủng
Enzyme Đường kính vòng phân giải cơ chất
Nghiên cứu cho thấy nấm C militaris Cm3 sản xuất ba loại enzyme ngoại bào: protease, amylase và cellulase, với hoạt tính protease và cellulase cao hơn amylase Đường kính trung bình của vòng phân giải casein, tinh bột và CMC nồng độ 0,25% lần lượt là 11,33 mm, 6,17 mm và 10,33 mm Điều này chứng tỏ nấm C militaris Cm3 có khả năng phân giải protein, carbohydrate dạng cellulose và tinh bột Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hattori và cộng sự (2005), cho thấy nấm C militaris có khả năng sản sinh protease ở nồng độ cao.
Chủng C militaris Cm3, với hoạt tính protease và cellulase cao, có khả năng hấp thu hiệu quả protein và carbohydrate từ cơ chất tảo xoắn, vốn giàu protein và carbohydrate, khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Hình 3.2 Khả năng sinh enzyme phân giải protein và carbohydrate của chủng C militaris Cm3
The study examines the protease activity in experimental and control samples, alongside the amylase activity in both sample types Additionally, it evaluates the cellulase enzyme activity present in the experimental and control samples.
3.3 Nhân giống cấp 1 nấm Cordyceps militaris Cm3 trên môi trường dinh dưỡng chứa nguồn protein từ tảo Spirulina
Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng Cordyceps militaris Cm3 trên giá thể bổ sung tảo xoắn
Nấm Đông trùng hạ thảo được sản xuất từ nguồn dinh dưỡng tảo xoắn có hàm lượng cordycepin và adenosine cao hơn, dẫn đến giá trị và giá thành cao hơn so với sản phẩm nuôi trồng từ nguồn dinh dưỡng nhộng tằm Sản phẩm nuôi trồng từ tảo xoắn cũng sẽ có đối tượng sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn so với sản phẩm từ nhộng tằm.
Tảo xoắn Spirulina là nguồn nguyên liệu dinh dưỡng phong phú, có khả năng thay thế hoàn toàn nhộng tằm trong nuôi trồng đông trùng hạ thảo C militaris, giúp khắc phục các vấn đề như phụ thuộc vào mùa vụ, chất lượng nhộng tằm không ổn định, dị ứng với thành phần trong nhộng tằm, và đáp ứng nhu cầu của người ăn chay Sản phẩm từ tảo xoắn còn chứa nhiều hợp chất thứ cấp như acid amin, vitamin và khoáng chất, mang lại giá trị khoa học và kinh tế cao Mặc dù chênh lệch giá thành nguyên liệu không lớn, nhưng giá trị sản phẩm lại tương đối cao nhờ hàm lượng hoạt chất phong phú.
3.5 Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng Cordyceps militaris Cm3 trên giá thể bổ sung tảo xoắn
3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sau khi tìm được công thức nuôi trồng phù hợp, cần tiến hành nghiên cứu để tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris Nghiên cứu này khảo sát tác động của các mức nhiệt độ nuôi trồng 18ºC, 20ºC và 22ºC đến sự phát triển của quả thể nấm Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong Bảng 3.8 và các hình ảnh 3.6, 3.7.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển chiều dài quả thể nấm Cordyceps militaris Cm3 trong quá trình nuôi trồng
Chiều dài quả thể sau các khoảng thời gian nuôi trồng khác nhau (cm)
Ghi chú : Các số liệu (giá trị trung bình) trong cùng cột có chữ cái khác nhau thì sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển chiều dài của quả thể nấm Quả thể nấm có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 18-22 ºC, nhưng mức độ phát triển sẽ khác nhau tùy thuộc vào từng ngưỡng nhiệt cụ thể.
Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển chiều dài quả thể nấm Khi nhiệt độ tăng từ 18ºC lên 20ºC, chiều dài quả thể trung bình tăng từ 8,03 cm lên 9,33 cm Tuy nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên 22ºC, chiều dài quả thể trung bình lại giảm xuống còn 7,33 cm Sự khác biệt rõ ràng giữa các công thức thí nghiệm này cho thấy nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển chiều dài quả thể Do đó, nhiệt độ 20ºC được coi là nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi trồng C militaris Cm3.
Nghiên cứu về điều kiện nhiệt độ trong nuôi trồng đông trùng hạ thảo C militaris đã được thực hiện cả trên thế giới và tại Việt Nam Kết quả cho thấy, trong khoảng nhiệt độ 20 - 25ºC, mầm thể quả có thể hình thành, như đã được Jae Sung Kim và cộng sự (2006) công bố Tương tự, Phạm Văn Nhã (2021) cũng xác nhận rằng thể quả có thể được tạo ra trong điều kiện nhiệt độ này Ngoài ra, Iamtham và cộng sự (2022) chỉ ra rằng nhiệt độ lý tưởng để phát triển quả thể nấm C militaris là 20 ± 2ºC.
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự kích bật mầm quả thể sau 15 ngày nuôi trồng
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiều dài quả thể sau 60 ngày nuôi trồng
3.5.2 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng
Tiến hành nuôi phôi nấm Đông trùng hạ thảo 15 ngày tuổi trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau thu được kết quả trình bày ở Bảng 3.9
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng tới sự phát triển chiều dài quả thể nấm C militaris Cm3 trong quá trình nuôi trồng
Thời gian chiếu sáng/ngày (h) 10 12 14
Chiều dài quả thể sau các thời gian nuôi trồng khác nhau (cm)
Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển chiều dài quả thể, với các điều kiện nuôi trồng giống nhau, thời gian chiếu sáng khác nhau dẫn đến chiều cao quả thể khác nhau Chiếu sáng quá nhiều hoặc quá ít đều làm giảm chiều dài quả thể Trong giai đoạn đầu, thời gian chiếu sáng dài giúp quả thể phát triển nhanh nhưng lại dẫn đến sự lão hóa sớm và phát tán bào tử, làm dừng phát triển chiều cao vào cuối chu kỳ nuôi sáng Do đó, lựa chọn thời gian chiếu sáng phù hợp là rất quan trọng Kết quả thí nghiệm cho thấy công thức A2 (12h/ngày) là tối ưu nhất, với chiều dài quả thể đạt 9,07 ± 0,23 cm sau 40 ngày, vượt trội so với công thức A1 (10h/ngày) chỉ đạt 7,77 ± 0,15 cm và công thức A3 (14h/ngày) đạt 8,43 ± 0,21 cm.
Nghiên cứu cho thấy thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của quả thể đông trùng hạ thảo Cụ thể, Yuh và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng điều kiện này mang lại hàm lượng adenosine và cordycepin cao nhất Tương tự, Wu và đồng tác giả (2016) cũng khẳng định rằng 12 giờ/ngày là thời gian chiếu sáng thích hợp cho giai đoạn kích bật mầm và nuôi trồng Phạm Văn Nhã (2021) xác nhận rằng việc nuôi cấy quả thể dưới ánh sáng đèn compact với cường độ 700 - 1000 lx trong 12 giờ là phù hợp Do đó, có thể kết luận rằng 12 giờ/ngày là điều kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của quả thể C militaris Cm3.
Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến chiều dài quả thể sau
Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến chiều dài quả thể sau 40 ngày nuôi trồng
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dựa vào những kết quả thu được, rút ra kết luận như sau:
-Tảo Spirulina khô sử dụng làm nguyên liệu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris Cm3 trong nghiên cứu có hàm lượng protein 68,5 g/100g,
Chủng Cordyceps militaris Cm3 sở hữu hoạt tính protease, amylase và cellulase, với đường kính vòng thủy phân cơ chất đặc hiệu tương ứng cho từng loại enzyme lần lượt là 11,33 mm, 6,17 mm và 10,33 mm.
Hàm lượng tảo xoắn tối ưu để bổ sung vào môi trường nhân giống cấp 1 cho chủng Cordyceps militaris Cm3 là 7 g/l, giúp kích thích sự phát triển hệ sợi nấm ở mức tối ưu mà không gây dư thừa dinh dưỡng Sau 20 ngày nuôi trồng, đường kính vòng sợi nấm trên đĩa thạch đạt 6,17 ± 0,40 cm.
Chủng Cordyceps militaris Cm3 khi nuôi trồng trên giá thể bổ sung 15 g/l tảo xoắn khô đạt tỷ lệ nảy mầm 94,33% Năng suất thu hoạch được thể hiện qua khối lượng quả thể trung bình/hộp là 33,53 g/hộp Hàm lượng cordycepin và adenosine trong quả thể tương ứng lần lượt là 297 mg/100 g-DW.
- Điều kiện nuôi trồng nấm C militaris Cm3 trên giá thể bổ sung tảo
Spirulina thích hợp là: nhiệt độ 20ºC và thời gian chiếu sáng là 12h/ngày
Dựa trên kết quả nghiên cứu thực tế, tôi đề xuất ứng dụng vào sản xuất Cordyceps militaris trong tương lai nhằm tạo ra giá trị khoa học và kinh tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1 Mai Hải Châu, Đặng Thị Ngọc (2022), Xác định môi trường nhân giống và nuôi tạo quả thể nấm đông trùng hạ thảo (Cordycep militaris) theo hướng hữu cơ, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp 2, 1-11
2 Nguyễn Thị Minh Hằng và Bùi Văn Thắng (2017), Nghiên cứu nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tổng hợp và nhộng tằm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp 4:11-16
3 Đặng Thị Men (2013), Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo Spirulina platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm, Đồ án tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Nha Trang