Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thành phần tảo xoắn spirulina đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris cm3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHẠM THỊ ANH NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN TẢO XOẮN SPIRULINA ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS Cm3 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ THU HẰNG GS TSKH DƯƠNG ĐỨC TIẾN Hà Nội, 2023 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, là công trình nghiên cứu của riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực và chưa từng được công bố bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Nếu nội dung nghiên cứu của trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Người cam đoan Phạm Thị Anh ii LỜI CẢM ƠN Đề tài nghiên cứu của được thực Trung tâm Công nghệ sinh học IMC Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp –Trường Đại học lâm nghiệp Việt Nam Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Trung tâm công nghệ sinh học IMC đã tạo điều kiện để công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thu Hằng GS.TSKH Dương Đức Tiến người thầy, người cô đã tận tình hướng dẫn q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của cán bộ nghiên cứu thuộc trung tâm Công nghệ sinh học IMC thầy cô giáo trực thuộc Viện Công nghiệp sinh học Lâm nghiệp đã giúp đỡ tơi rất nhiều q trình thực đề tài, điều khiến tơi thực cảm kích biết ơn Trong suốt trình học tập và công tác, đã nhận được động viên, quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cơ, phòng đào tạo sau đại học trường Đại học Lâm nghiệp; bạn bè đồng nghiệp, nơi công tác Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân đã bên tôi, là đợng lực để tơi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 08 tháng 04 năm 2023 Tác giả Phạm Thị Anh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Cordyceps militaris 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Sự phân bố tự nhiên 1.1.4 Sự lây nhiễm nấm Cordyceps militaris vào thể côn trùng 1.1.5 Đặc điểm nuôi cấy môi trường nhân tạo 1.1.6 Thành phần hóa học 1.1.7 Giá trị dược liệu 11 1.2 Tổng quan tảo xoắn Spirulina 13 1.2.1 Phân loại 13 1.2.2 Đặc điểm sinh học 14 1.2.3 Thành phần dinh dưỡng 15 1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris 19 1.3.1 Trên giới 19 1.3.2 Tại Việt Nam 21 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27 2.2 Nội dung nghiên cứu 27 iv 2.3 Vật liệu nghiên cứu 27 2.3.1 Vật liệu vi sinh vật 27 2.3.2 Hóa chất 28 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.5 Phương pháp nghiên cứu 28 2.5.1 Xác định thành phần dinh dưỡng tảo xoắn Spirulina 28 2.5.2 Xác định số đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris Cm3 33 2.5.3 Nhân giống cấp nấm Cordyceps militaris Cm3 môi trường bổ sung tảo Spirulina 35 2.5.4 Nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris Cm3 môi trường chứa nguồn protein từ Spirulina 36 2.5.5 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện ni trồng Cordyceps militaris Cm3 giá thể bổ sung tảo Spirulina 39 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 40 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1 Thành phần dinh dưỡng của tảo xoắn Spirulina 41 3.2 Xác định một số đặc điểm sinh học của chủng Cordyceps militaris Cm3 42 3.2.1 Hình dạng hiển vi 42 3.2.2 Hoạt tính enzyme ngoại bào 44 3.3 Nhân giống cấp nấm Cordyceps militaris Cm3 môi trường dinh dưỡng chứa nguồn protein từ tảo Spirulina 46 3.4 Nghiên cứu sử dụng tảo xoắn thay thành phần nhộng tằm môi trường nuôi cấy nấm ĐTHT 49 3.4.1 Ảnh hưởng hàm lượng tảo xoắn đến khả tạo thể 49 3.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng tảo xoắn đến chất lượng thể 51 3.5 Tối ưu hóa điều kiện ni trồng Cordyceps militaris Cm3 giá thể bổ sung tảo xoắn 55 v 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 55 3.5.2 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa APS Acidic polysaccharide LPS Lipopolysaccharide SBG Ngũ cốc nhà máy bia đã qua sử dụng FIM Môi trường cảm ứng tạo thể W/V Đơn vị phần trăm khối lượng - thể tích vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina (Santillen 1982) 16 Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina (Santillen 1982) 16 Bảng 1.3 Thành phần khoáng của tảo Spirulina (Santillen 1982) 16 Bảng 1.4 Thành phần acid amin tảo Spirulina sp (Santillen 1982) 17 Bảng 2.1 Trị số OD720nm đo được nồng độ Albumin khác 30 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nhân giống cấp nấm Cordyceps militaris Cm3 35 Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi trồng nấm Cordyceps militaris Cm3 37 Bảng 2.4 Nhiệt độ nuôi trồng nấm C militaris Cm3 sinh trưởng giá thể bổ sung tảo Spirulina 39 Bảng 2.5 Thời gian chiếu sáng giàn nuôi trồng nấm C militaris Cm3 sinh trưởng giá thể bổ sung tảo Spirulina 39 Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng tảo xoắn Spirulina sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Cm3 41 Bảng 3.2 Hoạt tính protease, amylase, cellulase ngoại bào của chủng C militaris Cm3 45 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thành phần tảo xoắn Spirulina đến sinh trưởng, phát triển của chủng Cordyceps militaris Cm3 giai đoạn nhân giống cấp 47 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần tảo xoắn Spirulina đến sinh trưởng, phát triển của chủng nấm Cordyceps militaris Cm3 sau 60 ngày nuôi trồng 49 Bảng 3.5 Hàm lượng cordycepin adenosine của thể khô nấm C militaris Cm3 52 Bảng 3.6 Giá thành nguyên liệu sản x́t lít mơi trường dinh dưỡng 54 Bảng 3.7 Chi phí sản xuất kg nấm khô hai nguồn dinh dưỡng: nhộng tằm tảo xoắn Spirulina 54 viii Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phát triển chiều dài thể nấm Cordyceps militaris Cm3 q trình ni trờng 56 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng tới phát triển chiều dài thể nấm C militaris Cm3 q trình ni trờng 57 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris mặt cắt dọc thể chứa bào tử Hình 1.2 Cordyceps militaris tự nhiên Hình 1.3 Hình thái nấm C militaris O sinensis có giá trị dược liệu cao Hình 1.4 Cơng thức hóa học của mợt số loại nucleotide Cordyceps militaris 10 Hình 2.1 Phản ứng màu của Albumin (ở nờng độ khác nhau) với thuốc thử Folin-Ciocalteu 30 Hình 2.2 Đờ thị chuẩn mối tương quan tuyến tính trị số OD720nm nờng đợ Albumin (µg/ml) 31 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái chủng C militaris Cm3 sau 72h nuôi cấy môi trường PDA agar 44 Hình 3.2 Khả sinh enzyme phân giải protein carbohydrate của chủng C militaris Cm3 46 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris Cm3 sau 20 ngày nuôi cấy môi trường nhân giống cấp bổ sung nguồn protein từ tảo Spirulina 48 Hình 3.4 Phơi nấm hình thành giá thể sau 20 ngày ni trờng 50 Hình 3.5 Nấm thành phẩm tạo sau 60 ngày nuôi trồng 51 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt đợ đến kích bật mầm thể sau 15 ngày nuôi trồng 57 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiều dài thể sau 60 ngày nuôi trồng 57 Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến chiều dài thể sau 20 ngày nuôi trồng 59 Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến chiều dài thể sau 40 ngày nuôi trồng 59 64 28 Huang L, Li Q, Chen Y, Wang X, Zho X (2009), Determination and analysis of cordycepin and adenosine in products of Cordyceps spp, African Journal of Microbiology Research, 3: 957-961 29 Huang NL, Lin ZB, Chen GL (2010), Medicinal and edible fungi, Shanghai Scientific and Technological Literature, Shanghai 30 Huang SJ, Tsai SY, Lee YL (2006), Nonvolatile taste components of fruiting bodies and mycelia of Cordyceps militaris, Food Science Technology 39: 577-583 31 Hur H (2008), Chemical Ingredients of Cordyceps militaris, Mycobiology 36(4): 233-235 32 Iamtham S, Kaewkam A, Chanprame S, Pan-utai W (2022), Effect of Spirulina biomass residue on yield and cordycepin and adenosine production of Cordyceps militaris culture, Bioresource Technology Reports 17: 100893 33 Kaewkam A, Sornchai P, Chanprame S, Iamtham S (2021), Utilization of Spirulina maxima to enhance yield and cordycepin content in Cordyceps militaris artificial cultivation, Journal of the International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences, 29: 1-14 34 Kamble, V.R., & Agre, D.G (2012), Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra, Bionano Frontier 5(2):224-225 35 Khandual S, Omar E, Sanchez L, Andrews HE, Rosa JDP (2021), Phycocyanin content and nutritional profle of Arthrospira platensis from Mexico: efcient extraction process and stability evaluation of phycocyanin, BMC Chemistry 15: 1-13 36 Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Nguyen TH, Kim CS, Choi HS, Kim MK, Chun HS, Park Y, Kim SJ (2006), A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps Microbiology 44(6): 622-31 militaris, Journal of 65 37 Kobayasi Y (1982), Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the Mycological Society of Japan 23: 329-364 38 Kwon JS, Lee JS, Shin WC (2009), Optimization of culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides with Cordyceps militaris in liquid culture, Biotechnology and Bioprocess Engineering 14: 756-762 39 Li CR, Nam SH, Geng DG (2006), Artificial culture of seventeen Cordyceps spp, Mycosystema 25: 639-645 40 Li JF, Hoang VA, Ahn JC, Yang DU, Lee DW, Yang DC (2020), Isolation of new strain of Cordyceps militaris HB8 and optimal condition for production of adenosine and cordycepin in fruit body, Korean Journal of Plant Resources, 33(6): 696-706 41 Lim K, Lee CH, Chang E (2012), Optimization of solid state culture condition for the production of adenosine, cordycepin, and d-mannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L Fr.) Link (Ascomycetes), International Journal of Medicinal Mushrooms, 14: 181-187 42 Lin WH, Tsai MT, Chen YS, Hou RC, Hung HF, Li CH, Wang HK, Lai MN, Jeng KC (2007), Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris, The American Journal of Chinese Medicine 35(4): 631-641 43 Liu Y, Wang J, Wang W, Zhang H, Zhang X, Han C (2015), The chemical constituents and pharmacological actions of Cordyceps sinensis, Evid Based Complement Alternat Med: 575063 44 Liu ZY, Yao YJ, Liang ZQ (2001), Molecular evidence for the anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis, Mycological Research 105: 827-832 45 Mains EB (1958), North American entomogenous species of Cordyceps, Mycologia 50: 169-222 66 46 Mizuno T (1999), Medicinal effects and utilization of Cordyceps (Fr.) link (Ascomycetes) and Isaria Fr (mitosporic fungi) Chineese caterpiller fungi, “Tochukaso” (Review), International Journal of Medicinal Mushrooms 1: 251-261 47 Ohta Y, Lee JB, Hayashi K, Fujita A, Park DK, Hayashi T (2007), In vivo anti-influenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated from Cordyceps militaris grown on germinated Soybeans, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 10194-10199 48 Park BT, Na KH, Jung EC, Park JW, Kim HH (2009), Antifungal and anticancer activities of a protein from the mushroom Cordyceps militaris, Korean Journal of Physiol Pharmacology 13(1): 49-54 49 Patel K, Ingalhalli R (2013), Cordyceps militaris (L.: Fr.) link - An important medicinal mushroom, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2: 315-319 50 Paul MK, Paul FC, David WM, Stalpers JA (2008), Dictionary of the fungi; CABI 51 Peterson GL (1977), A simplification of the protein assay method of Lowry et al which is more generally applicable, Analytical Biochemistry83: 346-356 52 Reis FS, Barros L, Calhelha RC, Ćirić A, Griensven JLD, Soković M, Ferreira ICFR (2013), The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties, Food and Chemical Toxicology 62: 91-98 53 Rinawati M, Sari LA, Pursetyo KT (2020), Chlorophyll and carotenoids analysis spectrophotometer using method on microalgae, Earth and Environmental Science 441: 012056 67 54 Sato H, Shimazu M (2002), Stromata production for Cordyceps militaris (Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host insects, Applied Entomology and Zoology 37: 85-92 55 Seulmee S, Sungwon L, Jeonghak K, Sunhee M, Seungjeong L, ChongKil L, Kyunghae C, Nam-Joo H, Kyungjae K (2009), Cordycepin suppresses expression of diabetes regulating genes by inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammation in macrophages, Immune Network 9(3): 98-105 56 Shrestha B, Lee WH, Han SK, Sung JM (2006), Observations on Some of the mycelial growth and pigmentation characteristics of Cordyceps militaris isolates, Mycobiology 34(2): 83-91 57 Shrestha B, Han SK, Yoon KS, Sun JM (2005), Morphological characteristics of conidiogenesis in Cordyceps militaris, Mycobiology 33(2): 69-76 58 Sornprasert R, Kasipar K (2018), The culture of Cordyceps militaris (L.) link with raw egg and hard-boiled egg from poultry, KKU Science Journal, 46 (2), 248-255 59 Stensrud O, Hywel- Jones NL, Schumacher T (2005), Towards a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm divergent lineages and paraphyly, Mycological Research 109: 41-56 60 Stone R (2008), Last stand for the body snatcher of the Himalayas? Science 322: 1182 61 Sung JM, Park YJ, Han SK (2006), Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity, Mycobiology 34: 131-137 62 Tuli HS, Sandhu SS, Sharma AK (2014), Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to cordycepin, Biotech, (1), 1-12 68 63 Vernès L, Abert-Vian M, Maâtaoui ME, Tao Y, Bornard Y, Chemat F (2019), Application of ultrasound for green extraction of proteins from Spirulina Mechanism, optimization, modeling, and industrial, Ultrasonics Sonochemistry 54: 48-60 64 Wang JF, Yang CQ (2006), Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris, Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17: 268-269 65 Jo WS, Choi YJ, Kim HJ, Lee JY, Nam BH, Lee JD, Lee SW, Seo SY, Jeong MH (2010), The anti-inflammatory effects of water extract from Cordyceps militaris in murine macrophage, Mycobiology 38(1): 46-51 66 Wu CY, Liang ZC, Tsang CY, SH (2016), Effects of illumination pattern during cultivation of fruiting body and bioactive compound production by the caterpillar medicinal mushroom, Cordyceps militaris (Ascomycetes) International Journal of Medicinal Mushrooms 18(7): 589-597 67 Wu F, Hui Y., Ma X, Jia J, Zhang G, Guo X, Gui Z (2011), Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris, African Journal of Microbiology Research 5(18): 2743-2751 68 Xie CY, Gu ZX, Fan GJ (2009), Production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture, Applied Biochemistry and Biotechnology 158: 483-492 69 Xie CY, Liu GX, Gu ZX (2009), Effects of culture conditions on mycelium biomass and intracellular cordycepin production of Cordyceps militaris in natural medium, Annua Microbiology 59: 293-299 70 Xiong C, Xia Y, Zheng P, Shi S, Wang C (2010), Developmental stagespecific gene expression profiling for a medicinal fungus Cordyceps militaris, Mycology: An International Journal on Fungal Biology 1(1): 2566 69 71 Yu HM, Wang BS, Huang SC (2006), Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage, Journal of Agriculture and Food Chemistry 54: 3132-3138 72 Zhang Z, Lei Z, Lu Y (2008), Chemical composition and bioactivity changes in stale rice after fermentation with Cordyceps sinensis, Journal of Bioscience and Bioengineering 106: 188-193 73 Zhang Y, Li E, Wang C, Li Y, Liu X (2012), Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology, Mycology 3(1): 2-10 74 Zheng P, Xia YL, Xiao CH (2011), Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine, Genome Biology 23: 1-21 75 Wen TC, Kang JC, Kang C, Hyde KD (2014), Optimization of solid-state fermentation for fruiting body growth and cordycepin production by Cordyceps militaris, Chiang Mai Journal of Science 41, 858-872 PHỤ LỤC Nhân giống cấp nấm Cordyceps militaris Cm3 môi trường dinh dưỡng chứa nguồn protein từ tảo Spirulina F-Test Two-Sample for Variances F-Test Two-Sample for Variances Variable Variable Mean 1.45 1.52 Variance 0.02277778 0.02844444 Observations 10 10 df 9 F 0.80078125 P(F