Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) năng suất và chất lượng cao theo hướng hữu cơ

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại Cordyceps militaris Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung cho nhóm nấm ký sinh thuộc chi nấm Cordyceps gây bệnh trên côn trùng Chi Cordyceps là một trong những chi lớn nhất trong họ Clavicipitaceae Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 750 loài và vô cùng đa dạng về số lượng loài, hình thái và khả năng thích nghi của chúng trên các vật chủ khác nhau (Kim et al., 2010; Sung et al.,

2011) Các loài đa dạng này được tìm thấy chủ yếu ở các nước châu Á (như Hàn Quốc, Nhật Bản, Nepal, Trung Quốc) và các nơi khác trên thế giới trong môi trường sống nhiệt đới và ôn đới ẩm Sự xuất hiện của nhiều loài trong các điều kiện môi trường khác nhau trên khắp thế giới cho thấy sự phân bố toàn cầu của chúng Trong đó, loài C militaris là một trong những loài phổ biến nhất và đượcCarl Linnaeusmô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982)

Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, loài

C militaris được phân loại như:

Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris ở ngoài tự nhiên (A) và nuôi trồng (B)

(Nguồn: Abdul et al., 2022) 1.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm Cordyceps militaris

Nấm C militaris là một loại nấm ký sinh, có màu cam, chiều dài 8 - 10 cm được tìm thấy trên bướm và sâu bướm Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa (Hı̀nh 1.2) Các nang bào tử dài từ 300 - 510

𝜇𝑚, bề rộng 4 𝜇𝑚 Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích ̣ thước 3,5 - 6 × 1 - 1,5 𝜇𝑚 Trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, các nang bào tử sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp (Nguyễn Thi Liên Thương và đồng tác giả, 2016)

Hình 1.2 Nấm C militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử

Nghiên cứu về phân lập giống của các tác giả đã cho thấy: Mật độ tơ C militaris có sự khác biệt đáng kể trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau,

Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

2012) Các quan sát cho thấy màu sắc của khuẩn lạc có thể thay đổi từ trắng, vàng, cam nhạt đến cam tùy theo thành phần môi trường dinh dưỡng và việc bổ sung pepton và cao nấm men có thể làm cho khuẩn lạc có màu sắc đậm hơn (Shrestha et al., 2012)

1.1.3 Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris

Tương tự như hầu hết các loài Cordyceps khác, nấm C militaris là một loại nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này thường lây nhiễm vào giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau và phát triển trong cơ thể chủ vào mùa đông Bào tử của nấm được dính vào bên ngoài cơ thể ký chủ bởi gió, sau đó tạo thành các ống nảy mầm có các thể bám Những ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease để tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó, hệ sợi nấm hút chất dinh dưỡng từ ký chủ và phát triển mạnh mẽ, chiếm toàn bộ cơ thể và gây tử vong cho ký chủ Vào cuối mùa hè hoặc thu, quả thể nấm sẽ nẩy ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí (Kamble và Agre, 2012) Quả thể của nấm C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu cam (Zheng et al., 2011)

Nấm C militaris có các hình thái bào tử khác nhau trong chu trình sống của chúng Tùy thuộc vào điều kiện môi trường thì sự hình thành các dạng bào tử cũng thể hiện sự đa dạng, ví dụ như việc hình thành bào tử tròn trên môi trường rắn hoặc các chồi bào tử trên môi trường lỏng (Nguyễn Ngọc Trai, 2017; Nguyễn Thi Liên Thương và đồng tác giả, 2016)

1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng nấm C militaris có hoạt động sinh học đa dạng đáng kể hơn so với nấm C sinensis Các hiệu quả của C militaris đã được chứng minh bao gồm: Tăng cường năng lượng, kích thích hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư, chống oxy hóa, giảm viêm, kháng lại virus, bảo vệ hệ thần kinh và điều hòa đường huyết (Tuli et al., 2014; Zhang et al., 2019)

Chống mệt mỏi: Hoạt động giảm cảm giác mệt mỏi có tương quan với tác dụng tăng cường sức khỏe, tức là cải thiện hiệu suất thể chất Cordycepin là một hợp chất có hoạt tính sinh học chính trong nấm C militaris, có khả năng tác động tích cực đến sức khỏe Hoạt động sinh học của cordycepin liên quan đến chức năng sinh lý của nó như là tiền chất gián tiếp của ATP và NO (Tuli et al., 2014; Qin et al., 2019) Mặc khác, cordycepin có tác dụng tương tự như creatine, là một chất tiền tố của ATP Có nhiều bằng chứng khoa học cho thấy creatine có tác dụng hỗ trợ hoạt động sinh học, giúp tăng hiệu suất cơ thể trong các bài tập luyện tập cường độ cao và ngắn hạn liên tiếp (Maughan et al., 2018) Một nghiên cứu trên một nhóm 11 nam vận động viên đã chứng minh rằng việc sử dụng 400 mg cordycepin mỗi ngày đã giúp cải thiện hiệu suất thể chất, cũng như tăng cường tiêu thụ oxy và năng lượng trong các bài tập thân dưới (Freitas et al., 2019)

Hoạt động kích thích miễn dịch: Chiết xuất từ nấm C militaris chứa hàm lượng cordycepin đã được chứng minh có tác dụng kích thích hệ miễn dịch trên đại thực bào của chuột Cơ chế hoạt động kích thích miễn dịch của cordycepin trong ĐTHT C militaris dựa trên sự kích hoạt của đại thực bào để tạo ra NO và các cytokine tiền viêm IL-1β, IL-6, TNF-α và prostaglandin-2 (PGE2), cũng như sự gia tăng hoạt động của enzyme tổng hợp oxit nitric cảm ứng (iNOS) và cyclooxygenase-2 (COX-2) Sự kích thích của đại thực bào để tạo ra các chất trung gian gây viêm là do sự kích hoạt yếu tố phiên mã hạt nhân (NF-κB) của C militaris /cordycepin (Tuli et al., 2014; Qin et al., 2019) Trong các nghiên cứu trên nam giới trưởng thành khỏe mạnh được bổ sung 1,5 g/ngày từ C militaris (dạng viên nang) trong 4 tuần, người ta nhận thấy hoạt động kích thích miễn dịch được tăng cường do sự gia tăng nồng độ IL-2, IL-12, NK, TNF-α và IFN-γ (Kang et al., 2015)

Hoạt động chống ung thư: các tác giả đã chứng minh rằng chiết xuất nước từ C militaris ức chế sự tăng sinh và gây ra apoptosis trong tế bào ung thư phổi ở người Hoạt tính chống ung thư của C militaris có liên quan đến sự gia tăng hoạt động enzyme của caspase-3, caspase-8 và caspase-9, cũng như ức chế enzyme telomerase Nghiên cứu báo cáo sự gia tăng nồng độ của protein Fas, loại protein có liên quan đến “thụ thể tử vong” của tế bào ung thư (Park et al., 2009) Hoạt chất Cordycepin và ergosterol có trong nấm C militaris đã được chứng minh có khả năng chống tăng sinh tế bào ung thư ruột kết ở người (Rao et al., 2010) Các nghiên cứu gần đây cho thấy cordycepin đã ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ung thư bàng quang (Lee et al., 2010), ung thư gan ở người (Rao et al., 2010) Trong một nghiên cứu khác, polysaccharide CMPS-II được chiết xuất từ C militaris đã được chứng minh là có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi (Liu et al., 2019)

Hoạt động chống oxy hóa: Khả năng chống oxy hóa đã được xác định chủ yếu đối với các polysaccharide có trong nấm C militaris (He et al.,

2013) Hoạt tính chống oxy hóa của C militaris cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các thành phần hóa học khác có trong quả thể, ví dụ như ergothioneine, hợp chất phenolic, carotenoids và selen (Cohen et al., 2014; Chan et al., 2015.)

Hoạt động chống viêm: Trong nghiên cứu về viêm do lipopolysacarit

(LPS) gây ra trong đại thực bào, cordycepin đã được phát hiện là làm giảm biểu hiện của TNF-α, COX-2, iNOS và NF-κB (Kim et al., 2006) Trong nghiên cứu in vivo của Won và Park (2005), đã xác định về khả năng của cordycepin có trong sợi nấm C militaris trong việc ức chế hoạt động của iNOS và làm giảm nồng độ NO trong phản ứng viêm, nghiên cứu cũng chứng minh hoạt động giảm đau Mặc khác, các thử nghiệm in vitro, hoạt tính chống viêm của C militaris được xác nhận là do ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm, cụ thể là NO, TNF-α và IL-6, được tạo ra bởi LPS trong đại thực bào ở chuột (Jo et al., 2010)

Hoạt động trị tiểu đường: Trong các thí nghiệm trên chuột, các nhà khoa học phát hiện chiết xuất C militaris có ảnh hưởng đến việc sử dụng glucose của các mô và làm giảm tình trạng kháng insulin và hoạt tính hạ đường huyết của chiết xuất C militaris có chứa polysaccharides đã được chứng minh (Zhang et al., 2019) Các nghiên cứu khoa học hiện nay cũng chỉ ra tiềm năng của cordycepin trong điều trị bệnh tiểu đường nhờ điều hòa biểu hiện các protein gan như Nfat3, Flcn và Psma3 Những protein này có tương quan với việc tạo ra năng lượng (ATP), đường truyền tín hiệu AMPK và hệ thống proteasome ubiquitin (UPS) (Leu et al., 2011)

Hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus: Cordymin là một peptide được chiết xuất từ nấm C militaris Hợp chất này đã được chứng minh là có hoạt tính kháng nấm và kháng virus trong các thử nghiệm in vitro Cordymin ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm khác nhau, bao gồm Bipoleis maydis và Candida albicans và cũng ức chế sao chép ngược của virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) (Wong et al., 2011) Bên cạnh đó, các nghiên cứu in vitro đã chứng minh hoạt tính kháng virus của cordycepin và các dẫn xuất của nó Hoạt tính kháng virus đã được xác nhận đối với virus cúm, virus Epstein-Barr (EBV), virus herpes simplex (HSV) và

HIV Cơ chế hoạt động kháng virus của cordycepin có liên quan đến sự ức chế sao chép ngược và RNA polymerase của virus (Charubala et al., 1989;

Tác dụng đối với hệ thống nội tiết: Hoạt chất có trong nấm C militaris đã được chứng minh là có tác dụng kích thích hoạt động nội tiết tố và sự gia tăng nồng độ testosterone đáng kể trong huyết tương ở loài gặm nhấm (Hong et al., 2011) Cordycepin đã được cho là có tác dụng kích thích quá trình tạo steroid ở loài gặm nhấm và tăng nồng độ testosterone và progesterone (Leu et al., 2011)

Tác dụng đối với hệ hô hấp: Một số hiệu quả tốt của C militaris đã được chứng minh trong điều trị viêm phế quản mãn tính (Cai et al., 2004; Gai et al., 2004) Các thí nghiệm in vitro cho thấy cordycepin từ nấm C militaris ảnh hưởng đến việc vận chuyển các ion natri, kali và clorua trong tế bào biểu mô của đường hô hấp (Yue et al., 2008)

Tác dụng đối với hệ thống vận động: Những lợi ích tiềm năng của nấm

C militaris trong điều trị bệnh loãng xương đang được quan tâm Một thí nghiệm in vitro cho thấy C militaris ức chế sự biệt hóa tế bào xương và làm giảm sự biểu hiện của gen mã hóa quá trình này (Choi et al., 2012) Người ta đã chứng minh rằng cordycepin thể hiện hoạt động chống viêm trong tế bào sụn viêm xương khớp ở người Cordycepin ức chế sản xuất PGE2 và NO, đồng thời làm giảm biểu hiện của NF-κB do IL-1β gây ra (Ying et al., 2014)

Tác dụng đối với hệ thần kinh: Tác dụng bảo vệ thần kinh của cordycepin đã được xác nhận trong một nghiên cứu in vitro trên tế bào microglia của chuột thì đối với tế bào thần kinh phụ thuộc vào hoạt động chống viêm (Jeong et al., 2010) hoặc hoạt động chống oxy hóa (He et al.,

Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong nước về nấm Cordyceps

Hợp chất hoạt tính sinh học Thể sợi Quả thể Nguồn

Vitamin A 100,0 mg/kg 96,0 mg/kg (Chan et al., 2015) Vitamin E 1,30 mg/kg 3,60 mg/kg (Chan et al., 2015) Vitamin B2 0,32 mg/kg 0,16 mg/kg (Chan et al., 2015) Vitamin B3 15,20 mg/kg 4,90 mg/kg (Chan et al., 2015) Vitamin C Không phát hiện < 2 mg/kg (Chan et al., 2015)

Magnesium 3.414,0 mg/kg 4.227,0 mg/kg (Chan et al., 2015) Sulfur 2.558,0 mg/kg 5.088,0 mg/kg (Chan et al., 2015) Potassium 12,183 mg/kg 15,938 mg/kg (Chan et al., 2015) Selenium < 0,50 mg/kg 0,4 mg/kg (Chan et al., 2015) Iron 9,0 mg/kg 31,0 mg/kg (Chan et al., 2015) Calcium 11,0 mg/kg 797,0 mg/kg (Chan et al., 2015) Zinc 10,0 mg/kg Không phát hiện (Chan et al., 2015)

Protein Không phân tích 29,7% (Cohen et al., 2014)

Fat Không phân tích 2,9% (Cohen et al., 2014)

Carbohydrate Không phân tích 54,3% (Cohen et al., 2014)

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong nước về nấm Cordyceps militaris

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, đã có rất nhiều tác giả ở ngoài nước nghiên cứu nuôi trồng, tách chiết hoạt chất và thử nghiệm lâm sàng dịch chiết từ nấm ĐTHT đối với một số bệnh lý ở người; các công trình nghiên cứu liên quan đến nấm ĐTHT được đăng trên các tạp chí uy tín Trong đó, loài ĐTHT C militaris được nhiều nhà khoa học nhận định dễ nuôi cấy trong cả môi trường lỏng và môi trường rắn với nhiều nguồn carbon hay nito khác nhau Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng loài C militaris chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, có tiềm năng dược liệu như cordycepin, ergosterol, mannitol và nhiều loại poly saccharide có tác động đến nhiều hệ cơ quan trong cơ thể và phòng chống nhiều bệnh nên đã được sử dụng với nhiều mục đích chữa trị khác nhau Đây là lý do mà nấm ĐTHT C militaris được lựa chọn để sử dụng rộng rãi và phổ biến

Bên cạnh đó, những nghiên cứu về đa dạng di truyền bằng việc giải trình tự vùng ITS giữa các dòng C militaris được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau được sử dụng để nuôi trồng Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm C militaris được phân lập từ Anh,

Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Na Uy là rất nhỏ và không tương quan với điều kiện địa lý (Wang et al., 2008) Nghiên cứu về hệ gen của nấm C militaris, Zheng et al., (2011) cho thấy rằng bộ gen của nấm C militaris không chứa các gen mã hóa ra các chất độc tương tự các loài nấm gây độc cho con người

Do tính chuyên biệt cao đối với ký chủ và bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường sống nên loài C militaris rất khó tìm thấy trong tự nhiên Do đó việc nuôi cấy loài này nhằm thu sinh khối sợi, quả thể và các thành phần có hoạt tính sinh học đã thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các thành phần có hoạt tính sinh học thu được giữa các dòng

C militaris ngoài tự nhiên và được nuôi trồng là tương tự nhau (Tong et al.,

1997, Wang et al., 2012b) Hiện nay, có ba phương pháp chính phổ biến để nuôi cấy nấm C militaris: nuôi trồng trên môi trường rắn để thu quả thể nấm; nuôi cấy ngập chìm trong môi trường lỏng để thu sinh khối hệ sợi và nuôi cấy trên các loại ký chủ (nhộng, tằm, sâu gạo )

Năm 2001, Park et al đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ cấp giống đến sinh khối sợi và khả năng đồng hóa các chất của nấm ĐTHT C militaris Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tuổi giống và tỷ lệ giống cấy dường như không hoặc ít có ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp các polysacharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm ĐTHT

Nuôi cấy nấm ĐTHT trên môi trường rắn nhân tạo thì nguồn nitơ đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi và hình thành quả thể nấm Shrestha et al., (2004) đã sử dụng hỗ hợp gạo trộn với nhộng Tằm làm môi trường để nuôi trồng nấm C militaris, cho thấy là cơ chất tốt nhất cho nuôi trồng nấm C militaris

Hung et al., (2009), cho rằng sự phát triển của sợi nấm C militaris mạnh nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 20 o C và sinh trưởng thấp nhất khi nuôi cấy ở 30 o C Nhiệt độ cao (lớn hơn 30 o C sợi nấm chìm trong dịch dinh dưỡng không có khả năng phát triển lên bề mặt) Đồng thời các chủng C militaris có khả năng tổng hợp chất cordycepin cao nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 25 o C Giá trị pH tối ưu là hơi acid từ 6 đến 8 (Shrestha et al., 2012)

Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm C militaris của Wen et al., (2014), trên các loại gạo khác nhau và cho thấy năng suất nuôi quả thể lớn nhất thu được khi sử dụng gạo nâu không trơn bóng Bên cạnh đó, một số chất hữu cơ khác cũng có thể được sử dụng để nuôi trồng C militaris bao gồm: đậu tương, hạt ngô, vỏ bông, lúa mì, hoa hướng dương

Trong nghiên cứu về nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành quả thể nấm C militaris Khoảng nhiệt độ tối ưu nhất được xác định là 18 - 22 o C Ngưỡng nhiệt độ thấp hơn 14 - 17 o C vẫn có khả năng hình thành hình thành quả thể nấm nhưng thời gian nuôi trồng kéo dài hơn (Du et al., 2010) Sato và Shimazu (2002), cũng cho rằng giai đoạn sinh trưởng của quả thể C militaris nuôi trồng ở nhiệt độ 25 o C ngắn hơn quả thể nuôi trồng ở 20 o C

Hong et al., (2010), đã báo cáo về sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng tới hình thành và phát triển mầm quả thể nấm ĐTHT C militaris như sau: Tại cường độ ánh sáng 100 lux mầm quả thể hình thành ở tất cả các công thức thí nghiệm, trung bình 6,1 mầm/cá thể nhộng, chiều dài quả thể ngắn (37,7 mm), đường kính quả thể nhỏ (2,51 mm) Trong điều kiện ánh sáng 500 lux, quá thể được hình thành dài hơn và dày hơn, chiều dài từ 69,5 ± 3,95 mm, đường kính quả thể 3,10 ± 0,63 mm Cường độ ánh sáng 1000 lux, mức độ biến động về số lượng mầm quả thể cao hơn (từ 1 - 10 mầm/nhộng), quả thể dài hơn nhưng đường kính quả thể nấm giảm Phần lớn những nghiên cứu thu được khoảng cường độ ánh sáng tối thích để hình thành thể nền là 500 - 1.000 lux (Du et al., 2010)

Kết quả nghiên cứu được thực hiện của Wen et al., (2014), cho thấy để kích thích sự hình thành quả thể nấm C militaris nuôi trên môi trường rắn, sau khi nấm lan tơ kín môi trường, các hộp nuôi nấm được đưa vào điều kiện

23 o C, 500 lux vào ban ngày và 16 o C tối hoàn toàn vào ban đêm thì nấm sẽ hình thành quả thể sau 12 - 15 ngày sau khi chuyển vào điều kiện này Bên cạnh đó nghiên cứu của ông cũng chỉ ra rằng thành phần môi trường tối ưu cho sự hình thành quả thể là môi trường gạo lức được bổ sung 40 g/l glucose,

5 g/l peptone, 1,5 g/l MgSO 4 7H 2 O, 1,5 g/l KH 2 PO 4 và 1,0 mg/l NAA và môi trường tối ưu tạo ra Cordycepin là gạo lức bổ sung 10 g/l glucose, 10g/l peptone, 1,0 g/l MgSO4.7H2O, 1,0 g/l KH2PO4 và 1,0 mg/l NAA

Gan lợn có nhiều protein, vitamin và adenosine, những thành phần này có thể làm tăng sản xuất cordycepin và chuyển hóa sinh học trong quá trình

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên môi trường hoàn toàn hữu cơ và ký chủ Tằm dâu nguyên con có năng suất và chất lượng cao phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm nấm ĐTHT hữu cơ

- Xác định được kỹ thuật khử trùng mẫu và nhân giống nấm cấp 1 trên môi trường hữu cơ

- Xác định được môi trường lỏng hữu cơ thích hợp cho nhân giống nấm cấp 2

- Xác định được môi trường dinh dưỡng rắn hữu cơ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển quả thể nấm

-Xác định được kỹ thuật nuôi phát triển quả thể nấm trên ký chủ Tằm dâu nguyên con hấp vô trùng

- Đánh giá được năng suất quả thể nấm nuôi trồng trên môi trường hữu cơ và trên tằm dâu nguyên con hấp vô trùng

- Đánh giá được hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine ở các giai đoạn sinh trưởng, phát triển quả thể nấm được nuôi trên môi trường hữu cơ và trên ký chủ tằm dâu nguyên con hấp vô trùng.

Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm Cordyceps militaris NBRC9787 được cung cấp bởi Trung tâm Tài Nguyên Sinh Học NITE (NBRC), Nhật Bản

- Phạm vi về nội dung: Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng nấm ĐTHT C militaris trên môi trường hữu cơ và ký chủ Tằm dâu nguyên con;

- Phạm vi về không gian: Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng nấm được thực hiện tại Công ty Cổ phần dược liệu Hataco Việt Nam và các thí nghiệm phân tích hoạt chất được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, thị trấn Xuân Mai, Huyện Chương Mỹ, Thành phố Hà Nội;

- Phạm vi về thời gian: Từ tháng 10/2022 đến 10/2023

- Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật khử trùng mẫu, độ tuổi quả thể đến nhân giống cấp 1

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần hữu cơ trong môi trường lỏng đến hiệu quả nhân giống cấp 2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần hữu cơ trong môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển quả thể nấm

- Nghiên cứu nuôi trồng trên ký chủ Tằm dâu nguyên con hấp vô trùng

- Đánh giá năng suất quả thể nấm nuôi trồng trên môi trường hữu cơ và trên Tằm dâu nguyên con hấp vô trùng

- Phân tích hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine ở các giai đoạn sinh trưởng, phát triển quả thể nấm trên môi trường hữu cơ và trên ký chủ Tằm dâu nguyên con hấp vô trùng.

Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Chủng nấm Cordyceps militaris

- Quả thể chủng nấm Cordyceps militaris NBRC9787 có nguồn gốc từ Trung tâm tài Nguyên sinh học NITE (NBRC) của Nhật Bản, được cung cấp bởi Công ty CP Dược liệu Hataco Việt Nam

- Nhộng và Tằm dâu chín cấp đông được cung cấp bởi các cơ sở sản xuất dâu tằm, tỉnh Thái Bình

- Đuông dừa làm vật liệu thí nghiệm, được nuôi tại Công ty Cổ phần Dược liệu Hataco Việt Nam

- Gan Lợn, khoai tây tươi, giá đỗ tươi,hành tây tươi, cà rốt tươi, súp lơ tươi, nước dừa được cung cấp bởi siêu thị Lan Chi, chi nhánh Xuân Mai

- Các chất hữu cơ Pepton, cao nấm men, vitamin B1, inositol và agar

2.3.3 Các chất đa lượng và hóa chất phân tích

- Các loại muối khoáng đa lượng KH2PO4, Mg2SO4, cồn 90 o

- Hóa chất phục vụ phân tích: Ethanol, nước cất đề ion, methanol (CH3OH), chất chuẩn adenosine (C10H13N5O4), chất chuẩn Cordycepin (C10H13N5O3)

2.3.4 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Tại công ty Cổ phần Dược liệu Hataco Việt Nam, sử dụng trang thiết bị; máy móc gồm: Nồi hấp khử trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, máy tạo ẩm, đĩa peptri, tủ lạnh, cân điện tử, máy sấy thăng hoa, thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm, chai lọ, bình thủy tinh, hộp nhựa nuôi cấy…

- Tại viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, sử dụng trang thiết bị; dụng cụ gồm: Cân điện tử, máy siêu âm, bể ổn nhiệt, máy ly tâm, máy phân tích HPLC hiệu năng cao

Sơ đồ tổng quát thực hiện cho các nội dung nghiên cứu như sau:

Phương pháp nghiên cứu

độ tuổi quả thể nấm được phân lập đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

2.4.1.1 Khảo sát nồng độ cồn và thời gian khử trùng quả thể nấm đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm

Thí nghiệm 2 nhân tố, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại 9 nghiệm thức, mỗi thí nghiệm khảo sát 3 mẫu Trong đó, yếu tố A là thời gian khử trùng (30s, 60s, 90s), yếu tố B là nồng độ ethanol (50%, 60%, 70%)

Quả thể nấm C.militaris trong phòng thí nghiệm

Hệ sợi C.militaris sau khi phân lập

Hệ sợi C.militaris sau khi nhân giống cấp 1

Sinh khối hệ sợi sau nhân giống cấp 2

Cơ chất tổng hợp, ký chủ tằm đã cấy giống và ủ tối

Nuôi trồng tạo quả thể

- Đo đường kính khuẩn lạc

- Quan sát đặc điểm hệ sợi

- Đo đường kính khuẩn lạc

- Quan sát đặc điểm hệ sợi

- Quan sát đặc điểm hệ sợi sau ủ tối

- Thời gian ra quả thể

2.4.1.2 Khảo sát độ tuổi quả thể nấm phân lập đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm

Kế thừa kết quả thí nghiệm 2.4.1.1, tiến hành khảo sát độ tuổi quả thể nấm phân lập

Thí nghiệm 1 nhân tố với 3 lần lặp lại 4 nghiệm thức, mỗi thí nghiệm khảo sát 5 mẫu, với các độ tuổi quả thể 25, 30, 35, 40, 45 ngày tuổi

- Phương pháp thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA: 200 g khoai tây, 20 g dextrose, 20 g agar, 1.000 ml nước cất. Môi trường được thanh trùng ở nhiệt độ 121 o C trong 30 phút sau đó, chia vào các đĩa petri đã thanh trùng 20 ml/đĩa trong box cấy vô trùng

- Phương pháp phân lập mẫu:

+ Khử trùng mẫu: Lựa chọn mẫu không bị mốc, nhiễm khuẩn với độ tuổi quả thể 25, 30, 35, 40, 45 ngày tuổi, Cho mẫu vào ống fancol 50 ml, dùng ethanol 50%, 60%, 70% lắc trong các mốc thời gian lần lượt 30s, 60s, 90s Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng i từ 2 - 3 lần để loại bỏ ethanol.Dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô bề mặt, tiếp đó bóc bỏ lớp vỏ quả thể ở bên ngoài bằng dao mổ và panh;

+ Cắt mẫu: Dùng dao mổ, cắt ngang quả thể thành nhiều mảnh nhỏ có kích thước từ 1,5 - 2 mm;

+ Cấy mẫu:Mỗi đĩa petri cấy 1 mẫu vào giữa đĩa Trên mỗi đĩa petri có ghi tên mẫu và ngày phân lập Sau khi cấy, dùng parafilm hàn kín miệng đĩa để giữ mẫu luôn trong điều kiện vô trùng;

+ Nuôi mẫu: Mẫu được nuôi trong điều kiện không có ánh sáng, nhiệt độ 22 o C, trong 15 ngày trên các giàn giá nuôi trồng

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ mẫu không nhiễm trên tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu/đĩa);

+ Tỷ lệ mẫu sống (mẫu/đĩa);

+ Thời gian xuất hiện tơ nấm: Được tính từ ngày đầu tiên khi tơ nấm bắt đầu phát triển (cm/ngày);

+ Màu sắc: Được theo dõi từ khi tơ nấm bắt đầu phát triển đến hết ngày thứ 15;

+ Đường kính khuẩn lạc (cm) màu sắc khuẩn lạc: Sau 5, 10 và 15 ngày nuôi cấy sẽ ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc bằng cách lấy trung bình đường kính trên 2 trục của khuẩn lạc theo công thức: d = (d1+d2)/2 Trong đó: d1 và d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố

2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris (giống cấp 2)

Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 5 công thức (CT), mỗi CT khảo sát 5 mẫu, tổng số mẫu là 75 mẫu

- CT1 (đối chứng): 100 g/l khoai tây + 0,5 g/l KH2PO4 + 1 g/l MgSO4 + 0,1 g/l vitamin B1 + 20 g/l glucose + 5 g/l pepton + 5 g/l cao nấm men

- CT2: 30 g/l glucose + 5 g/l cao nấm men + 10 g/l pepton + 0,5 g/l vitamin B1 + 200 ml/l dịch chiết M

Ghi chú:Dịch chiết M gồm 200 g/l dịch chiết giá đỗ + 200 ml/l nước dừa + 300 g/l dịch chiết khoai tây, 10 g/l dịch chiết hành tây + 10 g/l dịch chiết cà rốt + 10 g/l dịch chiết súp lơ

Chuẩn bị nguyên liệu và pha môi trường theo các công thức ở trên Môi trường sau khi pha xong, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 1N vào môi trường, chuẩn pH bằng giấy quỳ cho đến khi đạt từ 6,0 - 6,5, chia vào các bình thủy tinh có nút bông (thể tích môi trường 300 ml) và hấp khử trùng ở nhiệt độ

121 o C, thời gian 30 phút Khi môi trường nguội, xếp các bình thủy tinh đựng môi trường vào tủ cấy, bật đèn UV trong 30 phút Sau đó, dùng que cấy lấy giống cấp 1 (sử dụng kết quả phân lập ở thí nghiệm 2.4.1) cho vào bình môi trường lỏng và nuôi lắc 120 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 22 o C, độ ẩm 60%, nuôi tối hoàn toàn Sau 7, 8, 9, 10 ngày, hệ sợi phát triển dày đặc trong môi trường lỏng thì tiến hành phân tích và xử lý số liệu

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (mẫu/bình);

- Tỷ lệ mẫu sống (mẫu/bình);

- Thời gian xuất hiện cầu nấm (ngày);

- Kích thước cầu nấm: Lấy ngẫu nhiên 3 cầu nấm/chai môi trường tiến hành đo sau 10 ngày cấy giống (mm/cầu);

- Giá trị OD với bước sóng 600 nm đo với các dung dịch hệ sợi nấm nuôi sau 7, 8, 9, 10 ngày…

2.4.3 Nghiên cứu xác định môi trường rắn hữu cơ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin của nấm Cordyceps militaris

Thí nghiệm 1 yếu tố được bố với 3 lần lặp lại, 21 NT, mỗi NT khảo sát

15 mẫu, tổng số mẫu khảo sát là 945 mẫu

2.4.3.1 Thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng nhộng tằm dâu đến sinh trưởng, phát triển sinh khối hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin nấm Cordyceps militaris

- NT1 (đối chứng): 50 g/l khoai tây + 400 g/l nhộng tằm + 30 g/l đường glucose + 5 g/l pepton + 5 g/l cao nấm men + 1 g/l KH2PO4 + 1 g/l MgSO4 + 0,5 g/l vitamin B1 + 0,3 g/l inositol

- NT2: Môi trường lỏng tốt nhất ở thí nghiệm 2.4.2 + 0,3 g/l inositol +

2.4.3.2 Thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng tằm dâu đến sinh trưởng, phát triển sinh khối hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin

2.4.3.3 Thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng Đuông dừa đến sinh trưởng, phát triển sinh khối hệ sợi, quả thể, năng suất sinh học và hàm lượng adenosine, cordycepin

2.4.3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng gan Lợn đến sinh trưởng, phát triển sinh khối hệ sợi, quả thể,năng suất sinh học và hàm lượng Adenosine, Cordycepin

- NT17: Môi trường lỏng tốt nhất ở thí nghiệm 2.4.2 + 0,3 g/l inositol + (kế thừa tốt nhất ở các NT trên) g/l nhộng Tằm + 5 g/l gan Lợn khô

Môi trường giá thể rắn gồm: 40 g gạo Lứt/gạo Liên Hương (2:1) pha với 55 ml dung dịch dinh dưỡng khác nhau ở trên, đựng trong hộp nhựa 700 ml Sau đó, hấp khử trùng ở 121 o C trong 30 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng trước khi được bơm 10 ml dung dịch giống (sử dụng dịch giống tốt nhất ở thí nghiệm 2.4.2) Nấm sau khi cấy trên các loại môi trường trên thì được chuyển vào nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng nuôi 21 o C, độ ẩm 60% để phát sinh sợi nấm Sau 5 ngày, các hộp nấm có hệ sợi phát triển kín bề mặt và ăn kín ít nhất 2/3 đáy được chuyển sang nuôi sáng với thời gian chiếu sáng 12h, nhiệt độ 22 o C, độ ẩm 85%, cường độ ánh sáng 700 Lux để tạo quả thể

* Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ mẫu nhiễm, không nhiễm: Tiến hành đo đếm sau khi cấy giống

- Tỷ lệ mẫu có hệ sợi lan tơ bề mặt 100%

- Thời gian lan tơ: Khi tơ nấm bắt đầu ăn tơ đến khi phủ kín bề mặt môi trường (ngày)

- Thời gian xuất hiện quả thể sau chiếu sáng: Được tính khi có hộp đầu tiên ở mỗi nghiệm thức có mầm quả thể bằng ngòi bút nhú lên từ môi trường (ngày)

- Màu sắc và hình thái của quả thể

-Chiều dài quả thể: Là chiều dài được tính từ bề mặt cơ chất đến đỉnh của quả thể (cm)

- Đường kính quả thể: Dùng thước panme để đo (mm)

+Tổng số quả thể sau thu hoạch chiều cao > 3 cm (quả thể/hộp);

+ Khối lượng sinh khối tươi, khô khi cắt bỏ phần giá thể sau 55 ngày nuôi (g/hộp);

+Chỉ tiêu năng suất sinh học (BE), được tính theo công thức:

2.4.4 Phương pháp nuôi trồng, đánh giá năng suất, hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được cấy bằng dung dịch giống lỏng hữu cơ trên ký chủ Tằm dâu nguyên con

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố với 3 lần lặp Dựng xi lanh nhỏ chia vạch đến 30 àl hỳt dung dịch giống nấm và tiờm vào phần đầu con tằm với 6 mức thể tớch tiờm khỏc nhau: 30 àl, 60 àl, 90 àl,

Việc gây nhiễm và nuôi tạo quả thể nấm C militaris trên ký chủ Tằm dâu nguyên con đã thực hiện theo phương theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Hữu Dũng (2020) và Hoàng Phương Ly (2023) với một số biến đổi để phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm

Sử dụng dịch giống lỏng tốt nhất ở kết quả thí nghiệm 2.4.2,được đánh tơi hệ sợi bằng xi lanh

Chuẩn bị Tằm dâu để hấp khử trùng: Tằm dâu cấp đông trong tủ lạnh, được lấy ra cho vào hộp nhựa chứa khoảng 400 ml nước lọc và hấp vô trùng ở điều kiện 121 0 C, trong thời gian 30 phút; sau khi hấp vô trùng đặt các hộp nhựa chứa tằm vào tủ cấy, khoảng 4 giờ cho tằm nguội lạnh, bật đèn UV trong tủ cấy 30 phút, sau đó tắt đen UV và bật quạt gió trong tủ cấy Gây nhiễm nấm vào giá thể Tằm dâu nguyên con bằng phương pháp tiêm 30 - 180 àl dung dịch giống nấm vào phần đầu con tằm, sau khi tiờm xong đặt luụn vào hộp nhựa chứa ống hút đen và có lót một lớp giấy thấm khử trùng bên dưới Sau đó nuôi tối 12 ngày, ở điều kiện nhiệt độ 22 0 C, độ ẩm 60% cho phát triển hệ sợi nấm Sau 12 ngày nuôi tối, tiến hành nuôi sáng ở nhiệt độ phòng nuôi 22 0 C, độ ẩm 85 - 90%, cường độ ánh sáng đèn Led trắng 700 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày

- Thời gian lan tơ: Khi tơ nấm bắt đầu ăn tơ đến khi phủ kín bề mặt ký chủ Tằm dâu (ngày)

Phương pháp xử lý và phân tích số liệu

3.1 Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian khử trùng và độ tuổi phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

3.1.1 Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian khử trùng đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của nấm Cordyceps militaris Đề tài tiến hành khảo sát các mức nồng độ ethanol khử trùng 50 o , 60 o và 70 o ở ba mốc thời gian 30s, 60s và 90snhằm xác định được mức nồng độ và khoảng thời gian khử trùng tối ưu trong phân lập giống nấm C militaris

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris cấp 1 ở các mức nồng độ ethanol và thời gian khử trùng mẫu khác nhau

Thời gian xử lý (s) Đường kính khuẩn lạc nấm sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (cm) Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian khử trùng và độ tuổi phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps

độ tuổi phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

3.1.1 Kết quả sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian khử trùng đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của nấm Cordyceps militaris Đề tài tiến hành khảo sát các mức nồng độ ethanol khử trùng 50 o , 60 o và 70 o ở ba mốc thời gian 30s, 60s và 90snhằm xác định được mức nồng độ và khoảng thời gian khử trùng tối ưu trong phân lập giống nấm C militaris

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris cấp 1 ở các mức nồng độ ethanol và thời gian khử trùng mẫu khác nhau

Thời gian xử lý (s) Đường kính khuẩn lạc nấm sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (cm) Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày

Ethanol 50% trong 30s Ethanol 50% trong 60s Ethanol 50% trong 90s

Hình 3.1 Đường kính khuẩn lạc sau 15 ngày phân lập

Dựa vào kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy:Khi xét yếu tố thời gian khử trùng mẫu với 30s, 60s, 90s thì 30s đạt đường kính trung bình khuẩn lạc là 1,24 cm, 60s (1,25 cm) và 90s (1,39 cm) sau 5 ngày phân lập Sau 10 ngày phân lập, thì mốc thời gian khử trùng ở 30s đạt đường kính trung bình khuẩn lạc là 2,6 cm, 60s đạt 2,64 cm và 90s đạt 2,73 cm Sau 15 ngày thì mốc thời gian khử trùng ở 30s đạt đường kính trung bình khuẩn lạc là 4,48 cm, 60s đạt 4,55 cm và 90s đạt 4,58 cm 100% mẫu ở tất cả các nghiệm thức không bị nhiễm Có thể nhận thấy, các mốc thời gian khử trùng mẫu ở 30s, 60s và 90s không có sự ảnh hưởng đáng kể đến quá trình hình thành và phát triển của tơ nấm C militaris

Khi xét về ethanol ở các mức nồng độ từ 50 - 70% thì kết quả khử trùng tốt nhất ở nồng độ ethanol 50%với đường kính trung bình khuẩn lạc đạt 4,63 cm, kế tiếp là ở nồng độ ethanol 60% đạt 4,54 cm và ở nồng độ ethanol 70% cho kết quả thấp nhất, chỉ đạt 4,43 cm sau 15 ngày phân lập.Giai đoạn đầu tốc độ lan tơ không có sự khác biệt giữa các nồng độ và thời gian khử trùng mẫu, sau 5 ngày nuôi cấy, tơ nấm có sự phân hóa rõ rệt

Khi xét cùng lúc hai yếu tố thời gian và nồng độ khử trùng nhận thấy sau 5, 10 và 15 ngày, đường kính trung bình khuẩn lạc không có sự khác biệt lớn, nồng độ và thời gian khử trùng tốt nhất 50% trong 90s đường kính khuẩn lạc trung bình đạt 4,66 cm và thấp nhất chỉ đạt 4,37 cm khi khử trùng với ethanol 70 o trong 30s

Như vậy, yếu tố nồng độ ethanol và thời gian khử trùng mẫu không ảnh hưởng lớn đến kết quả phân lập, tất cả đều cho tỷ lệ mẫu sạch hoàn toàn, đường kính khuẩn lạc sau 15 ngày theo dõi không có sự khác biệt nhiều giữa các công thức Điều này có thể là do những mẫu ĐTHT C militaris dùng để phân lập được nuôi trong phòng thí nghiệm ở điều kiện hoàn toàn sạch nên kết quả sẽ tối ưu hơn so với nhữngmẫu phân lập từ tự nhiên Khi so sánh với kết quả của tác giả Mai Hải Châu và Đặng Thị Ngọc, (2022) thì kết quả cũng tương tự, trong khi đó so với kết quả phân lập giống gốc có nguồn gốc thu thập mẫu từ tự nhiên của tác giả Nguyễn Thị Hồng, (2019) thì đạt tỷ lệ phân lập mẫu sạch cao nhất đạt 73,33% và tỷ lệ phân lập mẫu sạch thấp nhất đạt 33,33%

Tuy nhiên, dựa theo kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 khi xét đến yếu tố chi phí sản xuất thực tiễn thì nồng độ ethanol 50%, thời gian khử trùng mẫu từ 30s đến 90s là điều kiện tối ưu để vào mẫu, tơ nấm phát triển khỏe chiều dài tơ trung bình từ 4,59 cm đến 4,66 cm sau 15 ngày nuôi là phù hợp để phân lập đưa vào sản xuất

Từ kết quả phân tích thống kê, nhận thấy giá trị f > f0 và p < 0,05, chứng tỏ giữa nồng độ ethanol và thời gian xử lý mẫu có sự khác biệt, điều này rất có ý nghĩa về mặt thống kê

3.1.2 Kết quả sự ảnh hưởng của độ tuổi mẫu phân lập đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris Để nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm dung để phân lập, nhân giống cấp 1 của nấm C militaris, đề tài đã thực hiện cấy nấm lên trên 5 độ tuổi khác nhau, bao gồm: 25 ngày tuổi, 30 ngày tuổi, 35 ngày tuổi, 40 ngày tuổi và 45 ngày tuổi Giống nấm C militaris được cấy điểm trên đĩa thạch, nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22 o C, không chiếu sáng, tiến hành đánh giá tốc độ sinh trưởng theo các mốc thời gian 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu phân lập đến sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống cấp 1 Độ tuổi quả thể (ngày) Đường kính khuẩn lạc nấm sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (cm) Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc nấm C militaris sau 15 ngày nuôi cấy

Từ kết quả trên bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy: Độ tuổi mẫu phân lập khác nhau có tốc độ sự sinh trưởng khác nhau Đường kính trung bình khuẩn lạc giữa các mẫu đạt 1,1 cm sau 5 ngày nuôi cấy, sau 10 ngày đạt 2,25 cm và sau 15 ngày đạt 4,26 cm Qua sự theo dõi và quan sát sau 15 ngày nuôi cấy, nhận thấy độ tuổi phân lập tốt cho kết quả tốt nhất theo thứ tự 30 > 35 > 40 >

45 > 25 Trong đó, ở 30 ngày tuổi sau 15 ngày nuôi cấy thì đường kính khuẩn lạc nấm trung bình đạt 4,69cm, kết quả này khi so sánh với các độ tuổi khác trong thí nghiệm thì lớn hơn 0,05 cm so với mẫu 35 ngày tuổi; 0,15 cm so với mẫu 40 ngày tuổi; 0,93 cm so với 45 ngày tuổi và 1,02 so với 25 ngày tuổi

Như vậy, có thể nhận định độ tuổi quả thể nấm dùng để phân lập giống cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm

Qua phân tích thống kê, nhận thấy giá trị f > f0 và p < 0,05, chứng tỏ giữa các độ tuổi mẫu dùng để phân lập có sự khác biệt, điều này rất có ý nghĩa về mặt thống kê

25 ngày tuổi 30 ngày tuổi 35 ngày tuổi

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris

Hiện nay, công nghệ nhân giống dịch thể đã và đang được đặc biệt quan tâm bởi những ưu điểm vượt trội như: Hệ sợi nấm phát triển nhanh qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống và nuôi trồng, tuổi nấm đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định, dễ kiểm soát, giống khỏe, giá thành sản xuất thấp do tiết kiệm được nhiên liệu, điện năng Bên cạnh những ưu điểm trên, quá trình nhân giống đòi hỏi về điều kiện nhân giống, loại môi trường dinh dưỡng nhân giống Tuy nhiên, quá trình nhân giống hiện nay còn nhiều hạn chế như kích thước của cầu nấm không đồng đều, chủ yếu bổ sung hóa chất vào môi trường dinh dưỡng Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dịch chiết hữu cơ bổ sung vào môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể nấm C militaris Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3

Bảng 3.3 Kết quảảnh hưởng của loại môi trường đến hiệu suất nhân giống dịch thể của nấm Cordyceps militaris

Thời gian xuất hiện cầu nấm (ngày) Ngày Giá trị OD 600nm Kích thước của cầu nấm (mm)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 3.3 Cầu nấm C militaris trong các môi trường dịch lỏng khác nhau sau 10 ngày nuôi lắc

Dựa vào bảng 3.3 và hình 3.3, kết quả thí nghiệm cho thấy: Thời gian bắt đầu xuất hiện cầu nấm từ 3 - 4 ngày, trong đó ở công thức CT3 và CT5 cầu nấm phát triển nhanh nhất Tỷ lệ mẫu sạch hoàn toàn, không có mẫu bị nhiễm giữa các công thức thí nghiệm

Kết quả nghiên cứu nuôi trồng, đánh giá năng suất, hàm lượng hoạt chất

và thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng Kết quả về hoạt chất adenosine trong đế khô ở nghiệm thức NT21 đạt 20,18 mg/100 g cao hơn 16,71 mg/100 g so với nghiệm thức đối chứng; 9,00 mg/100g so với nghiệm thức NT17; 5,53 mg/100 g so với nghiệm thức NT18; 10,09 mg/100 g so với nghiệm thức NT19; 3,02 mg/100 g so với nghiệm thức NT20; 10,59 mg/100 g so với nghiệm thức NT6 của thí nghiệm 3.3.4.1; 7,02 mg/100 g so với nghiệm thức NT11 của thí nghiệm 3.3.4.2 và 7,40 mg/100 g so với nghiệm thức NT12 của thí nghiệm 3.3.4.3

Dựa vào kết quả số liệu cho thấy: Đối với môi trường cơ chất tổng hợp hữu cơ, khi bổ sung hàm lượng gan Lợn càng nhiều thì hoạt chất adenosine và cordycepin trong quả thể khô và đế khô càng cao

3.4 Kết quả nghiên cứu nuôi trồng, đánh giá năng suất, hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được cấy bằng dung dịch giống lỏng hữu cơ trên ký chủ Tằm dâu nguyên con

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khả năng hình thành hệ sợi và quả thể nấm Cordyceps militaris Ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến thời gian sinh trưởng của quả thể C militaris được trình bày ở bảng 3.20 và hình 3.20

Bảng 3.20 Kết quả thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến khả năng hình thành hệ sợi và quả thể nấm

Thể tích dung dịch nấm gây nhiễm (àl)

Thời gian hệ sợi phát triển kín bề mặt ký chủ (ngày)

Thời gian hình thành quả thể

(ngày) Đặc điểm hình thái sợi

Ghi chú: *** Hệ sợi ăn lan bề mặt dày, màu trắng đồng nhất

Hình 3.20 Các mẫu thí nghiệm sau khi bị lây nhiễm nấm và nuôi tối, hệ sợi ăn lan kín cơ thể vật chủ

Tằm dâu sau khi hấp vô trùng, tiến hành tiêm vào ký chủ ở các mức thể tớch dịch giống lỏng tử 30 - 180 àl, tỷ lệ nhiễm nấm đạt 100% nhưng thời gian cho hệ sợi nấm hình thành và phát triển khác nhau, kết quả này tương đồng với một số tác giả khác (Nguyễn Hữu Dũng, 2020), (Hoàng Phương Ly,

2023) Dựa vào bảng số liệu 3.19, cho thấy: Thời gian hình thành và phát triển kín bề mặt ký chủ từ 3,67 - 8,67 ngày ở các mức thể tích dịch giống tiêm khác nhau, thời gian trung bình hình thành và phát triển kín bề mặt ký chủ là 5,01 ngày Trong đú, thể tớch dịch tiờm ở mức 180 àl thỡ thời gian hỡnh thành, phỏt triển hệ sợi nhanh nhất và chậm nhất ở mức tiờm 30 àl Thể tớch dịch tiờm ở mức 180 àl thỡ thời gian hỡnh thành, phỏt triển hệ sợi là 3,67 ngày nhanh hơn mức tiờm 30 àl; 60 àl; 90 àl; 120 àl; 150 àl theo thứ tự lần lượt là 4,8 ngày; 3,3 ngày; 1,8 ngày; 1,8 ngày; 0,8 ngày; 0,3 ngày Qua khảo sát cho thấy mức tiờm từ 90 - 180 àl thỡ thời gian hỡnh thành và phỏt triển hệ sợi của ký chủ Tằm dâu cho kết quả nhanh nhất

Sau khi quan sát và theo dõi thời gian hình thành và phát triển kín bề mặt ký chủ ở các mức tiêm khác nhau, tiếp tục ủ tối sau 12 ngày (kế thừa từ kết quả của tác giả Nguyễn Hữu Dũng, 2020) thì bắt đầu mang vào phòng sáng, tiếp tục theo dõi thời gian hình thành quả thể Kết quả theo dõi được cho thấy: Tỷ lệ bật quả thể của ký chủ ở các mức tiêm khác nhau đều đạt 100%, thời gian hình thành quả thể của ký chủ Tằm dâu ở các mức tiêm khác nhau của thí nghiệm từ 16,83 - 20,33 ngày, thời gian hình thành quả thể trung bình là 18,42 ngày Thời gian hình bắt đầu hình thành quả thể nhanh nhất là ở mức thể tớch dịch tiờm là 180 àl và chậm nhất là mức tiờm 30àl Với thể tớch dịch tiờm ở mức 180 àl thỡ thời gian hỡnh thành quả thể là 16,83 ngày nhanh hơn mức tiờm 30 àl; 60 àl; 90 àl; 120 àl; 150 àl là: 3,5 ngày; 2,34 ngày; 1,5 ngày; 1,34 ngày; 0,84 ngày Kết quả ở mức tiờm 90 - 180 àl cú thời gian hỡnh thành quả thể nhất

Từ kết quả trên cho thấy: Ngoài điều kiện nuôi như ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm thì lượng thể tích dịch giống tiêm giống vào ký chủ cũng ảnh hưởng đáng kể đến thời gian hình thành, phát triển của hệ sợi và quả thể Với kết quả thu thập được cho thấy mức tiờm từ 90 - 180 àl thời gian để hệ sợi và quỏ thể hình thành, phát triển cũng không chênh lệch nhiều Vì vậy, khi tiến hành sản xuất trên thực tế thì tùy theo kích thước và nguồn dịch lỏng có sẵn mà tiêm vào ký chủ mức tiêm phù hợp

Dựa vào kết quả phân tích thống kê cho thấy: Các giá trị f > f0 và p < 0,05, chứng tỏ có sự khác biệt về thời gian hình thành, phát triển hệ sợi và thời gian hình thành quả thể trên ký chủ Tằm dâu

3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm Cordyceps militaris Ảnh hưởng thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể nấm C militaris được trình bày ở bảng 3.21, hình 3.21 và hình 3.22

Bảng 3.21 Kết quả thể tích dịch lỏng hữu cơ được tiêm vào ký chủ Tằm dâu nguyên con đến đặc điểm sinh trưởng của quả thể Cordyceps militaris

Thể tích dung dịch nấm gây nhiễm (àl)

Tổng số tằm thí nghiệm (con)

Kích thướt quả thể Đặc điểm của quả thể

Chiều dài (cm) Đường kính (mm)

+: Đầu nhỏ, nhọn, màu cam nhạt

++: Đầu tròn, màu vàng cam nhạt

Hình 3.21 Nấm C militaris sinh trưởng, phát triển trên ký chủ tằm nguyên con sau 45 ngày nuôi trồng

Hình 3.22 Kích thướt quả thể nấm C militaris trên ký chủ tằm nguyên con sau 45 ngày nuôi trồng

Sau 50 ngày nuôi, tiến hành thu thập số liệu về số lượng và kích thước của quả thể Dựa vào số liệu bảng 3.20 cho thấy:

- Số lượng quả thể trung bình của mỗi ký chủ Tằm dâu ở mỗi mức tiêm khác nhau từ 1,03 - 1,14 quả thể TB/con, số lượng quả thể trung bình của toàn thớ nghiệm đạt 1,08 quả thể TB/con Trong đú ở mức tiờm 180 àl cú số lượng quả thể TB/con nhiều nhất và thấp nhất là ở mức tiờm 30 àl Với mức tiờm

180 àl thỡ số lượng quả thể TB/con đạt 1,14 quả thể TB/con thỡ nhiều hơn số lượng quả thể TB/con ở cỏc mức tiờm 30 àl; 60 àl; 90 àl; 120 àl; 150 àl theo thứ tự lần lượt là 0,11 quả thể TB/con; 0,1 quả thể TB/con; 0,08 quả thể TB/con; 0,05 quả thể TB/con; 0,02 quả thể TB/con;

- Về kích thướt quả thể của thí nghiệm với chiều dài quả thể đạt từ 3,36

- 6,53 cm, chiều dài trung bình quả thể của thí nghiệm đạt 4,74 cm Trong đó ở mức tiờm 180 àl đạt chiều dài của quả thể lớn nhất và thấp nhất ở mức tiờm

30 àl Với mức tiờm 180 àl thỡ chiều dài trung bỡnh của mỗi quả thể đạt 6,53 cm thỡ lớn hơn so với cỏc mức tiờm 30 àl; 60 àl; 90 àl; 120 àl; 150 àl theo thứ tự lần lượt là 3,18 cm; 2,27 cm; 2,18 cm; 1,98 cm; 1,16 cm Đối vơi đường kính quả thể của thí nghiệm với các mức tiêm khác nhau đạt từ 3,53 - 4,37 mm, đường kính trung bình quả thể của thí nghiệm đạt 3,69 mm Ở mức tiờm 180 àl thỡ đường kớnh trung bỡnh của mỗi quả thể đạt 4,34 mm lớn hơn so với cỏc mức tiờm 30 àl; 60 àl; 90 àl; 120 àl; 150 àl theo thứ tự lần lượt là 0,81mm; 0,81mm; 0,88 mm; 0,83mm; 0,57 mm

Nhìn chung, với số lượng quả thể TB/con và kích thước quả thể ở mức tiêm khác nhau của thí nghiệm không có sự chênh lệch nhiều về số lượng quả thể TB/con cũng như kích thước quả thể Tuy nhiên, dựa vào số liệu thu thập được thỡ ở mức tiờm từ 120 - 180 àl cho kết quả cao nhất về số lượng quả thể TB/con và kích thước quả thể

Tiêu đề	Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) năng suất và chất lượng cao theo hướng hữu cơ
Tác giả	Trần Nhật Trường
Người hướng dẫn	PGS. TS. Bùi Văn Thắng
Trường học	Trường Đại học Lâm nghiệp
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Luận văn Thạc sĩ
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	129
Dung lượng	1,84 MB