Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

bulbocastanum [6], các dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bảo trần.. Pham vi nghiên cứu Nghiên cứu tập t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Dinh Thi Thu Lê

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP

TE BAO TRAN DE CHỌN TẠO GIÓNG KHOAI TÂY

KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIEN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA HÀ NOI

Dinh Thi Thu Lé

NGHIÊN CUU UNG DUNG KY THUAT DUNG HỢP

TE BAO TRAN DE CHỌN TẠO GIONG KHOAI TÂY

KHANG VIRUS PVY O VIET NAM

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫnkhoa học của GS TS Hoàng Đình Hòa và GS.TS Nguyễn Quang Thạch Các số liệu,kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được tác giả công bố trong bắt kỳ

công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 19 tháng 3 năm 2021

Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận án

GS.TS Hoàng Đình Hòa GS.TS Nguyễn Quang Thạch Đỉnh Thị Thu Lê

định hướng và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thày, cô trong bộ môn Công nghệ Sinhhọc, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội đã day đỗ, động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian là nghiên cứu sinh

Hà Nội, ngày 19 tháng 3 năm 2021

Dinh Thị Thu Lê

LỜI CAM ĐOAN.

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐÒ THỊ

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIE!

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.3 Tình hình sản xuât khoai tây trên thê giới và Việt Nam

1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip

1.3 Tìm hiểu về virus hại khoai tay

1.3.1 Giới thiệu chung

1.3.2 Giới thiệu về PVY

1.3.3 Tác hại của PVY đến sản xuất kho:

1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai ta

1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh

1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhé bỏ các cây nhiễm virus

1.4.3 Chọn tạo giống kháng bệnh virus

1.5 Phương pháp chọn tạo giông khoai tây kháng virus

1.5.1 Phương pháp chon tạo giống truyền thống

1.5.2 Phương pháp công nghệ sinh học

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ

2.1 Vật liệu nghiên cứu.

2.1.1 Các dòng khoai tây nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất

2.1.3 Thiết bị

2.2 Nội dung nghiên cứu sẽ 2.2.1 Nội dung 1: Xác định các thong ưu cho quy trình dung hợp khoai tây từ các nguyên liệu nhị bội (2n = 2x), tứ bội (2n = 4x) và khoai tây dai (pnt2G, trn3G, blb2G) 2.2.2 Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thê lai soma của các tô hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) 9

2.2.3 Nội dung 3: Xác định các thẻ lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại(2n = 2x) và khoai tây trồng (2n = 4x) Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng 492.2.4 Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC¡) của thể lai soma (khoai tây dại vàkhoai tây trồng) với khoai tây trồng

2.3 Phương pháp nghiên cứu.

2.3.1 Tách tế bào trần

2.3.2 Dung hợp tế bào tr:

2.3.3 Xác định con lai bằng m

2.3.4 Chiết tách DNA tổng số

Xác định con lai bằng sinh học phân tử

Lây nhiễm nhân tạo PVY

ộ bội flow cytometry

Kiêm tra gen kháng PVY của các con lai soma băng chỉ

Đánh giá các đặc tính nông sinh học

Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh

2.3.10 Lai lại (backcross) giữa một vọng với khoai tây

2.3.11 Các chỉ tiêu theo dõi.

2.3.12 Xử lý số liệu

CHƯƠNG 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai taynhị bội, khoai tây dai và khoai tây trong

3.1.1 Nghiên cứu các thông sô tách té bào trần của các dòng khoai t

tây dai, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào tran

3.1.2 Xác định các thông số dung hợp tế bào trần

3.1.3 Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp

3.2 Xác định và đánh giá các thé lai soma của tô hợp dung hợp khoai tây n

3.3 Xác định các thé lai soma của tô hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai

tây trồng (2n = 4x) Đánh giá khả năng kháng virus PVY của ching „85

3.3.1 Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng lắng đo độ bội thé86

1

3.2.5 Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội

3.3.2 Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng chi thị phân tử

3.3.3 Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại

và khoai tây trồng 88 3.3.4 Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tay dai và khoai

0 tây trồng bằng lây nhiễm nhân ta

3.3.5 Đánh giá các con lai soma giữa khoai tay dại và khoai tây trồng vẻ các tinh trang

nông sinh học và phẩm chất củ Gl

3.4 Đánh giá con lai backcross (BC;) của thé lai soma (khoai tây dai và khoai tây trong)

với khoai tây trồng „96

3.4.1 Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây đại và khoai tây trồng) với các

giống khoai tây trông và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn

3.4.2 Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC; triển vọng trên đằng ruộng

và kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY bằng chi thị phân tử 1053.4.3 Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC) triển vọng trên đông ruộng

Chương 4 KET LUẬN VA ĐÈ NGHỊ

DANH MUC CHU VIET TAT

Nghia tiếng Việt

6 - benzyl amino purine Backcross

Công nghệ sinh học Công thức Double Antibody Sandwich — Enzyme linked imunosorbent assay Deoxyribonucleic acid

Enzyme — linked imunosorbent assay Food and Agriculture Organization Gibberellic Acid

Indole-3-acetic acid

Khối lượng củ trung bình

Least significant difference Murashige and Skoog Naphthaleneacetic acid

Năng suất ly thuyếtNăng suất thực thuNhiễm sắc thể

Optical density Polymerase chain reaction Polyethylene glycol Potato virus Y Simple sequence repeat

Tế bao

DANH MỤC CÁC BANGBảng 1.1 Mười lim quốc gia sản xuất khoai tây nhiều nhất thé giới năm 2019 7Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam

Bang 1.3 Hệ thống sản xuất các cấp giống khoai tây trên đồng ruộng tại Canada l6Bảng 1.4 Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tây Việt Nam vie TBBảng 1.5 Thời gian chọn tạo giống khoai tây theo phương pháp truyền thông 22Bảng 1.6 Tóm tắt kết quả quá trình chọn tạo giống khoai tây thông qua dung hợp tếbào trần các loài Solanum (1985 - 2016)

Bảng 2.1 Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn

phục vụ cho lai soma

Bảng 2.2 Trình tự và nhiệt độ gắn môi sử dụng trong phân tích PCR chọn lọc con laisoma giữa khoai tây đại và khoai tây trồng aodBang 3.1 Anh hưởng của nồng độ macerozyme va cellulase trong dung dich enzyme đếnmật độ tê bao trần của các dong khoai tây nhị bội (Tế bào tran /ml môi trường) 6 ÏBảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào

.64

ộ tê bào tran thu được từ mau lá 6S

trần thu được

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạocallus của tổ hợp B186 (+) B208 và tổ hợp /zz3G (+) Delikat

Bang 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ ion Ca?* đến khả năng kết dính thành hàng của tếbao trong quá trình dung hợp và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp 68Bảng 3.6 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trần đến kết quả dung hợp bằng xung điện của

tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 .70Bảng 3.7 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trần đến kết quả dung hợp bằng xung điện của

tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng /rz3G (+) Delikat

Bảng 3.8 Sự phân chia của các tô hợp lai nhị bội và t6 hợp lai giữa khoai tây đại vàkhoai tây trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 72Bảng 3.9 Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chdi của các

tổ hợp lai sce TA

Bảng 3.10 Kết qua dung hợp, nuôi cây va tái sinh các tô hợp lai nhị bội sau dung hop

lb iG Bảng 3.11 Ket quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp

Bảng 3.12 Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp

Bảng 3.13 Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma khoai tây và dòng nguyên liệu

Bảng 3.14 Kêt quả nuôi cây tái sinh chôi của các tô hợp lai khoai tây dại và khoai tây

Bang 3.21 Đánh giá kha nang kháng bệnh virus của con lai BC: ở giai đoạn cây con.98

Bang 3.22 Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC: 99Bảng 3.23 Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC) 100Bang 3.24 Tình hình sinh trưởng, phát triển các vật liệu khảo sát sau 60 ngày trong 102Bảng 3.25 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát 103Bảng 3.26 Đặc tính nông sinh học các đòng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiệnđồng ruộng 107

Bảng 3.27 Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giông khoai tây 109

Bảng 3.28 Kết quả đánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển của các con lai BC¡ vàcác giống khoai tây trồng vụ đông xuân 2017-201 110Bảng 3.29 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây kh

Bang 3.30 Đặc điểm hình thái củ khoai tây các dòng/giống khảo sát veoh 2Bang 3.31 Đánh giá cảm quan về chất lượng củ qua ăn nếm của các dòng/giống khoai

tây evel 13

114

Bảng 3.32 Đánh giá ham lượng chất khô của dòng/ g

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐÒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống sản xuất khoai tây giống của Viện Sinh học Nông nghiệp Hình 1.2 Sơ dé lai khoai tây

Hình 1.3 Cơ chế làm câm gene nhờ RNAi

Hình 1.4 Sử dung cây chuyên gen amiRNA để tao cây kháng virus

Hình 2.1 Các loài khoai tây dại nhị bội thu thập từ CHLB Đức

Hình 3.1 Hình ảnh tế bào trần của các dòng khoai tây khác nhau với các enzyme phù

hop 2.63

Hình 3.2 Chất lượng tế bao sau dung hợp và sự hình thành macrocallus ở các tần và

OL

sô lân xung khác nhau .

Hình 3.3 Hình ảnh tế bào tạo hàng trong dung dịch dung hợp dung hợp có nồng độ

0D 273

ion Ca?” khác nhau trong quá trình dung hợp của tổ hợp B186 (+) B208

Hình 3.4 Hình ảnh phân chia tế bao sau 5 ngày nuôi cây

Hình 3.5 Dung hợp và nuôi cấy các tổ hợp lai sau dung hop

Hình 3.6 Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố me” và con lai

Hình 3.7 Xác đỉnh con lai soma của tổ hợp A15 (+) A56 với cặp mỗi STM 3023 79Hình 3.8 Xác định con lai soma của tổ hợp B186 (+) B208 với cặp mỗi STM 3023 80

Hình 3.9 Sự khác nhau về số lượng và kích thước củ của một số dong lai soma

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung cặp môi đặc hiệu GP 122406 liênkết chặt với gen Ryso trong bố mẹ nhị bội và con lai soma

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt bởi enzym cắt giới hạn ZcoRV 85Hình 3.12 Hình ảnh độ bội thé của dong khoai tây “bố me” và con lai

Hình 3.13 Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 87Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mỗi GP 122406 của ADN các con laisoma và các dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng 89Hình 3.15 Kết qua điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dong lai soma vàdòng bố mẹ khoai tây đại và khoai tây trồng

Hình 3.16 Đánh giá các đặc tính nông sinh học của con lai soma và các dòng bô mẹ 9 l

Hình 3.17 Đánh giá các tính trạng về năng suất và phẩm chất củ của con lai soma vàdòng bố me

Hình 3.18 Các biến di ở con lai soma

Hình 3.19 Hạt nảy mam đến giai đoạn 2 lá thật của các hạt lai BC .

Hình 3.20 Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mdi GP 122406

Hình 3.21 Kêt quả điện di kiêm tra gen kháng virus PVY sau khi cat bang enzyme giới han EcoRV „+ LOS

vere 113 Hình 3.22 Màu sac vỏ củ, thịt củ các dòng/giông khảo sát

MỞ ĐẦUKhoai tay (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng trongchương trình an ninh lương thực thế giới chỉ sau ngô, lúa mỳ và gạo Theo thống kê của

tổ chức Nông lương thế giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây trên thế giới năm

2017 đạt 19.30 triệu ha, năng suất trung bình đạt 20,11 tan/ha, với tông sản lượng 388,2triệu tân Trong đó, diện tích khoai tây châu Âu chiếm 29,1% và sản lượng chiếm 31,9%;diện tích châu A chiếm 51,9% và sản lượng chiếm 48,8% (FAOSTAT, 2016).Tại Việt Nam, khoai tây cũng là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng SôngHồng, tuy nhiên diện tích trồng hiện nay của cả nước chỉ là 20.480 ha với năng suất 14,8tan/ha, sản lượng 303 nghìn tan (FAOSAT, 2017) Có nhiều nguyên nhân cả về mặt kinh

tế lẫn kỹ thuật dẫn đến sự hạn chế phát triển khoai tây ở Việt Nam Về mặt kinh tế,nguyên nhân chính là do trồng khoai tây kém hiệu quả so với các cây trồng khác và đầu

ra hạn chế (trừ khoai tây chế

tượng thoái hóa giống gây ra do virus Bệnh virus hại khoai tây rat phỏ biến, dé lan

iến) Về mặt kỹ thuật, nguyên nhân chủ yếu là do hiệntruyền thông qua môi giới truyền bệnh (côn trùng trích hút) Khoai tây được trồng vànhân giống bằng củ, khi cây bị nhiễm virus toàn bộ củ cũng bị lây nhiễm Củ giống bịnhiễm virus khi trồng sẽ cho năng suất, chất lượng thấp Đây chính là hiện tượng thoái hóa

giống khoai tây gây ra do virus [1] Có nhiều loại virus hại khoai tây, trong đó PVY là mộttrong 10 loại virus phô biến iy tốn that năng sĩ dt nghiêm trọng nhất trong các nước nhiệt

đới trồng khoai tây [2] Ước tính cứ 1% củ giống bị nhiễm PVY thì sẽ giảm năng suấtkhoảng 180kg/ha tương ứng 18 $/ha [3] Hàng loạt các chiến lược làm giảm hậu quả củabệnh virus hại khoai tây đã được triển khai như: thay thế giống nhiễm virus bằng giốngsạch hàng năm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tiêu điệt vector truyền bệnh Trong đó,việc sản xuất giống sạch virus là biện pháp khá phổ n được thực hiện ở hầu hết các

y quy mô lớn (Pháp, Đức, Hà Lan, ) Việc sản xuất giống sạchnước trồng khoai

virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp như nuôi cấy mô nguyên liệu sạch bệnh, nhân

và trồng vật liệu trong điều kiện cách ly, sản xuất củ giống ở các vùng chuyên sản xuấtgiống rất ton kém về chỉ phí, nhân lực và thời gian Trong các giải pháp khắc phục bệnhvirus hại khoai tây, có thể nói biện pháp hiệu quả và có tính bền vững nhất là việc tạo

và sử dụng giống kháng virus

Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển là phương pháp lai tạo Phươngpháp này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền do bộ NST của khoai tây là tứ bội

(2n=4x=48) Bộ genome tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, quá trình

chọn lọc gặp khó khăn với một quần thể rất lớn trước khi tìm được một con lai có tínhtrạng mong muốn để phát triển thành giống Thông thường tạo ra một giống khoai tây

mới thời gian chọn lọc đòi hỏi 10 - 12 năm [4] Chuyển gen kháng bệnh, gen mang các tính trạng mong muốn vào cây trồng cũng đã và đang được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống của nhiều cây trồng Công nghệ này có thẻ rút ngắn thời gian chọn tạo

giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển Tuy nhiên, do những longại về an toàn sinh học của các thé GMO (Genetically Modified Organism) nên hiệnnay kỹ thuật chuyền gen dang là van dé còn nhiều tranh luận Trước bối cảnh này, việc

sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bao tran dé có thé chuyền và tích hợp các gen mong muốnnổi lên như một giải pháp có tính khả thi cao Dung hợp tế bao tran trong tạo giống khoaitây đã được Wenzel ø/ a/., vào năm 1979 trải qua hơn 40 năm phát triển, kỹ thuật nàyđang ngày một hoàn thiện Với kỹ thuật này có thé i) tạo ra cá

trì những tính trạng mong muốn cho đời sau và là nguôn vật liệu khởi đầu cho công tác

ic con lai soma có thể duychon tạo giống, ii) chuyển 1 gen hoặc tích hợp nhiều gen từ các vật liệu dung hợp, iii)tái tổ hợp được genome nhân tế bao và tế bào chất, iv) tránh được những luật lệ liênquan đến chuyển gen [5] Trên thế giới, các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây gầnđây đã sử dụng các nguồn khoai tây dại như S Tarnii, S Pinnatisectum, S

bulbocastanum [6], các dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo

giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bảo trần

Nhằm góp phan nghiên cứu tạo giống khoai tây (nhất là khoai tây có khả năng chếbiến) mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp

tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam” đã được thực

hiện.

Mục tiêu

Tạo các vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVYbằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần

Pham vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung thực hiện trên các đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội (2n

= 2x = 24), khoai tây dại (2n = 2x = 24) kháng virus PVY, giống khoai tây trồng (2n =

4x = 48)

Thời gian thực hiện: tháng 5/2015 đến tháng 12/2018

Địa điểm nghiên cứu:

Các nội dung nghiên cứu về tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần và chọn lọc con lai

soma được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp (Học viện Nông nghiệp Việt Nam);

các con lai BC) được lai tạo và đánh giá tại Sapa; các nghiên cứu về đánh giá tính khang

virus và đặc tính nông sinh học của các con lai soma và con lai BC¡ được thực hiện tại

Viện Sinh học Nông nghiệp (Học Viện Nông nghiệp Việt Nam) và đồng ruộng Quế Võ

- Bắc Ninh

Những đóng góp mới của đề tài

1) Khang định được các thông sô tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định conlai soma phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tay bằng dung hợp tế baotrần trên các vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại

(Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum) và khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic).

2) Chứng minh và góp phan khẳng định được kha năng duy trì tinh kháng bệnhvirus PVY từ các dòng nhị bội của khoai tây trồng Solanum tuberosum và khả năngchuyển đặc tính kháng bệnh virus từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii, Solanumpinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosumqua dung hợp tế bào trần

3) Đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp

của hai dong nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC; 13.1300.3; BC; 13.1305.6 là

sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng Các dòng này

vừa có khả năng kháng bệnh virus PVY vừa mang các đặc tính nông sinh học quý có

thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có năng suất cao,phẩm chất tốt

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài đã chứng minh và góp phan khẳng định khả năng duy trì tính kháng virus vàcải thiện đặc tính nông sinh học của các dòng nhị bội qua dung hợp tế bào trần và khảnăng chuyền đặc tính kháng bệnh virus PVY từ các loài khoai tây dai Solanum tarnii,Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanumtuberosum khi dung hợp tế bào trần Con lai soma có thể làm vật liệu khởi đầu trongcông tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và mang đặc tính nông sinh họcmong muốn Đây là những dẫn liệu khoa học quý, mới mẻ phục vụ nghiên cứu, giảngday công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng

Y nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26,

81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòngBC; 13.1300.3; BC: 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại

và khoai tây trồng Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus, vừa mang các đặctính nông sinh học quí có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus

có năng suất cao, phẩm chất tốt Ngoài ra, kết quả của đề tài cũng là cơ sở kỹ thuật đểtham khảo xây dựng quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang đượcnhững đặc tính nông sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế

bào trân.

Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây trồng cỗ đại Các bằng chứng

về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học đều chứng minh rằngkhoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều loài khoai tây hoang dại còn tồn tại tới ngày

nay, đặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia [1].

Khoai tây được đem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ thứ 16, nhanh chóngthích nghỉ với điều kiện tự nhiên tại đây và sớm trở thành loại thực phâm chính tại thờiđiểm mà dân sé thế giới tăng nhanh Khoai tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vậthọc người Thụy Sỹ C Bauhin và J Bauhin mang tới, được trồng rộng rãi vào năm 1773

Từ Châu Âu khoai tây sang tới Án Độ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm

1766 vào Nhật Bản Khoai tây đến với Áo, Italia, Đức và các vùng lãnh thổ Châu Âuvào cuối thế kỷ XVII Khoai tây được trồng trên quy mô lớn vào những năm 1800 vàtới khoảng thé ky XIX mới thực sự phổ biến trên các châu lục

Ở Việt Nam, khoai tây được người Pháp đưa vào trồng năm 1890 ở một số vùng:

Tú Sơn — Hải Phòng, Trà Lĩnh — Cao Bằng (1907), Thường Tín — Hà Tây (Hồ Hữu An,2005) Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Hồng, Sapa,

Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa [9].

1.1.2 Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp Magnoliopsida, ngành

Magnoliophyta Các loài khoai tây thuộc một chi (genus) rất lớn và rất đa dang về mặt

di truyền bao gồm 7 loài khoai tây trồng và 228 loài khoai tây dại (Hawkes, 1994) Trong

7 loài khoai tây trồng thì loài Solanum tuberosum có hai loài phụ đặc biệt quan trọng là

S tuberosum spp Tuberosum (Tuberosum group) và S tuberosum spp Andigena (Andigena group) [10]

Khoai tây trồng (Cultivated potatoes)

Theo Hawkes (1994) có 7 loài khoai tây trồng có mức bội thể khác nhau với sốlượng nhiễm sắc thể gốc 12(x= 12), nằm trong phạm vi từ nhị bội cho tới ngũ bội Baogồm các loài nhị bội thé (diploid, 2n = 2x = 24) có S Stenotonum, S Ajanhuii và S.Phureja; tam bội thể (triploid, 2n = 3x = 36) có S Chaucha và S Juzepczukii; tử bội thể

(tetraploid, 2n = 4x = 48) có S.tuberosum (có 2 loài phụ là S.tuberosum subsp tuberosum và S.tuberosum subsp Andigena) và ngũ bội thê (pentaploid, 2n = 5x = 60)

có S curtilobum Trong các loài khoai tây trồng, loài phổ biến nhất, quan trọng nhấtđược trồng trên khắp thế giới là loài tứ bội SŠ.øberosum L (2n = 4x = 48) Tuy nhiên,nền di truyền của của các giống Tuberosum ở Châu Âu và Bắc Mỹ là hẹp trong khinhóm giống Andigena (loài phụ Solanum tuberosum subsp andigena) (2n = 4x = 48)trồng ở vùng cao Andes lại giàu về nguồn gen của nhiều tính trạng [10, 11, 12]

Khoai tây dai (Wild potatoes)

Theo Hawkes (1994) khoai tây có số lượng các loài hoang dai nhiều hon bat kỳmột loại cây trồng nào khác (228 loài) Chúng đều chứa cùng bộ NST gốc (x = 12) nhưcác loài khoai tây trồng nhưng thay đổi trong phạm vi từ nhị bội (2n = 2x = 24) tới lụcbội (2n = 6x = 72) Điều rất quan trong là các dòng khoai tây dại này có phạm vi phân

bố rất rộng rãi nên có tính thích nghỉ về mặt sinh thái rất lớn Phạm vi phân bố của chúng

là toàn bộ Nam Mỹ, từ vùng đồng bằng tới vùng núi cao (3000 - 4500m) Với phạm vitồn tại cực kỳ rộng lớn, các loài khoai tây dại mang nhiều gen thích ứng với nhiều kiềukiện ngoại cảnh bat lợi cũng như chống chịu mạnh mẽ với nhiều loại sâu bệnh Chính

vi thé các loài khoai tay dại là nguồn gen rất phong phú về tính thích ứng với stress phisinh học cũng như nguồn gen kháng quan trọng với nhiều loại sâu bệnh phục vụ chọntạo giống

1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thé giới

Khoai tây được xép là cây lương thực quan trọng thứ 4 trên thế giới sau ngô, lúa

mì, gạo và khoai tây được coi là cây lương thực không hạt quan trọng nhất với lượngsản xuất hang năm đạt 376,8 triệu tấn (năm 2019) và ngày càng được tiêu thụ nhiềutrong vài thập kỷ gần đây (World Potato Statiscs, 2019) Trung Quốc và Án Độ là hainước có mức độ sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, khoảng 96 và 45,5 triệu tấn trong

năm 2019.

Bang 1.1 Mười lam quốc gia sản xuất khoai tay nhiễu nhất thé giới năm 2019

STT Quốc gia Khoai tây sản xuẤt (triệu tấn)

2007 đến năm 2017 đã chứng minh điều đó

Bảng 1.2 Diện tich, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam

vị trí của mình, dần trở thành cây trồng quan trọng trong cơ câu nông nghiệp của nước

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hau hết đo nông dân tự duy trì từ

vụ này sang vụ khác hoặc giống do người đân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy màgiống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm bệnh hại cao cộng với hao hụt

trong bảo quản từ 45 — 60% Khoai tây trồng chủ yếu bằng con đường nhân giống vô tínhnên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa, trong điều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảoquan trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 - thang 10), điều kiện nóng âm củamùa hè củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả

là năng suất và chất lượng củ thấp

Mặt khác, việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, chưamang tính hệ thống Trước tình hình đó, cần xây dựng các chương trình nhân giống vàchọn tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chat tốt đáp ứng được nhu cầu

của thị trường.

1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip

Chế biến khoai tây đã được thực hiện từ ít nhất 200 năm sau công nguyên Cácdạng sản phẩm khoai tây chế biến là khoai tây chiên kiểu Pháp, chip khoai tây, khoai

tây đông lạnh, khoai tây khử nước (khoai tây ở dạng bột, bột thô, mảnh lát, vảy )

Món khoai tây chiên là một trong số những món ăn phé biến nhất trên thé giới vàrất được giới trẻ ưa chuộng Là một món “snack” được yêu thích, nhưng những miếngkhoai tây chiên đầu tiên lại không có hình dạng như loại khoai tây mỏng, mặn và chiêngiòn được đóng gói như chúng ta vẫn thấy bây giờ Kỹ nghệ "chip khoai tây" bànhtrướng lần đầu tiên năm 1962 tại CHLB Đức tại tỉnh Köln - Cologne, đưới nhãn hiệu

"Chio".

Hoa Kỳ là nước sản xuất chip khoai tay hàng đầu trên thế giới Cam kết của Hoa

Kỳ về sản phẩm khoai tây khử nước chất lượng cao nhất, khoai tây khử nước Hoa Kỳkhông sử dụng các sản phẩm phụ của khoai tây từ các chế biến khác

Cùng với việc tiêu thụ ngày càng tăng của khoai tây thì giá trị thương mại của các

loại khoai tây chế biến cũng tăng theo xu thế thị trường và đã có giá trị lớn hơn nhiềucác loại khoai tây tươi Chỉ tính năm 2002 tại châu Âu, thu nhập từ các nhà chế biếnchip khoai tây là 4,5 tỷ Euro trong một năm Năm 2005, trên thế giới, nguồn thu từ cácsản phẩm khoai tây chip đã lên tới 16,4 tỷ USA chiếm 35,5% so với tong nguồn thu(46,1 tỷ USA) từ các sản phẩm ăn nhanh [13]

Nhật Ban là nước nhập khâu khoai tây lớn trên thế giới Những mặt hàng nước naynhập khẩu nhiều gồm khoai tây đông lạnh và các sản phẩm khoai tây chế biến khác.Theo số liệu thống kê của Phòng Nông nghiệp nước này, năm 2006 lượng khoai tâyđông lạnh nhập khẩu của Nhật tăng 12%, từ 267.895 tan năm 2005 lên tới 299.327 tannăm 2006 Lượng nhập khẩu các loại khoai tây chế biến khác cũng tăng 13% [14]

Đối với khoai tây chế biến, ngoài các yếu tố mà khoai tây thông thường phải bảođảm (có đầy đủ đinh dưỡng, chất khoáng, cho năng suất cao ) thì còn phải thỏa mãnmột số yêu cầu đặc biệt sau: hàm lượng chất khô > 20%, hàm lượng tỉnh bột > 17%,hàm lượng đường khử < 0,05% Nếu hàm lượng đường quá cao khi chế biến, miếngkhoai tây dé bị cháy xém cạnh, vỡ vụn, không đảm bảo yêu cầu Kích thước củ khoaichế biến phải đảm bảo đường kính từ 4,5 - 9 cm, củ tròn dé dễ got bằng máy, mắt củnông dé không phải gọt quá sâu gây hao hut, vỏ củ màu vàng nhạy, thịt củ màu trắng,nguyên liệu có khả năng cất giữ lâu [9].

Do các giống khoai tây địa phương của Việt Nam không đáp ứng được các yêucầu của chế biến nên biện pháp nhập nội giống là biện pháp đầu tiên được dé xuất dékhắc phục tình trạng thiếu giống ở Việt Nam Nhập nội là khởi điểm của chương trìnhchọn tạo giống Nhập nội là một cách cung cấp các nguồn gen quý, trên cơ sở nguồn vậtliệu đó để chọn tạo ra những giống mới theo ý muốn Có thể nói nhập nội là phưongpháp chọn tạo giống nhanh nhất, đỡ tốn kém, phù hợp với các nước đang phát triển Ganđây, bằng con đường hợp tác khoa học với nước ngoài, chúng ta đã tiến hành chọn lọc,khảo nghiệm những giống nhập nội từ đó chọn ra một số giống thích hợp cho nước ta.ỞVi Nam, ngành chế biến khoai tây mới xuất hiện chưa được 10 năm, nhưngđang phát triển rất mạnh mẽ, mở ra hướng đi cho xuất khâu khoai “Tiêu dùng khoaitây đang chuyến từ thị trường tiêu thụ tươi sang các sản phâm chế biến có giá trị gia

tăng như khoai tây rán.

Hằng năm, nước ta phải nhập khẩu một lượng lớn khoai tây, năm 2002 nhậpkhoảng 100.000 tan từ Đức, Hà Lan, Mỹ, Singapore dé làm giống, ăn tươi và chế biến.Việc nhập khẩu khoai tây cũng gặp nhiều khó khăn như thuế cao (400.000 đồng/tấn),thủ tục rườm rà, chỉ phí vận chuyển cao

1.3 Tìm hiểu về virus hại khoai tây

1.3.1 Giới thiệu chung

Virus hại thực vật là loại nguy hiểm, nó tác động nghiêm trong đến tất cả các loạicây trồng Virus có thé có rất nhiều triệu chứng như sự thay đổi về hình dạng bên ngoàicủa cây, sắc tố cây, sự hoại tử các bộ phận khác nhau trên cây dan đến tác động đến sựphát triển của cây Trong hầu hết các trường hợp, những điều này là giảm năng suất vàchất lượng cây trồng [15]

Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấn công vào các

tế bào, các cơ quan làm thay đổi các quá trình trao đổi chất của cây, qua đó sẽ làm ảnhhưởng lớn đến năng suất Khi cây bị nhiễm virus không thé chữa, chỉ có thé loại bỏ cây

khỏi nơi trồng và nguồn nước Bởi vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy

hiém đôi với những cây trông nhân giông vô tính băng củ tiêp tục nhân lên ở các thê hệ sau Ngoài ra bệnh virus còn được lan truyền do côn trùng hoặc tiép xúc cơ giới.

Vii Triệu Man, 1978 [16] và một số tác giả khác cho rằng: virus đã làm ảnh hưởng

rât lớn đên năng suât và phâm chât khoai tây, đặc biệt là virus PVY làm giảm năng suât

từ 50% - 90% Chính vì vậy, đên nay dù có nhiêu tác nhân gây bệnh hại khoai tây nhưng virus van là nguyên nhân chủ yêu làm giảm năng suât kinh tê một cách tram trọng.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương Đại, Hà Minh Trung, Vũ Triệu

Mân (1978 — 1986) về virus khoai tây ở Mién Bac Việt Nam thì: bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chính Do là:

Virus Y khoai tây (PVY)

Virus X khoai tây (PVX)

VirusA khoai tây (PVA)

Virus S khoai tây (PVS)

Virus M khoai tây (PVM)

Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)

Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV-International Committee on

Taxonomy of Viruses) đã xây dựng hệ thông dữ liệu về các nhóm virus gôm đặc điêm của từng nhóm và hệ thông hóa sô liệu đo lường (sô hóa) các loại virus đó.

Tới năm 2010, 52 loài virus hại thực vật đã được xác định ở Việt Nam, phần lớn

đã được giải trình tự Trong sô này, chủ yêu là các virus thuộc 2 chỉ: Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus) Đây cũng là 2 chi virus hại thực vật lớn nhât, mỗi chi

chiếm khoảng 20% tổng số virus hại thực vật toàn thế giới [17]

Với loài S tuberosum L phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như sau:

e PLRV - Peters phát hiện năm 1967 ở Hà Lan, có nhiều triệu chứng khác nhau.Loại virus này gây hại mạnh ở Châu Âu Khả năng giảm năng suất từ 40 - 90% Ở ViệtNam khoai tây ít bị nhiễm virus này [13]

e PVY~—Smith phát hiện năm 1931 tại Anh Nhóm này gồm 3 dòng chính: PVY°gây bệnh quan trọng ở khắp thé giới, PVYX gây ra các vết chết hoại trên gân lá thuốc

lá, PVY€ ít nguy hiểm, không phô biến trên thế giới Bên cạnh đó mới phát hiện raPVYNTN, PVYNW_PpVYZ.PVYXTN, Virus Y kết hợp với virus PLRV sẽ gây hại rat nặng

ở Châu Âu Khả năng gây giảm năng suất từ 50 — 90% Riêng virus Y đặc biệt gây hạinặng ở các vùng trồng khoai tây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam [15].

© _ PVA - Nhóm virus này khá phô biến trên thế giới, Murphy và Mckay phát hiện

ở Eire năm 1932 Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng AI cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S tuberosum.cv King Edward, ngược lại dong A2 thì không Virus

này gây hại giảm năng suất trên 50% [13]

®© PVX - phát hiện ở Anh bởi Smith năm 1931 Theo Cockerham (1970) PVX được chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng của gen trội tạo HR: PVXI, PVX2, PVX3,

PVX4, ngoài ra mới phát hiện PVXHB gây giám năng suất từ 10 — 25% [18]

e PVV— Rozendaal phát hiện ở Hà Lan năm 1971, gây hại nhiều ở Châu Âu và

Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm Qua phân tích Cp (Coat protein) chi

ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HRở loài S tuberosum cv Pentlva Dell

© PVM - Schitz va Folson phát hiện nam 1923 tai MY, khá phỏ biến và gây ravài triệu chứng la Vũ Triệu Man (1984) cho biết hai giống khoai tây ở Nga đã bị nhiễmvirus PVM làm giảm năng suất tới 60 — 70%

¢ _PVS - Được phát hiện ở Hà Lan vào năm 1952, gây hại ít làm giảm năng suất

từ 10 — 15% thường gây hại khi kết hợp với các virus khác

1.3.2 Giới thiệu về PVY

Virus khoai tây Y (PVY) là một loại virus gây bệnh ở thực vật thuộc họ

Potyviridae, và là loại virus thực vật gây hai trầm trọng nhất đến sản xuất khoai tây Sựnhiễm PVY của cây khoai tây dẫn đến nhiều triệu chứng khác nhau tùy thuộc vào chủngvirus Các triệu chứng nay nhẹ nhất là giảm sản lượng, nhưng bắt lợi nhất là 'bệnh đốmhoại tử củ khoai tây (PTNRD) Các đốm vàng hoại tử khiến khoai tây không thể bánđược và do đó có thé dẫn đến mất thu nhập đáng kể Do khoai tây nhân giống theophương pháp vô tính, nên việc lan truyền bệnh virus từ thé hệ trước sang thé hệ sau ngàymột tăng, dẫn đến hiện tượng thoái hóa giống do virus Việc nhiễm PVY được truyềnqua các vectơ rệp gây ra hiện tượng thoái hóa giống khoai tây Tốc độ thoái hóa giốngcàng nhanh ở các nước có khí hậu nhiệt đới Rệp là vecto truyền bệnh virus, sinh sôi nay

nở nhanh trong điều ki ấm áp Chính vì thế, sau một vài thế hệ trồng, người sản xuất

phải thay thế giống cũ bằng giống mới sạch bệnh Để làm việc này, các nước sản xuất

khoai tây lớn đều phải xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh rất tốnkém Việc cây khoai tây bị nhiễm virus ngày càng gia tăng trong vải năm qua đã dẫnđến thiệt hại đáng kể cho ngành khoai tây Sự gia tăng nhiệt độ trung bình của mùa đông

do hậu quả của sự nóng lên toàn cầu cũng dẫn đến sự gia tăng số lượng rệp, do đó dẫnđến sự gia tăng sự phân bố của virus.

Vật chủ, chủng và triệu chứng của virus Y trên khoai tay

PVY thuộc giống Potyvirus, là chỉ lớn nhất của virus thực vật và có thé là chi virus

có khả năng phá hoại mạnh nhất trên cây khoai tây Chỉ này bao gồm hơn 200 loài gâythiệt hại đáng kể trong lĩnh vực nông nghiệp [19] PVY lây nhiễm cho nhiều loài thựcvật quan trọng về kinh tế, bao gồm khoai tây (Solanum tuberosum), thuốc lá (Nicotiana

tabacum), cà chua (Solanum lycopersicum) và tiêu (Capsicum spp.) [20] Khả năng

chống lại sự lây nhiễm PVY của cây chủ là thấp trong nhiều trường hợp Ruộng khoaitây bị nhiễm PVY có thể bị giảm năng suất từ 10 - 100% [21]

PVY có nhiều chủng khác nhau, tùy theo các triệu chứng gây ra ở các loài câykhoai tây khác nhau Theo truyền thống, ba chủng PVY chính được công nhận: PVYC,PVYN và PVYO PVYC ban đầu được gọi là Potato Virus C, là virus đầu tiên được

công nhận và được xác định vào những năm 1930 PVYC gây ra các mô hình khảm nhẹ

hoặc vệt 6 [22] Không giống như các chủng PVY khác, các chủng PVYC không lâytruyền qua rệp [ 23] Dòng PVY thứ hai là PVYN [24] PVYN dẫn đến hoại tử lá và

gây hại nhẹ hoặc thậm chí không gây hại cho củ Dòng thông thường của PVY được ký

hiệu là PVYO Chủng này gây tổn thương củ nhẹ và không gây hoại tử lá [25] CảPVYN và PVYO đều có thể lây truyền qua rệp Ở Châu Âu, hai chủng này đã đượcchứng minh là đã tái tổ hợp dé tạo thành PVYNTN [26] PVYNTN gây bệnh dém vònghoại tử củ khoai tây (PTNRD) Những củ bị hư hại do PTNRD trở nên không thể bánđược do đó gây hại lớn hơn so với việc bị nhiễm bởi các chủng khác

Một số đặc điểm của virus Y:

Theo Vũ Triệu Mân (2018) [27], virus Y có dạng hình sợi nhỏ, cong queo, dai

khoảng 720 - 730nm, đường kính lInm và có cấu trúc xoắn Sợi virus Y có đặc điểmthường cuốn lại với nhau, ít bị tách rời

Đặc điểm chống chịu của virus Y: Theo Gogan (1970), ngưỡng pha loãng của dichcây bệnh khoản 10 — 2 — 10 - 3 Nhiệt độ phòng thí nghiệm (in vitro) có thể giữ đặc tínhlây bệnh giọt từ 48 - 72h Theo Peter Wildy (1971), Q10 của virus Y là 50 - 60%C.Zukin (1976) cho biết, virus giữ được tính độc trong lá tươi 6 ngày (ở điều kiệnphòng thí nghiệm) Nếu giữ lá tươi ở một lớp CaCh ở 4°C có thé giữ virus trong 6 tháng.Dùng lá khô ở điều kiện động lạnh có thể bảo quản virus PVY tới 11 tháng Virus Y cósức chống chịu kém trong điều kiện in vitro

Virus Y truyền bệnh nhờ phương pháp tiếp xúc giọt dịch và truyền bệnh nhờ côntrùng môi giới kiểu không bền vững, truyền bệnh nhờ một số loài rệp thuộc họ Aphididaechủ yếu là rệp Myzuz persicae Sulze Và các tệp Myzus ornatus, Macrosyphum

euphorbiae, Aulacorthum circumflexum, Aphis naturlli va Aphis gossypii (Kennedy-day

va Eastop, 1962).

Rép hút truyền bệnh khoảng 10 - 30 giây Virus Y không cần qua thời kỳ tiềm antrong cơ thể rệp mà có thể truyền ngay trong 15 giây vào cây khỏe Virus sống trong cơthể rệp lâu nhất là 2 giờ (Gibbs và Harrison, 1975)

Ký chủ của virus Y có khoảng 60 loài cây, chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae) rồiđến họ rau muối (Chenopodiaceae) và họ đậu (Fabaceae) (Thornberry, 1966) Nhiều họcây khác cũng bị bệnh Cây chỉ thị quan trọng nhất là Solanum demissum hybride A6,trong điều kiện truyền bệnh trên lá cắt rời ở nhiệt độ 20°C, cường độ ánh sáng 1200 -

1400 lux, lá cây sẽ tạo các vết đồm vòng khuyên có màu xám đen Ngoài cây A6 còn cóthé dùng các cây khác: Chenopodium amarniticolor, C.quinoa và một vài giống

Nicandra physaloides, Nicotiana repanda, N Rustica, N Glutinosa, N.tabacum, Physalis floridana, Capsicum frutescents.

1.3.3 Tác hai của PVY đến sản xuất khoai tây

Virus khoai tây Y (PVY) là một trong 10 loại virus hai thực vật nguy hiểm nhấtthế giới [28] PVY cũng là tác nhân chính gây hại cho cây thuốc lá và cây tiêu, nó ít gây

nguy hại hơn cho cây cà chua và cà tím [29], [30], [3 I].

Do những tác động quan trọng của nó đến sản xuất khoai tây nên có rất nhiều

chương trình quy mô lớn được thực hiện để kiểm soát sự bùng nỗ PVY như là các bien pháp dự phòng, kiểm soát tác nhân truyền bệnh, chọn tạo giống khoai tây khang giảm bệnh virus thì không chỉ khoanh vùng những tổn thất trực tiếp trong sản xuất mà

còn những tồn thất gián tiếp như là việc tăng chỉ phí sản xuất (ví dụ như củ giống, daotạo và máy móc), chỉ phí cho các chương trình kiểm soát và quản lý dịch bệnh (kiểmsoat virus, cấp chứng nhận, thanh lọc, thử nghiệm virus và các công cụ quản lý) và mộtvai chi phí về môi trường và xã hội (thất thoát tài nguyên, thay đổi văn hóa và sự nhiễmtạp của môi trường) Có một báo cáo chỉ ra, cả tồn thất trực tiếp và gián tiếp do PVYgây ra ước tính khoảng 34 triệu đô la Mỹ mỗi năm ở bang Idaho (USA) [32] Nó đượcước tính là cứ mỗi 1% củ giống bị nhiễm PVY thì sẽ làm giảm năng suất của khoảng

180 kg/ha, quy đổi ra là mat khoảng 18$/ha [3]

Thiệt hại lớn nhất do PVY gây ra đó là khi củ giống đã bị nhiễm bệnh trước khitrồng (nhiễm thứ cắp) và khi thực vật bị nhiễm virus từ củ giống, năng suất sẽ giảm từ

10 — 80% [33], [34] Có một nghiên cứu trên 30 giống bị nhiễm PVY từ củ được trồng

ở chậu vai đã chứng minh rằng năng suất bị giảm từ 50 - 85% [35]

1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai tây

Có 3 chiến lược chính để ngăn chặn tác hại của bệnh virus hại khoai tây:+“ Xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây giống sạch bệnh, cung cấp giống sạch chosản xuất thay thế giống đã thoái hóa

Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhé bỏ các cây nhiễm bệnh virus, tránh lây lan raquan thể nhằm duy trì tình trạng sạch bệnh của ruộng sản xuất

Chọn tạo giống kháng bệnh virus Phát triển nhanh các giống có tính kháng, cócác đặc tính nông sinh học ưu tú cho sản xuất Đây là hướng có ý nghĩa quantrọng và mang tính bền vững nhất, nhưng cũng không dễ dàng thực hiện.1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh

Để ngăn chặn và làm chậm quá trình thoái hóa giống gây ra do virus, hau như ởtất cả các nước trồng khoai tây đều phải xây dựng hệ thống sản xuất giống sạch bệnh.Trong đó, tiêu chuẩn hàng đầu của củ giống là phải sạch bệnh virus Người sản xuất chỉđược phép sử dụng giống đã được xác nhận Sau một số thế hệ trồng, do bị nhiễm virus,

củ giống bị thoái hóa năng suất, phẩm chất giảm dần bắt buộc phải thay thế bằng giốngmới sạch bệnh Hệ thống sản xuất giống tốt sẽ góp phần giảm thiểu quá trình thoái hóagiống vì đây là một trong những hạn ché hàng đầu đói với năng suất khoai tây [36], [37].Thông thường, hệ thông giống gồm đầu vao là giống sạch bệnh hoàn toàn, đượcnhân trong phòng cấy mô gọi là giống gốc (basic seed) hay còn gọi là giống thế hệ G0.Giống này tiếp tục nhân trong nhà màn hay nhà kính bằng công nghệ thủy khí canh chocác cây và củ nhỏ nếu hoàn toàn sạch bệnh cũng được xem là thế hệ G0 Cây và củ nhỏG0 tạo ra được nhân tiếp trong điều kiện nhà màn hay đồng ruộng cách ly với nguồnbệnh dé tạo ra thé hệ G1, G2, G3 Trong điều kiện các nước trồng khoai tây có khí hậunhiệt đới như Việt Nam, rệp phát triên mạnh, khoai tây nhiễm virus nhanh, thoái hóanhanh, đến thế hệ G3 là khoai đã chuyển xuống cấp xác nhận và đưa vào sản xuất khoai

“thịt chứ không thể tiếp tục nhân đề làm giống Ở các nước Châu Âu, Bắc Mỹ, khí hậulạnh, rệp không phát triển, khoai tây có thể nhân tới thế hệ 9, 10 mà vẫn còn giữ chấtlượng sạch bệnh cao [38] Thời gian nhân giống càng ngắn, số thế hệ nhân càng ít, củgiống tạo ra càng có độ thoái hóa thấp, nhưng giá thành sản xuất giống càng cao

Có thé tham khảo hệ thống sản xuất và các cắp giống của Canada, một nước trồngkhoai tây tiên tiến ở Bắc Mỹ, cho đến tận thế hệ thứ 6 giống mới bắt đầu đưa vào dâytruyền sản xuất khoai thương phẩm Thế hệ thứ 7 mới tính là giống xác nhận Thời gian

nhân giống được kéo dài trong khi chất lượng sạch bệnh vẫn được duy trì dẫn đến giảmgiá thành sản xuất giống rất nhiều [39]

Trong khi ở các nước nhiệt đới trồng khoai tây như Việt Nam, các năm đầu do phảinhân từ cây cấy mô, trong điều kiện nhà màn nhà lưới chỉ phí cao, lại không thẻ triểnkhai được ở qui mô lớn, số củ giống tạo ra không nhiều, thời gian chỉ được kéo dai 2 -

3 thế hệ, chính vì thế hệ thống sản xuất giống rất khó thực hiện và giá thành củ giốngsạch bệnh rất cao

Bang 1.3 Hệ thong sản xuất các cấp gióng khoai tây trên đồng ruộng tại Canada

Cấp giống Thế hệ giống

Pre —elite (siêu nguyên chủng) Thế hệ giống thứ nhất

Elite 1 (nguyên chủng 1) Thé hé gidng thir 2

Elite 2 (nguyén chung 2) Thế hệ giống thứ 3

Elite 3 (nguyên chủng 3) Thế hệ giống thứ 4

Elite 4 (nguyên chủng 4) Thế hệ giống thứ 5

Foundation (giống nền ) Thế hệ giống thứ 6

Certified (giống xác nhận) Thế hệ giống thứ 7

Trung Quốc là nước có diện tích trồng khoai tây lớn nhất thế giới (5 triệu ha) Cácnhà khoa học và quản lý cũng cho rằng, việc xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây giốngsạch bệnh có ý nghĩa quyết định đến sản xuất khoai tây của Trung Quốc Gần đây họ đềxuất việc phát triển hệ thông sản xuất khoai tây giống 3G (Kaiyun Xie 2010 , 3G SeedPotato System in China CIP Beijing Liaison Office ) Các tác giả đã phân chia giốngthành 3 thế hệ (3G) va cũng là 3 cấp giống khác nhau G1 là thế hệ 1 (pre basic) baogồm các củ minituber, micro- tuber, củ nhỏ sản xuất từ in vitro, được trồng trong điềukiện cách ly Tiêu chuẩn chung là sạch bệnh 100% và có khói lượng củ từ 1 - 20g G2

là thế hệ 2 (basic) sử dụng củ G1 làm giống, sản xuất trong điều kiện chuẩn vùng núicao, mật độ rệp thấp, khí hậu lạnh, không có bệnh thuộc đối tượng kiêm dịch, cách lytốt, khoai thịt và các giống khác phải cách xa ít nhất 800m Tiêu chuẩn: sạch bệnh nam,khuẩn, virus < 1%, khối lượng củ 25 - 75g/củ G3 là thế hệ 3 (certified- giống xác nhận)

sử dụng củ G2 (basic) làm giống, sản xuất trong điều kiện chuẩn: vùng núi cao, mật độrệp thấp, khí hậu lạnh, không có bệnh thuộc đối tượng kiểm dịch, cách ly tốt, khoai thịt

và các giống khác phải cách xa ít nhất 800m Tiêu chuẩn là sạch bệnh nắm, khuẩn, virus

< 5%, khối lượng củ 25 - 100g/củ

Theo các tác giả Trung Quốc, việc tạo chu kỳ sản xuất ngắn để dễ kiểm tra chấtlượng, kiểm tra bệnh virus Việc kiểm tra được thực hiện rất nghiêm ngặt đối với cáccây giống gốc in vitro cũng như quá trình nhân nhanh in vitro trong phòng thí nghiệm.Kiểm tra từng phan đối với thế hệ giống G1 bởi ELISA test trong nhà màn Kiểm trabằng mắt ở thế hệ G2 và G3 trên đồng ruộng Việc phân cấp 3G sẽ rất thuận lợi cho hệthống đăng ký giống sản xuất và thuận lợi cho việc sử dụng và quản lý thẻ xác định cấpgiống Theo tính toán, nhu cầu sản xuất khoai tây giống của Trung Quốc sẽ như sau:Với diện tích trồng 5 triệu ha, mỗi ha cần 2.25 tan, nếu năng suất củ giống 22.5 tắn/ha

sẽ cần 11,25 triệu tan G3 (500,000 ha); 1,125 triệu tấn G2 (50,000 ha) 4,5 - 6,0 tỷ củminituber G1 (trồng 90,000 - 120,000 củ minituber/ha) Hệ thống 3G cũng nhận nhu cầucây in vitro và củ G1 (minituber) làm tăng đáng kể chi phí Cần nghiên cứu giảm giáthành qua tăng hiệu quả sản xuất các cây in vitro và củ minituber Các học giả TrungQuốc đưa ra kết luận :

- 3G là sự lựa chọn bắt buộc dé cải tiến chất lượng giống hiện nay cho Trung

Qua các thông tin trên cho thấy, vai trò của chất lượng giống mà thực chất là độsạch bệnh của củ giống trong đó bệnh virus đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong sảnxuất khoai tây

Việt Nam hiện đang tồn tại hai hệ thống sản xuất khoai tây giống chính :

Hệ thông sản xuất khoai tây giống ở Đà Lạt (1500 m so với mặt biển)

Hệ thống này căn bản dựa trên các bước sau đây:

1) Nhân nhanh giống sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) ở phòng thí nghiệm.2) Chuyển các cây sạch bệnh từ trong ống nghiệm ra cấy tại nhà lưới dé tạo cácbồn cây mạ

3) Cắt ngọn ở bồn cây mạ và làm cho các ngọn cắt trở thành các cây con có rễ ởcác bầu cây nhỏ với mật độ là 1 cây/ 1 bầu ở nhà lưới

4) Chuyển các cây con đã có bộ rễ đủ tiêu chuẩn ra trồng tại đồng ruộng cách ly

để sản xuất củ giống G1

5) Trồng các củ giống G1 trên đồng ruộng cách ly dé sản xuất củ giống G2 nhằmcung cấp cho sản xuất Với hệ thống sản xuất khoai tây giống này, năm 1982, khoảng2,5 triệu cây con (rooted cuttings) đã được sản xuất bởi 10 gia đình nông dân Nhữngnăm gan đây, Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây-Rau và Hoa (PVFC) Đà Lạt cũng đãsản xuất các cây con theo phương pháp nói trên với quy mô khoảng 300.000- 1.000.000cây con/năm Hệ thống sản xuất khoai tây giống ở Đà Lạt cho đến nay vẫn đang đượcvận hành một các có hiệu quả, thé hiện rõ được tính tiên tiến, bền vững, đơn giản và sựđộc đáo nôi tiếng trên thế giới.

Những năm gần đây, thông qua sự hợp tác giữa Bộ môn Cây có củ, thuộc Trungtâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có củ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm với

Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt, Viện Khoa học Nông nghiệp

Miền Nam, mỗi năm, khoảng 200.000 củ mini của giống Atlantic và giống Sinora đãđược sản xuất tại Đà Lạt để chuyển ra nhân giống tại Đồng bằng Bắc Bộ Hệ thống nhângiống này đã và đang chứng tỏ là có hiệu quả tốt và có nhiều triển vọng [40]

Hệ thong sản xuất khoai tây giống ở Dong bằng Bắc bộ (5 m so với mặt biển)

Hệ thống này đã được nghiên cứu xây dựng ở Viện Sinh học Nông nghiệp, Họcviện Nông ngghiệp Việt Nam được Nguyễn Quang Thạch và cộng sự nghiên cứu vàphát triển từ những năm 1980 đến nay Hệ thống bao gồm các bước chủ yếu sau đây:

1) Nhân nhanh các vật liệu sạch bệnh in vitro trong phòng thí nghiệm.

2) Nhân nhanh các vật liệu sạch (ngọn cắp bệnh từ các cây in vitro thông qua công

nghệ khí canh (aeroponics) ở nhà lưới

3) Sản xuất củ giống mini từ ngọn cắt thông qua công nghệ khí canh (aeroponics)hoặc từ các cây con trồng trên giá thể hỗn hợp đất mùn ở nhà lưới

4) Sản xuất củ giống nguyên chủng ở đồng ruộng cách ly và 5) Sản xuất củ giốngxác nhận ở đồng ruộng cách ly Những năm gần đây, tại Viện Sinh học Nông nghiệp,mỗi năm khoảng 1 triệu củ mini đã được sản xuất theo hệ thống này Hệ thống nay đãthể hiện sự vận hành có hiệu quả, mang tính khả thi cao, đã và đang được được ứngdụng và phát triển ngày cảng rộng rãi ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam

Bang 1.4 Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tay Việt Nam

SA Siêu nguyên Nguyên R Chỉ tiêu chủng (G0) | chủng (G1) Xác nhận

Độ thuần ruộng giống (% số cây đồng

nhất) 100 99 98

Hội Binh (EieBlGTðHAS rastoni) (% SỐ 00 00 05

cây không lớn hơn)

(Quyết định 57999/OD/BNN-KHCN 29.12.2003)

SƠ ĐÔ NHÂN

Tử tật liệu môi cấy mô

1 vit lậu bạn đấu: Tả bảo ben đâu co TẾ bo củy an đâu

2 Siêu nguyén chúng: S Năm thử nhát

Năm thừ hai — Cú

4 Nguyễn chủng 2:20 G4 Năm the tư awe

Š Xác nhận: 2000 tứ Năm thử nằm Giéeg xác chi SX

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thông sản xuất khoai tây giống của Viện Sinh học Nông nghiệpChú thích: Theo số liệu báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu làm chủ công nghệ vàxây dựng mô hình công nghiệp sinh học sản xuất giống khoai tây, rau và hoa sạch bệnh

Mã số: KC.04.02/06-10 [41]

1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhỗ bó các cây nhiễm virus

Để có giống khoai tây sạch bệnh virus, từ năm 1919, Limasset, Cornuet vàKassanis đã áp dụng phương pháp nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng (meristem) Năm 1977,

R Nozeran đã sáng tao ra phương pháp nhân nhanh khoai tây in vitro Từ đó đến nay

kỹ thuật này đã không ngừng phát triển, đặc biệt như kỹ thuật nhân nhanh ngọn câykhoai tây cấy mô trên bồn mạ của các tác giả Nguyễn Văn Uyén và Peter Vander Zaagtai Đà lạt cũng như kỹ thuật nhân cây in vitro trên bồn khí canh của Viện Sinh Học Nôngnghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Van dé quan trong là làm thé nao dé duy tri

độ sạch virus của các cây được nhân ra khi trồng trên đồng ruộng Hệ thống chọn lọc vệsinh đồng ruộng nhồ bỏ cây bệnh nhằm chống bệnh lây lan đã được thiết lập ở Hà Lan,sau đó sang Pháp và đến các nước khác [27] Hệ thống thanh lọc vệ sinh đồng ruộngđược hình thành, đến nay sau hơn 90 năm hệ thống này đã thành nhiều đạng khác nhau.Trung tâm khoai tây quốc tế CIP đã áp dụng biện pháp vệ sinh chọn lọc ở nhiều nướcĐông Nam A như Băng-la-đét, Philippin, Indonesia và đã thu được một số kết quả Ởnước ta, phương pháp này là phương pháp đơn giản, dé thực hiện, có hiệu quả cao vàduy trì được chất lượng giống, qua đó ồn định năng suất khoai tây.

Kỹ thuật thanh lọc đồng ruộng có các khâu chính sau: Tổ chức đội thanh lọc giốnggồm những người giàu kinh nghiệm, quan sát triệu chứng và giám định chính xác câykhoai tây bị bệnh virus hay nắm khuẩn dé nhỏ bỏ Các cây cần nhỏ bỏ quan trọng nhất

là các cây bị bệnh virus (khảm lá, xoăn lùn, cuốn lá), cây bệnh héo xanh vi khuẩn và cácbệnh khác Thời diém quan sát cần thực hiện ít nhất 3 lần: 30, 50, 70 ngày sau trồng.Thời gian quan sát tránh lúc nắng gắt, trời mưa hoặc chiều tối thiếu ánh sáng Tốt nhấttiến hành vào đầu giờ buổi sáng khi vừa đủ ánh sáng dé quan sát Khi quan sát đứngquay lưng về hướng mặt trời Cần tuân thủ nguyên tắc: “Kiểm tra và thanh lọc ở ruộng

có cấp giống cao nhất trước.”

Kết quả điều tra của dự án hợp tác Việt Đức phát triển khoai tây (Menz, 2006) chothấy tỷ lệ bệnh virus trên khoai tây trồng ở đồng ruộng Việt Nam giao động từ 20 - 70%.Theo tính toán, nếu vụ | có 0,63% cây bệnh thi vụ 4 sẽ có 21,98% cây bệnh Điều đócho thấy bệnh virus hại khoai tây ở Việt Nam là rất nghiêm trọng, việc thanh lọc vệ sinhđồng ruộng nhất là ruộng giống rất cần thiết

Ngoài biện pháp thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, việc áp dụng một số biện pháptrồng trọt cũng có hiệu quả khắc phục sự thoái hóa khoai tây do nhiễm virus

© Chon vùng trồng thích hợp, vùng có khí hậu ôn hòa, mát mẻ, thường xuyên cógió chống rệp Tránh trồng lại ở các vùng dat đã trồng cây họ cà trước đó

© Chu động phòng trừ môi giới truyền bệnh, áp dụng biện pháp kỹ thuật cạnhtác,biện pháp phòng trừ tổng hợp và biện pháp sinh học để phòng trừ

1.4.3 Chon tạo giống kháng bệnh virus

Chọn tạo giống kháng virus, phát triển nhanh các giống có tính kháng virus đồngthời mang các đặc tính nông sinh học ưu tú cho sản xuất là hướng có ý nghĩa quan trọng

và mang tính bền vững nhất trong các chiến lược chống lại tác hại của bệnh virus Tuynhiên, chiến lược này đòi hỏi thời gian và không dễ dàng thực hiện

1.5 Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus

1.5.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống

Các phương pháp lai tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như kỹ thuậtlai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc [42]

Nhược điểm của phương pháp truyền thống là những khó khăn về mặt đặc tinh di

truyền của kỹ thuật trồng trot (Solanum tubersosum) Đó là bộ gen của khoai tây trồng

trọt ở thé tứ bội tetraploid (2n = 4x = 48 nhiễm sắc thé), gây ra sự phân ly sau lai tạo vớimột quan thé rat lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc tốn rất nhiều công sức Quátrình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm dé có được một giống lai ra đời Ngoài ra, nhiều đặctính chống chịu do nhiều gen quy định sẽ có thể mất dan trong quá trình chọn lọc ở cácthé hệ tiếp sau

Mặt khác, các gen chống chịu stress sinh học (bệnh virus, nam, khuan ) hoặc phi

sinh học (hạn, ngập, mặn ) hau hết có từ nguồn khoai tây dai khác loài có độ bội và mứcEBN khác nhau (endosperm balance number) không thẻ thực hiện lai hữu tính thôngthường nên cần có sự can thiệp của các phương pháp mới trong chọn tao giống khoai tay

Đó là các phương pháp công nghệ sinh học Có 4 nhóm phương pháp công nghệ sinh học

chính được sử dung là: Phương pháp dung hợp tế bào tran, phương pháp chọn tạo giống

có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, phương pháp chuyền gen và phương pháp chỉnh sửa

1 - - Lai ban dau

5 i88 68t i Quan sát quần thể lớn, chọn lọc dòng có khả năng,

hình thành củ tốt

Chọn cây kháng virus và tuyến trùng, chọn củ có

3 50,000+ 1 hình dang và màu sắc phù hợp, loại bỏ những kiểu

7 100 500 Chọn lọc như năm thứ 6

8 10 1,250 Chon loc nhu nam thir 6

9 4 2,000 Khao nghiém quéc gia

" ° 1 100,000 Khao nghiệm quốc gia, bắt đầu sản xuất giống

(Nguồn [43])

1.5.2 Phương pháp công nghệ sinh học

1.5.2.1 Dung hợp tế bào trần

a Giới thiệu chung về dung hợp tế bào trần

Một trong những lĩnh vực quan trọng nhất cho sự phát triển công nghệ nuôi cấy

mô tế bào thực vật đã được chứng minh là công nghệ tách, nuôi cấy và dung hợp tế bàotrần Thành tựu gần đây là các ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào trần thành câyhoàn chỉnh; dung hợp tế bao trần dé tạo các thể lai mang các đặc tính mong muốn Năm

1960, Cooking và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể sử dụng enzyme dé phângiải thành tế bào thực vật một cách dễ dàng, điều này có ý nghĩa vô vùng to lớn đối với

y tế bảo trần được áp dụng không chỉ cho

di truyén học tế bào thực vật bậc cao Nu

dung hợp tế bào trần mà còn cho kỹ thuật ADN ngoại lai, cơ quan tử, vỉ khuản và virus

Do đó, kỹ thuật tách, nuôi cấy tế bào trần đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu rất quan

trọng trong công nghệ sinh học thực vật Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao

gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai

soma.

Chọn lọc các dòng dị nhân

Tái sinh chỗi Sự ra hoa - lai soma

Hình ảnh điện di DNA của các ding bố

mẹ (2B, 3C, 4D, SE) va con lai soma

(A) Các đoan DNA của các dòng bố mẹ

được đánh dấu bởi mũi tên đỏ và xanh.

Lai soma ở khoai tây

Hình 1.2 Sơ đô tao giống khoai tây bằng dung hợp tế bào tran

Tế bào trần và sự phát triển tế bào tran

Tế bào trần (protoplast) là phần của tế bào nằm trong thành tế bào, có khả năng conguyên sinh và có thể được tách rời khỏi thành tế bào bằng phương pháp cơ học hoặcemzym Tế bào trần được bao bọc bởi màng nguyên sinh, nó có thể tái tạo lại thành tếbào mới và phân chia Tế bào trần có thể tách từ mô hoặc từ các cơ quan thực vật như

lá, rễ, hạt phan hoặc mô seo (callus)

Có thé tóm tắt quá trình phát triển kỹ thuật tế bào tran (prptoplast) đến năm 2015qua tổng quan của Saurabh Bhatia (2015) [44] như sau:

Năm 1880, Hanstein nêu ra tên gọi protoplast để chỉ các vật chất sông được baoquanh bởi màng tế bào

Năm 1892, Klercker Klercker là người đầu tiên phân lập protoplast từ tế bào conguyên sinh của cây Stratiotes aloides bằng vi phẫu cơ học

Năm 1927, Kiister chứng minh rằng trong quá trình chín của trái cây, thành tế bào

đã bị thủy phân dé lại các protoplast tự do Ông dé xuất nên sử dụng phương pháp sinh

lý học theo cơ chế này dé phân lập protoplast

Năm 1931, Chambers phân lập protoplast từ các mô của củ hành tây (vảy hành

được ngâm trong 1 M sucrose cho đến khi protoplast co lai thì tiền hành tach protoplast)

Năm 1960, Cocking là người đầu tiên sử dụng enzyme để giải phóng tế bào trần.Năm 1971, Nagata và Takebe đã phát triển kỹ thuật tạo các dòng vô tính tế bào từcác tế bào trần phân lập được của cây thuốc lá.

Năm 1972, Carlson và cộng sự là người đầu tiên tạo ra con lai soma của hai loàiNicotiana khác nhau (N glauca x N langsdorfii) Ông cũng đã chứng minh hiệu quả

của việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần trong nghiên cứu di truyền.

Nam 1972, Potrykus và Durand đã báo cáo sự hình thành callus từ các tế bào trần

đơn lẻ của Petunia (hoa đã yên thảo).

Năm 1974, Vasil và Vasil báo cáo về sự tái sinh của cây thuốc lá và cây Petunia

từ protoplast và bắt đầu nuôi cây tế bào trần ngô

Năm 1975, Shepard và Roger đã dé xuất phương pháp phân lập một sé lượng lớn

tế bao trần của thuốc lá trong điều kiện nồng độ thẩm thấu của dung dịch gây co nguyênsinh bên ngoài tương đối thấp

Năm 1977, Potrykus và cộng sự báo cáo sự hình thành callus từ tế bao trần của

ngô.

Năm 1980, Veronica phân lập protoplast từ Aspergillus fumigatus bang cách sửdụng hỗn hop enzyme phân giải tách từ Trichoderma harzianum

Năm 1984, Glimelius phân lập tế bào trần từ callus của Brassica với hiệu quả cao

trong môi trường chứa casein thủy phân và nông độ cao của auxin.

Năm 1986, Firoozabady và Deboer Phân lập protoplast của bông (từ lá mầm vàtán lá) Chứng minh được năng suất và khả năng tồn tại của tế bào trần, sự tái tạo thành

té bao và sự phân chia tế bào bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như: kiểu gen, tuổi mô vàđiều kiện sinh trưởng của cây, hỗn hợp và nồng độ enzyme phân giải thành tế bào, thờigian ủ và môi trường nuôi cấy

Năm 1986, Yamada và cộng sự báo cáo đã tạo được callus từ tế bào trần của giống

lúa Fujiminori (Oryza sativa L.) và tái sinh cây lúa thành công.

Năm 1988 Wei và Xu đã tách thành công protoplast từ các lá mầm chưa trưởngthành của sáu giống đậu tương (Glycine max L.) Té bào tran được nuôi cấy trong môitrường lỏng KP8 bổ sung 0,2 mg/ L 2,4-D, 1 mg/ L NAA, và 0,5 mg/ L ZT Đã tái sinhthành công 87 cây từ protoplast của bồn giống đậu tương và thu được hạt có khả nangtrồng lại

Năm 1988, Lũhrs va Lérz đã phân lập được tế bào tran từ huyền phù tế bào lúamạch và nghiên cứu tiềm năng tái sinh của chúng

Năm 1988, Harris và cộng sự tách được tế bào trần từ huyền phù tế bào bao phan

lúa mi (Triticum aestivum L cv Chris).

Năm 1990, Li va Murai đề xuất quy trình tái sinh cây từ tế bao tran của giống lúa(O sativa L.) Nipponbare và Đài Bắc 309

Năm 1992 Hayakawa và cộng sự đã chuyền gen mã hóa protein vỏ của virus sọclúa vào tế bào trần của hai giống lúa Japonica bằng phương pháp xung điện

Nam 1995, Jain và cộng sự dé xuất quy trình cải tiến dé tái sinh cây từ tế bao trầnlúa Indica và Japonica bằng cách trải tế bao trần nuôi cấy có nguồn góc từ huyền phù tếbào phôi trên bề mặt màng lọc có nhúng agarose của Lolium multiflorum và O ridleyi,kết hợp với việc sử dụng môi trường tái sinh chồi chứa maltose

Năm 2004, Rosenbluh và cộng sự thực hiện việc chuyên các histon lõi vào

protoplast Petunia, chứng minh khả năng sử dụng tế bào trần như một công cụ dé đưacác đại phân tử vào tế bào thực vật

Năm 2007, Yoo và cộng su đề xuất sử dụng tế bào trần của Arabidopsis như một

hệ thống tế bào đa năng đề phân tích biểu hiện gen nhất thời

Năm 2008, Yang và cộng sự phân tích hồ sơ biểu hiện của các gen liên quan đếnquá trình tái tạo thành tế bào trong quá trình nuôi cấy tế bào trần ở bông

Gan đây (2018), hàng loạt tác giả đã sử dụng tế bào trần dé thực hiện quy trình

co nguyên sinh sau đó tác động cơ học dé giải phóng tế bào tran Tuy nhiên, phương

pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượng thực vật; mật độ tế

bào trần thu được không cao; khả năng tái sinh yếu Phương pháp tách tế bào trần bằngenzyme đã khắc phục được những nhược điểm trên Hiện nay, phương pháp enzyme

được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.

Tách tế bào trần bằng enzyme là một phương pháp an toàn thường được thựchiện trong một dung dịch đơn giản có độ thâm thấu cao (chất có tác dụng bổ sung ápsuất thẩm thấu trong thực vật hoặc nuôi cấy tế bào thực vật, ví dụ, sucrose), cùng vớicác enzyme phân hủy thành tế bào Mội

sử dụng cho mục đích này Như vậy có thể tách tế bào trần bằng ba phương pháp:

hợp enzyme xenlulaza và pectinaza được

Phương pháp cơ học: Phương pháp cơ học phân lập tế bào trần lần đầu tiên được

thực hiện bởi Klercker.

Phương pháp enzyme tuần tự: Phương pháp enzym tuần tự được Takebe và nhữngngười khác sử dụng lần đầu tiên vào năm 1968

Phương pháp hỗn hợp enzyme: Nagata và Takebe đã báo cáo sự tái sinh thực vậtđầu tiên từ các nguyên sinh chất cô lập vào năm 1971 và kể từ đó điều này đã đạt được

ở 330 loài thực vật bậc cao (hạt trần 10, cây đơn tính 32, cây đơn tính 288) [44]Trong phương pháp enzyme hỗn hợp, cả hai enzyme được sử dụng cùng nhau đểgiảm thời gian ủ và khả năng nhiễm Power and Cocking đã sử dụng phương pháp này

dé phân lập nguyên sinh chat từ một số ngành khoa học thực vật và nó cho năng suất rấttốt, cao tới 2,5 x 105 protoplast/ gram mô lá [46]

Quy trình tách tế bao trần điển hình có thể bao gồm một số giai đoạn như:Tiền xử lý mô lá trong môi trường phòng thí nghiệm

Xt lý co nguyên sinh tách tế bào tran ra khỏi vách tế bào

Phân giải thành tế bào thực vật bằng enzyme cellulase và pectinase

¬ KLoại bỏ các enzyme phân giải thành tế bào và các mảnh vụn tế bào bằng cách lọc

và rửa bằng ly tâm

Nuôi cấy tế bào tran

Tế bào trần sau khi tách được nuôi cấy trên môi trường dĩnh dưỡng thích hợp có

khả năng tái tạo lớp thành tế bào mới, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh Những yêu cầu

về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi

tế bao Vì không có thành nên tế bào trần dé dàng tiếp nhận các chất dinh đưỡng từ môi

trường, do vậy môi trường nuôi cấy nói chung cần giảm bớt các chất vô cơ

tế bào tran gần giống với môi trường nuôi cay mô

Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó cóphương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môitrường lỏng ở mật độ khoảng 10 protoplast/ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường

và nuôi cây trong điều kiện tĩnh Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et

al (1974) [47] Theo phương pháp này các tác giả đã đặt một giọt (khoảng 50u]) dich

huyền phù tế bao trần (với mật độ 10! - 10° protoplast/ml) trong đĩa petri nhựa, quanparaphin và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu

Một phương pháp khác cũng được sử dụng là nuôi cấy trong thạch Một thể tíchdịch huyền phù có protoplast được trộn với một thể tích tương đương của thạch (1 - 2%)

và giữa ở trong 45°C trong bẻ âm trong một thời gian nhất định, sau đó lấy 5ml hỗn hợpnày đồ vào hộp lồng, quấn paraphin xung quanh và tiễn hành nuôi cấy

Bên cạnh các phương pháp đã nêu trên người ta còn sử dụng một số các phươngpháp nuôi cấy protoplast khác như nuôi cấy trong buồng vi nuôi cấy hay nuôi cấy hỗ

trợ.

Kao et al., (1975) đã cải tiến môi trường cơ bản để nuôi cấy protoplast đơn dongcủa loài Vicia hajastana cho nhiều loài khác dé tái sinh protoplast Thông thường môitrường nuôi protoplast chứa 3 - 5% sucrose nhưng với một vài loài (nhu thuốc lá) trongmôi trường lượng đường thấp hơn 1% Vitamin cũng được sử dụng cho môi trường nuôiprotoplast tương tự như trong môi trường cơ bản Cả hai nhóm chất điều tiế

(auxin và cytokinin) cũng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào trần ở những

tỷ lệ khác nhau, ảnh hưởng đến sự tái tạo thành tế bào và sự phân chia của tế bào NguồnAuxin ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus từ tế bào trần (2,4D, a-NAA hay IAA)

Cytokinin thường được sử dụng là BA, kinetin, 2-Pi hay zeatin Tỷ lệ auxin/cytokinin

tế bào cho đến khi tái tạo thành tế bào Áp suất thâm thấu trong môi trường nuôi cũngquan trọng như trong dung dịch enzyme bao gồm sorbitol, manitol, glucose hay sucrose.Với tế bao trần của các cây họ ngũ cốc, đậu thì cả sorbitol và manitol được chứng minh

là thích hợp tạo áp suất thầm thấu ổn định, còn với tế bao trần của các cây khoai tây,đậu hoa, dứa và sẵn thì sucrose là tốt hơn glucose hay manitol, còn với tế bào trần củathuốc lá thì cả galactose va fructose đều được sử dụng dé tạo áp suất thẩm thấu Áp suấtthâm thấu của môi trường nuôi dần được giảm bởi việc thêm định ky vài giọt môi trường.mới dé các tế bao trần tái tạo thành va phân chia tao callus

Tái sinh tế bào trần

Các tế bao trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện phinh to tế bào chat, tăng kíchthước và phát sinh hầu hết các bào quan (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân(có thé quan sát rõ ràng qua kính hién vi) Ty lệ và độ thành thục của protoplast phụthuộc vào nhiều yếu tố: giai đoạn tách và phân hóa của tế bào tach protoplast, điều kiệntách protoplast và tính đặc thù của loài thực vật Quá trình tái tạo thành tế bao có thédiễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2 - 7 ngày Sau khi thành tếbào được tái tạo hoàn chỉnh, các tế bào trần không còn giữa nguyên hình cầu như banđầu

Những phân tích mới đây về thành tế bào (quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang)cho thấy: khi thành tế bào vừa mới được hình thành, chúng sẽ xuất hiện những sợi vi

bào gắn kết một cách lỏng lẻo các tế bào đứng cạnh nhau Quá trình này cần thiết phảicung cấp một nguồn carbon ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy Nếu như áp suất thẩmthấu của môi trường nuôi cấy ổn định thì sẽ không kích thích được sự tái tạo thành tế

bào.

Sau khi tái tạo thành tế bào, các tế bao tran tăng kích thước và phân chia sau 2 - 7ngày Sau đó chúng vẫn tiếp tục phân chia và tạo thành các cụm đa bào (những cụm đabào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào Sự phân chia tiếp tục xảy

ra sau | - 3 tuần nuôi cây và bắt đầu hình thành macrocallus Sau đó chuyển sang môitrường không có áp suất thẩm thấu (môi trường rắn) dé tao callus Cac callus này có thétiếp tục phát sinh thành các cơ quan phân hóa (rễ, lá ) hay tái sinh thành cây hoànchỉnh Quá trình phân chia tế bào trần để hình thành callus phụ thuộc vào loại, nồng độ

và tỷ lệ Auxin/Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy; thành phần môi trường nuôicấy và điều kiện nuôi cấy

Các tế bào trần được nuôi cấy trong dia petri nhỏ ($ 3.5cm hoặc ở 5cm) với môitrường lỏng phù hợp trong điều kiện tối 25°C Sau 3 - 4 tuần có thé thấy các microcallusxuất hiện Các microcallus này sẽ được cấy chuyên sang dia petri lớn ( 9cm) chứa môi

trường cứng Cul-medium [48] Các dia petri này được đặt trong phòng nuôi với quang

chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 22°C

Sau 3 - 8 tuần có thé thu được các marcocallus với kích thước 0,5 - 1,5mm nằmtrên bề mặt thạch Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RIM[49], đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus Khoảng 8 - 12 tuần sau khi cây chuyền,marcocallus sẽ tái sinh thể chồi Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS(Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh

Dung hợp tê bào tran

Dung hợp tế bào trần hay tạo thé lai soma là một trong những ứng dụng quantrọng nhất của nuôi cấy tế bào Quá trình dung hợp tế bào trần được kích thích dé hòatrộn 2 bộ gen của 2 loài vào với nhau trong đó có thể là lai cùng loài, lai khác loài, khácgen hay thậm chí khác giới (điều mà không thé thực hiện được bằng phương pháp laithông thường) Thực é

chúng rat dé dang hòa trộn vào với nhau trong điều kiện in vitro

là các tế bào trần sau khi được tách ra, thành tế bào bị phân giải,Công nghệ dung hợp tế bao trần đã mở ra một cánh cửa mới cho công nghệ chuyểngen, các nghiên cứu sự biểu hiện của gen, tính bền vững của một số tính trạng và cảnhững biến đổi ở mức độ tế bào Quá trình dung hợp tế bao tran có thé xảy ra một cách

tự phát hay do kích thích bằng một số nhân tố như cơ học, hóa học hay vật lý (gọi chung

là dung hợp do kích thích).

- Dung hợp tự phát: