Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới được nghiên cứu với mục tiêu: Tạo được kháng nguyên S tái tổ hợp của PEDV từ cây thuốc lá N. benthamiana và đánh giá tính sinh... Đề tài Hoàn thiện công tác quản trị nhân sự tại Công ty TNHH Mộc Khải Tuyên được nghiên cứu nhằm giúp công ty TNHH Mộc Khải Tuyên làm rõ được thực trạng công tác quản trị nhân sự trong công ty như thế nào từ đó đề ra các giải pháp giúp công ty hoàn thiện công tác quản trị nhân sự tốt hơn trong thời gian tới.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Hồ Thị Thƣơng NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN S CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA CĨ TÍNH SINH MIỄN DỊCH ĐỊNH HƢỚNG TẠO VACXIN THẾ HỆ MỚI TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01 Hà Nội – 2023 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Chu Hoàng Hà Người hướng dẫn khoa học 2: TS Phạm Đình Minh Phản biện 1: GS TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 2: PGS.TS Trần Đăng Khánh Phản biện 3: PGS.TS Trương Văn Dung Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi 00’, ngày 02 tháng 11 năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Tiêu chảy cấp lợn hay tiêu chảy thành dịch (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) bệnh nguy hiểm có khả lây lan lợn tất độ tuổi Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), loại virus thuộc họ Coronaviridae, tác nhân gây bệnh PED [1] Các chủng PEDV G2 gây ảnh hưởng đến kinh tế nghiêm trọng, làm giảm suất đàn lợn nái lợn giống nhiều tỉnh thành [5] Sự khác biệt trình tự gen chủng PEDV bùng phát chủng PEDV vacxin, đặc biệt thụ thể trung hòa, dẫn đến vacxin có hiệu bảo hộ thấp chống lại chủng PEDV thực địa [3] Vacxin tiểu đơn vị tạo nhờ sử dụng hệ thống thực vật có nhiều lợi bao gồm mức đầu tư sản xuất thấp, dễ dàng nhân rộng, độ ổn định cao thời hạn sử dụng lâu dài [6] Phương pháp biểu tạm thời dựa agro-infiltration có lợi việc sản xuất protein tái tổ hợp nhanh chóng với số lượng lớn, điều cho phép phản ứng kịp thời xảy dịch bệnh [7] Protein S PEDV nhân tố thiếu tương tác virus với thụ thể tế bào [8] xem mục tiêu để phát triển vacxin [9] Vùng CO-26K equivalent (COE) (aa 499-638), vùng S1D (aa 636-789), tiểu phần S2 xem vùng có tính kháng ngun protein S [14] Tính đến nay, chưa có cơng bố nước nghiên cứu việc biểu vùng COE (aa 499-638), COE-S1D (aa 499-789) S2 (aa 730-1324) thuộc protein S dung hợp motif GCN4pII (viết tắt pII) dung hợp motif GCN4pII-tp (viết tắt pII-tp) hệ thống thuốc N benthamiana chứng minh khả gây đáp ứng miễn dịch protein động vật thí nghiệm Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn trên, tiến hành đề tài: ‘Nghiên cứu tạo kháng nguyên S virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn (PEDV) thuốc Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hƣớng tạo vacxin hệ mới’ Mục tiêu nghiên cứu luận án Tạo kháng nguyên S tái tổ hợp PEDV từ thuốc N benthamiana đánh giá tính sinh miễn dịch động vật thí nghiệm phục vụ phát triển vacxin Các nội dung nghiên cứu luận án Nội dung 1: Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a Nội dung 2: Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam Nội dung 3: Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Các chủng PEDV thuộc nhóm G2 tác nhân gây bệnh đợt dịch PED Việt Nam Việc phát triển loại vacxin có hiệu phịng chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh Việt Nam điều vô cần thiết Kết nghiên cứu luận án cho thấy protein tái tổ hợp COE/G2a-pII, COE-S1D/G2a-pII COE/G2a-pII-tp tạo thuốc N benthamiana sử dụng công nghệ biểu tạm thời tính kháng nguyên cao, tính sinh miễn dịch tốt ứng viên vacxin đầy triển vọng định hướng ứng dụng công tác phịng chống PED Việt Nam Những đóng góp luận án Luận án nghiên cứu cách hệ thống tạo kháng nguyên COE tái tổ hợp từ chủng PEDV DR13 nhược độc thuộc nhóm G1a kháng nguyên COE, COE-S1D S2 tái tổ hợp từ chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a gây bệnh thực địa Việt Nam dung hợp motif pII motif pII-tp thuốc N benthamiana công nghệ biểu tạm thời; đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp tạo động vật thử nghiệm Kháng ngun COE/G2a-pII tiêm cho lợn nái (100µg/liều) có khả bảo vệ lợn sinh từ lợn nái chống lại PEDV sau công cường độc Kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII (50àg/liu) kốm cht b tr Emulsigenđ-D (MVP) ó kớch thích sinh đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh hơn, đồng thời sinh đáp ứng kháng thể IgA đặc hiệu PEDV có khả trung hịa PEDV tương đương vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology) Đây ứng viên tiềm để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV gây bệnh Việt Nam Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.1 Tình hình dịch bệnh PED giới Từ sau báo cáo xuất lần đầu Anh Bỉ năm 1970, dịch bệnh PED tiếp tục phát nhiều nước khác Châu Âu, Châu Á Châu Mỹ 1.1.2 Tình hình dịch bệnh PED Việt Nam Cho tới nay, bệnh PED xuất tất vùng chăn ni lợn Việt Nam 1.2 Tác nhân gây bệnh PED 1.2.1 Phân loại PEDV PEDV phân loại vào họ Coronaviridae (phân họ Coronavirinae, họ Coronaviridae, Nidovirales) [37] 1.2.2 Đặc điểm hình thái PEDV Hạt PEDV tồn dạng hình cầu có đường kính từ 90 đến 160 nm kính hiển vi điện tử 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc hệ gen chức protein PEDV PEDV có hệ gen RNA đơn dương với kích thước khoảng 28 kb [37] có chứa khung đọc mở (ORF) mã hóa protein cấu trúc PEDV như: N (Nucleocapsid), S (Spike), E (Envolope), M (Membrane) ba protein không cấu trúc PEDV ORF 1a 1b ORF3 1.2.4 Protein S PEDV Các vùng chứa yếu tố định kháng nguyên nhận biết thụ thể tế bào B phản ứng với kháng thể trung hòa protein S bao gồm đầu N [NTD]/S0 (aa 19-202), CO-26K equivalent (COE) (từ aa 499 đến 638), S1D (từ aa 636-789 nhận biết thụ thể tế bào lympho B SS2 (aa 748-755) SS6 (aa 764-771)) 2C10 (aa 1368-1374, aa 13711377) [8, 14, 15, 22] Các vùng chứa yếu tố định kháng nguyên protein S xem ứng viên cho nghiên cứu phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV [47] 1.2.5 Dịch tễ học phân tử chủng PEDV giới Các nghiên cứu đặc điểm di truyền dựa gen S cho thấy PEDV phân loại thành nhóm: nhóm G1 cổ điển nhóm G2 gây dịch thực địa Nhóm G1 nhóm G2 phân tiếp thành nhóm nhỏ G1a, G1b, G2a G2b PEDV phân thành nhóm: non-S INDEL S INDEL vào thêm - xóa gen mã hóa S [52] 1.2.6 Dịch tễ học phân tử chủng PEDV Việt Nam Hai mươi tám chủng PEDV thu thập miền Bắc miền Trung Việt Nam thuộc nhóm G2 (cả hai phân nhóm G2a G2b), chủng PEDV khác (HUAPED176 HUA-PED254) thu thập khu vực phía Nam thuộc nhóm G1 (phân nhóm G1b) [4] 1.3 Vacxin phòng PEDV 1.3.1 Vacxin bất hoạt vacxin nhược độc Một số vacxin bất hoạt vacxin nhược độc cấp phép thương mại hóa Trung Quốc, Nhật Hàn Quốc Các loại vacxin bất hoạt vacxin nhược độc chứng minh có khả bảo hộ động vật điều kiện thí nghiệm, hiệu chúng thực nghiệm tranh cãi 1.3.2 Vacxin tiểu đơn vị Trong nhiều năm gần đây, phần protein PEDV S bao gồm COE, S1 toàn protein S biểu hệ thống E coli, Bacillus subtilis, Baculovirus, Adenovirus, Lactobacillus thực vật Chuột lợn gây đáp ứng miễn dịch với loại vacxin qua đường uống, tiêm bắp, tiêm da tiêm màng bụng kích thích sản sinh nồng độ kháng thể IgG IgA cao 1.3.3 Vacxin axit nucleic Vacxin mRNA PEDV dựa vector alphavirus mang gen S PEDV công ty Harrisvacxins Mỹ Bộ Nơng nghiệp Hoa Kỳ cấp giấy phép có điều kiện năm 2014 1.3.4 Các vấn đề tồn phát triển vacxin phòng chống PEDV Hiện nay, vacxin phịng chống PEDV khơng ngăn ngừa PEDV gây bệnh thực địa virus thường xuyên biến đổi vacxin tạo đủ miễn dịch niêm mạc 1.4 Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật 1.4.1 Hệ thống biểu tạm thời thực vật So với biểu ổn định, biểu tạm thời thực vật quan tâm nhiều tính linh hoạt tốc độ nhanh việc sản xuất số lượng lớn protein dược phẩm sinh học tái tổ hợp [103] N benthamiana loài thực vật sử dụng phổ biến cho biểu tạm thời protein tái tổ hợp 1.4.2 Vacxin từ thực vật phòng chống PEDV giới Đa số nghiên cứu biểu vùng COE protein S Toàn protein S báo cáo có mức độ biểu thấp [18] khơng biểu [19] Cây thuốc đối tượng sử dụng hầu hết nghiên cứu sản xuất protein COE với mức độ biểu cao Protein COE có mức độ tích lũy cao thực vật biểu tạm thời 1.4.3 Motif GCN4pII motif tailpiece IgM 1.4.3.1 Motif GCN4pII GCN4-pII motif thiết kế nhân tạo tạo lõi hình thành hồn tồn từ gốc phân nhánh beta GCN4-pII sử dụng để kích hoạt q trình trimer hóa protein quan tâm đồng thời tăng tính ổn định, độ hịa tan protein tăng gấp ba lần kích thước protein 1.4.3.2 Motif IgM Tp trình tự peptit ngắn đầu C IgM gồm 18 aa có trình tự PTLYNVSLVMSDTAGTCY [139] Các peptide quan trọng cho q trình polymer hóa IgM [140] bao gồm cầu disulfit bên phân tử liên quan đến Cys575, axit amin gần cuối [141] Sự hình thành dạng pentamer/hexamer kiểm sốt chế thơng qua Cys575 Tp kích hoạt q trình polymer hóa dung hợp đầu C kháng thể khác IgG 1.4.4 Vacxin từ thực vật phòng chống bệnh thú y Việt Nam Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu phát triển vacxin phịng chống PEDV dựa hệ thống thực vật báo cáo Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.2.1 Chủng vi sinh vật, tế bào, plasmid trình tự gen Danh sách chủng vi sinh vật, tế bào plasmid sử dụng luận án trình bày Bảng 2.1 2.1.2 Mồi Danh sách mồi thiết kế sử dụng luận án trình bày Bảng 2.2 2.1.3 Nguồn vật liệu thực vật Cây thuốc Nicotiana benthamiana thủy canh 6-8 tuần tuổi 2.1.4 Nguồn vật liệu động vật Chuột nhắt trắng 4-5 tuần tuổi, lợn nái mang thai lợn 4-5 tuần tuổi 2.1.5 Hóa chất 2.1.6 Thiết bị vật tư 2.2 Phƣơng pháp Hình 2.1 Sơ đồ mơ tả tóm tắt phương pháp nghiên cứu sử dụng luận án Chƣơng KẾT QUẢ 3.1 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1apII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a 3.1.1 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng Các kết chọn lọc dòng khuẩn colony-PCR xử lý plasmid với enzyme NcoI cho thấy thiết kế thành công vector biểu pCB301-COE/G1a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 3.2 11 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam 3.2.1 Thu thập thông tin, lựa chọn tách dịng gen mã hóa protein S chủng PEDV gây bệnh Việt Nam Trong khuôn khổ luận án, trình tự gen mã hóa protein S chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao lựa chọn cho nghiên cứu Chủng phân lập nhân nuôi thành công Việt Nam Từ kết xây dựng phả hệ dựa vào trình tự gen mã hóa protein S cho thấy chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao thuộc kiểu gen G2a 3.2.2 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng Các kết chọn lọc dòng khuẩn colony-PCR xử lý plasmid với enzyme NcoI cho thấy thiết kế thành công vector biểu pCB301-COE/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 3.2.3 Biểu kháng nguyên COE/G2a-pII tạm thời thuốc N benthamiana Kháng nguyên COE/G2a-pII tích lũy thuốc mức xấp xỉ 118 mg/kg tươi, chiếm 2,01% proteint tan tổng số Sự biểu kháng nguyên COE/G2a tái tổ hợp thuốc N benthamiana thủy canh phát huyết lợn tiêm vacxin Corning chứa chủng PEDV AJ1102 (Wuhan Keqian Biology) dạng vô hoạt Kết chứng tỏ protein COE/G2a-pII tạo thuốc N benthamiana có 12 tính kháng nguyên tương tự với kháng nguyên COE PEDV tự nhiên 3.2.4 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE/G2a-pII 3.2.4.1 Tinh kháng nguyên COE/G2a-pII IMAC Đệm rửa có bổ sung imidazole nồng độ 10 mM thích hợp cho q trình tinh kháng nguyên COE/G2a-pII Dựa vào kết đo protein tổng số Bradford kết bán định lượng Western blot cho thấy kháng nguyên COE/G2a-pII xác định có độ tinh đạt xấp xỉ 82%, với hiệu suất thu hồi kháng nguyên COE/G2a-pII từ dịch chiết thực vật sau tinh IMAC đạt xấp xỉ 25% 3.2.4.2 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE/G2a-pII SEC phản ứng liên kết chéo Kết phân tích trạng thái oligomer kháng nguyên COE/G2apII SEC phản ứng liên kết chéo dựa vào BS3 cho thấy kháng nguyên COE/G2a-pII tự nhiên tồn dạng oligomer với khối lượng khoảng 158-440 kDa Sự khác khối lượng phân tử tự nhiên protein COE/G1a-pII protein COE/G2a-pII ước tính giải thích khác biệt trình tự aa hai protein dẫn đến thay đổi số lượng vị trí glycosyl hóa hai protein trên, điều ảnh hưởng tới phân tách protein gel cột SEC 3.2.5 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a-pII lợn 3.2.5.1 Đáp ứng miễn dịch kháng nguyên COE/G2a-pII lợn nái mang thai sau tiêm Về đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV, kết ELISA cho thấy kháng nguyên COE/G2a-pII kích thích sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV lợn nái mang thai vào ngày thứ 35 50 sau tiêm 13 Đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV lợn nái tiêm PBS ngày thứ 35 ngày thứ 50 sau tiêm không phát Về đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV, kết ELISA cho thấy lợn nái mang thai tiêm phịng kháng ngun COE/G2a-pII có diện kháng thể IgA đặc hiệu PEDV huyết ngày thứ 35 50 Kháng thể IgA đặc hiệu PEDV không phát huyết lợn nái tiêm với PBS ngày thứ 35 50 sau tiêm Hình 3.19 Đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể có khả trung hòa PEDV huyết lợn nái mang thai sau tiêm Về khả trung hòa PEDV, kháng ngun COE/G2a-pII kích thích sinh kháng thể có khả trung hòa PEDV lợn nái mang thai sau tiêm với hiệu giá kháng thể trung hòa trung bình 32 ngày thứ 35 Các kháng thể có khả trung hịa PEDV khơng phát huyết lợn nái tiêm với PBS ngày thứ 35 50 sau tiêm (Hình 3.19) Về đáp ứng sinh cytokine IFN-γ, kết ELISA cho thấy huyết lợn nái mang thai tiêm kháng nguyên COE/G2a-pII có đáp ứng sinh IFN-γ mức cao, đạt nồng độ 932,3 ± 145,2 pg/ml vào ngày thứ 35 sau tiêm Đáng ý mức IFN-γ tăng gấp hai lần (1796,1 ± 8,6 14 pg/ml) lợn nái vào ngày thứ 50 sau tiêm IFN-γ khơng tìm thấy lợn nái đối chứng âm tiêm PBS ngày thứ 35 50 sau tiêm Những liệu cho thấy kháng nguyên COE/G2a-pII kích thích sản sinh đáp ứng kháng thể đặc hiệu PEDV có khả trung hịa PEDV đáp ứng cytokine mạnh lợn nái mang thai 3.2.5.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể đáp ứng cytokine lợn sinh từ lợn nái sau tiêm Kết ELISA cho thấy đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV phát huyết lợn ngày tuổi trước sau công cường độc Đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV lợn sinh từ lợn nái tiêm PBS ngày thứ 10 sau công cường độc không phát Kết ELISA cho thấy có diện kháng thể IgA đặc hiệu COE huyết lợn trước sau công cường độc Kháng thể IgA đặc hiệu với COE không phát huyết lợn nái tiêm với PBS trước công cường độc ngày thứ 10 sau cơng cường độc Hình 3.22 Đáp ứng sinh kháng thể có khả trung hòa PEDV huyết lợn sinh từ lợn nái tiêm chủng trước sau công cường độc 15 Về khả trung hòa PEDV, hiệu giá kháng thể trung hòa PEDV phát lợn vào ngày thứ 10 sau công cường độc cao gấp hai lần so với trước công cường độc, với hiệu giá đạt 16 Các kháng thể có khả trung hịa PEDV không phát huyết lợn đẻ từ lợn nái gây đáp ứng với PBS trước sau công cường độc 10 ngày (Hình 3.22) Kết ELISA cho thấy có gia tăng mạnh nồng độ IFN-γ lợn sinh từ lợn nái tiêm kháng nguyên COE/G2a-pII vào ngày thứ 10 sau công cường độc Ngược lại, đáp ứng sinh cytokine IFN-γ không phát lợn sinh từ lợn nái tiêm PBS trước sau công cường độc 10 ngày Những liệu chứng tỏ có truyền miễn dịch thụ động kháng thể IgG, IgA đặc hiệu PEDV có khả trung hịa PEDV đáp ứng IFN-γ từ lợn nái sang lợn qua sữa/sữa non lợn nái 3.2.5.3 Đáp ứng miễn dịch bảo hộ lợn chống lại chủng PEDV G2a có độc lực cao Tất lợn sinh từ lợn nái tiêm phòng với kháng nguyên COE G2a-pII trở điểm phân vào ngày thứ Ngược lại, lợn sinh từ lợn nái tiêm PBS có điểm phân ngày thứ ngày sau Trước cơng cường độc, khơng có khác biệt đáng kể trọng lượng thể hai nhóm lợn Mười ngày sau cơng cường độc, trọng lượng thể lợn sinh từ lợn nái tiêm COE/G2a-pII tăng gấp hai lần Ngược lại, hai lợn sinh từ lợn nái đối chứng âm có trọng lượng thể giảm mạnh sau công so với trước công Tất lợn sinh từ lợn nái tiêm phòng với kháng ngun COE/G2a-pII có điểm lâm sàng bình thường sau cơng xung 16 quanh sống sót 100% sau cơng cường độc (Hình 3.25A, B) Ngược lại, đặc điểm lâm sàng lợn đẻ từ lợn nái tiêm PBS khoảng (biếng ăn, suy nhược, nôn mửa hốc hác) ngày thứ điểm số lâm sàng nhóm tăng lên 1,5 vào ngày thứ (Hình 3.25A) Tất lợn nhóm đối chứng âm tính chết sau cơng cường độc virus (Hình 3.25B) Hình 3.25 Điểm lâm sàng (A) tỷ lệ sống sót (B) lợn đẻ từ lợn nái tiêm chủng trước sau công cường độc 3.3 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam 3.3.1 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng Các kết chọn lọc dòng khuẩn colony-PCR xử lý 17 plasmid với enzyme NcoI cho thấy thiết kế thành công vector biểu pCB301-COE-S1D/G2a-pII, pCB301-COE/G2a-pII-tp, pCB301- S2/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 3.3.2 Biểu kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE- pII-tp S2/G2a-pII tạm thời thuốc N benthamiana Kết bán định lượng Western blot cho thấy kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII tích lũy thuốc mức 115 mg/kg tươi, chiếm 1,95% protein tan tổng số; 590 mg/kg tươi, chiếm 5,62% protein tan tổng số; 86,7 mg/kg tươi, chiếm khoảng 1,47 % protein tan tổng số Sự biểu kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII thuốc N benthamiana phát huyết lợn tiêm vacxin Corning chứa chủng PEDV AJ1102 (Wuhan Keqian Biology) dạng vô hoạt Kết chứng tỏ protein COE-S1D/G2a-pII, COE/G2apII-tp S2/G2a-pII tạo thuốc N benthamiana có tính kháng ngun tương tự với kháng nguyên tự nhiên PEDV 3.3.3 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tái tổ hợp Kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII sau tinh IMAC có độ tinh khiết đạt xấp xỉ 80%, với hiệu suất thu hồi kháng nguyên COE-S1D/G2apII từ dịch chiết thực vật đạt xấp xỉ 27% Kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII tự nhiên tồn trạng thái oligomer với khối lượng phân tử khoảng 440 kDa-669 kDa.Kháng nguyên COE/G2a-pII-tp sau tinh IMAC có độ tinh khiết đạt xấp xỉ 82%, với hiệu suất thu hồi kháng nguyên COE/G2apII-tp từ dịch chiết thực vật đạt xấp xỉ 20% Kháng nguyên COE/G2a-pIItp tự nhiên tồn trạng thái oligomer với khối lượng phân tử khoảng 18 158-669 kDa Kháng nguyên S2/G2a-pII sau tinh IMAC có độ tinh khiết xấp xỉ 81%, với hiệu suất thu hồi kháng nguyên S2/G2a-pII từ dịch chiết thực vật đạt xấp xỉ 22% Kháng nguyên S2/G2a-pII tồn trạng thái oligomer với khối lượng khoảng 440 đến 669 kDa 3.3.4 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII chuột Tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII so sánh với kháng nguyên COE/G2a-pII chuột Về đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV, kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII kích thích sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh so với kháng nguyên COE/G2a-pII Các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII có khả kích thích sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV tương đương Về đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV, kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII COE/G2a-pII-tp kích thích sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV mạnh so với kháng nguyên COE/G2a-pII Kháng nguyên COE/G2a-pII-tp có khả kích thích sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV tốt so với kháng nguyên cịn lại Kháng ngun S2/G2a-pII kích thích kháng thể IgA đặc hiệu PEDV tương đương với kháng nguyên COE/G2a-pII Về đáp ứng sinh kháng thể IgM đặc hiệu PEDV, kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII COE/G2a-pII-tp kích thích sản sinh kháng thể IgM đặc hiệu PEDV mạnh so với kháng nguyên COE/G2a-pII; đó, kháng nguyên S2/G2a-pII kích thích sản sinh kháng thể IgM đặc hiệu PEDV thấp so với kháng nguyên COE/G2a-pII Về khả trung hòa PEDV, kháng nguyên COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII kích thích sinh kháng 19 thể có khả trung hòa PEDV tương đương với kháng nguyên COE/G2a-pII Về đáp ứng sinh cytokine IFN-γ, kháng nguyên COE/G2apII kích thích sinh đáp ứng IFN-γ cao so với kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII 3.3.5 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a- pII lợn Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kháng nguyên COE/G2a-pII so sánh với lợn 4-5 tuần tuổi Thí nghiệm 1: So sánh tính miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kháng nguyên COE/G2a-pII (liều 12,5 µg) lợn con; so sánh ảnh hưởng chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 (SEPPIC) chất bổ trợ Emulsigen®-D (MVP) đến tính sinh miễn dịch kháng nguyên COES1D/G2a-pII Về đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV, kháng COES1D/G2a-pII kích thích sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV tương đương với kháng nguyên COE/G2a-pII trộn với chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 lợn Khi trộn với kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, chất bổ trợ Emulsigen®-D có tác dụng kích thích kháng thể IgG đặc hiệu PEDV tốt so với chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 Về đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV, kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kích thích sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV mạnh so với kháng nguyên COE/G2apII trộn chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 lợn Khi trộn kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, chất bổ trợ Emulsigen®-D có tác dụng tốt chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 việc kích thích sản sinh đáp ứng IgA đặc hiệu PEDV Về khả trung hịa PEDV, kháng ngun COE-S1D/G2a-pII kích thích sản sinh kháng thể có khả trung hịa PEDV tương 20 đương với kháng nguyên COE/G2a-pII lợn Khi trộn với kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 chất bổ trợ Emulsigen®-D kích thích sinh đáp ứng kháng thể có khả trung hịa PEDV tương đương lợn (Hình 3.49) Hình 3.49 Phân tích đáp ứng trung hịa PEDV huyết nhóm lợn thí nghiệm thí nghiệm trung hịa virus Về đáp ứng sinh IFN-γ, kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kích thích đáp ứng IFN-γ tương đương với kháng nguyên COE/G2a-pII trộn với chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 lợn Khi trộn với kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, chất bổ trợ Emulsigen®-D kích thích sinh IFN-γ tốt chất bổ trợ Montanide ISA™ 201 - Thí nghiệm 2: So sánh tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1DG2a-pII (liều 50 µg) với vacxin thương mại lợn Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII (liều 50 21 µg) so sánh với tính sinh miễn dịch vacxin thương mại Corning, vô hoạt chứa chủng PEDV AJ1102 (Wuhan Keqian Biology) thuộc nhóm G2b lợn Về đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng nguyên PEDV, kết ELISA cho thấy, sau lần tiêm thứ 2, đáp ứng sinh IgG đặc hiệu PEDV nhóm tiêm kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kèm chất bổ trợ Emulsigen®-D cao so với nhóm tiêm vacxin thương mại Corning (p0,05 Đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV không phát nhóm lợn tiêm PBS trộn chất bổ trợ Emulsigen®-D Về khả trung hịa PEDV, sau lần tiêm, hiệu giá kháng thể trung hòa trung bình nhóm lợn tiêm COE-S1D/G2a-pII kèm chất bổ trợ Emulsigen®-D 32, hiệu giá kháng thể trung hịa trung bình nhóm lợn tiêm vacxin thương mại Corning 25,45 Tuy nhiên, khơng có khác biệt mặt thống kê đáp ứng sinh kháng thể có khả trung hịa PEDV nhóm lợn tiêm COE-S1D/G2a-pII vacxin thương mại Corning với giá trị p>0,05 Các kháng thể có khả trung hịa PEDV khơng tìm thấy nhóm lợn tiêm với PBS kèm chất bổ trợ Emulsigen®-D (Hình 3.55) 22 Hình 3.55 Kết đánh giá đáp ứng sinh kháng thể có khả trung hịa PEDV nhóm lợn thí nghiệm phản ứng trung hịa virus E: Emulsigen®-D (MVP) Chƣơng THẢO LUẬN 4.1 Mức độ biểu khả thu hồi kháng nguyên tái tổ hợp từ thuốc N benthamiana 4.2 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1a-pII chuột 4.3 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a pII lợn nái khả bảo hộ lợn chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao 4.4 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII động vật thí nghiệm 4.4.1 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COE– S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII chuột 4.4.2 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII lợn 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Kháng nguyên COE/G1a-pII từ chủng PEDV DR13 nhược độc thuộc nhóm G1a tạo thuốc N benthamiana Dịch chiết thuốc chứa kháng nguyên COE/G1a-pII kích thích sinh kháng thể trung hòa PEDV tương đương với vacxin thương mại CTC Vacc PED (Hàn Quốc) chuột Kháng nguyên COE/G2a-pII từ chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a tạo thuốc N benthamiana Kháng ngun COE/G2a-pII (100 µg/liều) kích thích sinh kháng thể trung hòa PEDV, IFN-γ lợn nái bảo vệ lợn sau công cường độc với chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao Các kháng nguyên COE/G2a-pII-tp, COE–S1D/G2a-pII S2/G2a-pII từ chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a tạo thuốc N benthamiana Kháng nguyên COE/G2apII-tp kích thích sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV tốt kháng nguyên COE/G2a-pII, COE–S1D/G2a-pII S2/G2a-pII chuột Kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII kích thích sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV tốt kháng nguyên COE/G2a-pII lợn Kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII (50 µg/liều) kèm chất bổ trợ Emulsigen®-D (MVP) kích thích sinh kháng thể trung hòa tương đương với vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology) lợn KIẾN NGHỊ Hồn thiện quy trình sản xuất kháng ngun COE/G2a-pII tái tổ thuốc N benthamiana đánh giá khả kích thích miễn dịch 24 bảo hộ số lượng lớn lợn đẻ từ lợn nái tiêm kháng nguyên COE/G2a-pII chống lại chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh thực địa Việt Nam Gây đáp ứng miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII COE/G2a-pII-tp lợn nái đánh giá khả bảo hộ lợn sinh từ lợn nái sau cơng cường độc với chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh thực địa Việt Nam DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Ho Thi Thuong, Nguyen Thu Giang, Pham Bich Ngoc, Le Van Phan, Trinh Thi Bich Ngoc, Vu Huyen Trang, Phan Trong Hoang, Udo Conrad and Chu Hoang Ha, 2020, Plant-derived trimeric CO-26KEquivalent epitope induced neutralizing antibodies against porcine epidemic diarrhea virus, Front Immunol, 11, pp 2152 doi: 10.3389/fimmu.2020.02152 Hồ Thị Thƣơng, Trịnh Thái Vy, Nguyễn Thị Trà, Hồng Thị Thu Hằng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, 2021, Thiết kế tối ưu biểu tạm thời protein COE trimer chủng Porcine epidemic diarrhea virus gây bệnh Việt Nam thuốc Nicotiana benthamiana, Kỷ yếu Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 2-8 ISBN 978-6049987-88-5 Ho Thi Thuong, Trinh Thai Vy, Tran Xuan Hanh, Le Thi Thu Phuong, Nguyen Thi Tra, Hoang Thi Thu Hang, Pham Dinh Minh, Udo Conrad, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha, 2022, The immunogenicity of plantbased COE-GCN4pII protein in pigs against the highly virulent porcine epidemic diarrhea virus strain from genotype 2, Front Vet Sci, 9, pp 940395 doi: 10.3389/fvets.2022.940395 Ho Thi Thuong, Trinh Thai Vy, Hoang Thi Thu Hang, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha, 2022, Transient expression and purification of S2 protein from Porcine epidemic diarrhea virus in plants, Vietnam Journal of Biotechnology, 20 (4), tr 1-11 doi: 10.15625/1811-4989/1750 Hồ Thị Thƣơng, Trịnh Thái Vy, Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thị Trà My, Phạm Đình Minh, Phạm Bích Ngọc, Hồng Thị Thu Hằng, Chu Hồng Hà, 2023, Tính sinh miễn dịch kháng nguyên S2 từ virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn (PEDV) dung hợp motif GCN4pII chuột, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 228(13), tr 298 – 305 doi: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.8349