Đề tài: “Nghiên cứu tạo laccase tái tổ hợp và thử nghiệm khả năng khử màu một số thuốc nhuộm công nghiệp” nhằm mục đích tạo được laccase tái tổ hợp để phân giải các hợp chất hữu cơ khó phân hủy gây ô nhiễm môi trường.
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẶNG THỊ THANH HÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP Huế, năm 2022 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẶNG THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỐC NHUỘM CƠNG NGHIỆP Ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học PGS TS Phạm Thị Ngọc Lan TS Nguyễn Đức Huy Huế, năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iv LỜI CẢM ƠN .v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU .1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LACCASE 1.1.1 Giới thiệu chung laccase 1.1.2 Cấu tạo laccase 1.1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.1.4 Đặc tính laccase 1.1.5 Các nguồn thu nhận laccase 11 1.1.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp laccase 14 1.1.7 Ứng dụng laccase 15 1.2 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Pichia pastoris 18 1.2.1 Giới thiệu chung hệ thống P pastoris 18 1.2.2 Ưu, nhược điểm P pastoris so với hệ thống biểu khác .19 1.2.3 Hệ thống biểu tái tổ hợp tương đồng sử dụng P pastoris 20 1.3 THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ .25 1.3.1 Thuốc nhuộm công nghiệp 25 1.3.2 Các phương pháp xử lý thuốc nhuộm công nghiệp 27 1.3.3 Xử lý màu thuốc nhuộm laccase 28 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 i 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Đối tượng 33 2.1.2 Thu thập mẫu 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Phân lập chủng nấm mốc có hoạt tính laccase 33 2.2.2 Khảo sát sinh tổng hợp laccase từ chủng phân lập 34 2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme laccase 35 2.2.4 Phương pháp xác định protein ngoại bào 35 2.2.5 Xác định số đặc tính laccase thơ từ chủng phân lập 36 2.2.6 Định danh phân tử chủng nấm phân lập 36 2.2.7 Phân lập gen mã hóa laccase 38 2.2.8 Biểu cFolac1 Pichia pastoris 40 2.2.9 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biểu laccase tái tổ hợp .43 2.2.10 Tinh enzyme tái tổ hợp 44 2.2.11 Điện di SDS – PAGE 45 2.2.12 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ laccase tái tổ hợp .45 2.2.13 Thử nghiệm khả khử màu thuốc nhuộm tổng hợp .46 2.2.14 Xử lý thống kê .47 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .48 3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CĨ HOẠT TÍNH LACCASE 48 3.1.1 Phân lập, làm giữ giống chủng nấm mốc 48 3.1.2 Sàng lọc chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase 49 3.1.3 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc cuống sinh bào tử chủng nấm phân lập .50 3.1.4 Đánh giá khả sinh laccase chủng nấm phân lập 51 3.1.5 Khảo sát số đặc tính laccase tự nhiên 58 3.1.6 Định danh vi sinh vật 60 3.2 TẠO DỊNG CÁC GEN MÃ HĨA LACCASE TỪ F oxysporum 63 3.2.1 Khuếch đại gen laccase từ cDNA F oxysporum .63 ii 3.2.2 Tạo dịng gen mã hóa enzyme laccase vector pGEM®T-Easy 64 3.2.3 Giải trình tự gen laccase 71 3.3 BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA LACCASE TRONG Pichia pastoris 77 3.3.1 Tạo dòng cFolac1 vào pGEM®T-Easy biến nạp vào E coli Top10 77 3.3.2 Tạo dòng vào vector biểu pPICZαA .77 3.3.3 Tối ưu hóa biểu laccase tái tổ hợp 80 3.3.4 Tinh enzyme 86 3.3.5 Khảo sát đặc điểm enzyme tái tổ hợp .87 3.4 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP 91 Chương BÀN LUẬN 95 4.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CĨ HOẠT TÍNH LACCASE 95 4.1.1 Môi trường nuôi cấy 95 4.1.2 Khảo sát số đặc tính laccase tự nhiên 96 4.2 PHÂN LẬP CÁC GEN MÃ HÓA LACCASE 99 4.3 BIỂU HIỆN GEN FOLAC1 MÃ HÓA EMZYME TRONG NẤM MEN Pichia pastoris 100 4.3.1 Biểu gen Folac1 100 4.3.2 Khảo sát đặc tính enzyme tái tổ hợp .102 4.3.3 Tối ưu hóa biểu laccase tái tổ hợp 103 4.4 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .109 KẾT LUẬN 109 KIẾN NGHỊ 109 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO .111 PHỤ LỤC 126 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa cơng bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tác giả luận án Đặng Thị Thanh Hà iv LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Ngọc Lan GS TS Nguyễn Hoàng Lộc, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Huy, Trưởng Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Enzyme Protein, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, Đại học Huế giáo viên trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí q trình thực hồn thành luận án Xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa học, Đại học Huế Xin gửi lời cảm ơn đến cán bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Bộ mơn Công nghệ sinh học, Bộ môn Sinh học ứng dụng, hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi suốt trình học tập nghiên cứu môn Tôi xin chân thành cảm ơn đến cán bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Enzyme Protein, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu Viện Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn đến GS Seung- Moon Park ThS Nguyễn Thị Mỹ Lệ, Đại học Quốc gia Chonbuk, Hàn Quốc hỗ trợ số phân tích q trình hồn thành luận án Cuối cùng, xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Tây Nguyên, gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Thừa Thiên Huế, ngày ……tháng…… năm 2022 Nghiên cứu sinh Đặng Thị Thanh Hà v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 2,4- D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) Amp Ampicillin BPA Bisphenol A Bp Base pair BSM Bacteria Standard Medium CHCl3 Chloroform COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa học) CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DMP 2,6-dimethoxyphenol DNA Deoxyribonucleic acid DW Distilled water (Nước cất vô trùng) EC Enzyme commission EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EMS (Ethyl Methane Sulfonate) EP Eppendorf EtOH Ethanol Folac Gen laccase HBT Hydroxybenzotriazole vi HPI N- hydroxyphtaimide ITS Internal transcribed spacer (Vùng đệm mã) IUB International Union of Biochemistry (Tổ chức sinh hóa quốc LB LiP MnP NCBI tế) Luria Bertani Lignin peroxidase (ligninase) Manganase peroxidase National Center for Biotechnology Information (Trung tâm DO PAH PCB PCI PCR PDA PVA RACE PCR RBBR SDS – PAGE TAE Taq TNT Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ) Dissolved Oxygen (Oxy hòa tan) Polycyclic aromatic hydrocarbon Polychlorinated biphenyl Phenol: chloroform: isoamylalcohol Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi Polymeras) Potato Dextrose Agar Poly vinyl alcohol Rapid Amplification of ADNc-PCR Remazol Brilliant Blue R Điện di gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide Tris-acetate-EDTA Thermus aquaticus vii UV 2,4,6-trinitrotoluen YP Ultraviolet (Tia tử ngoại) YPD Yeast peptone YPDS Yeast peptone dextrose YPM Yeast peptone dextrose sorbitol Yeast peptone methanol viii ATGTGGATTACAGACGCCTGCAAGGCTGTCGTCTTGTCCTTCGTGGCGGTATTCCACTACCCGT CCGTCT CAGACGAGGGGCCTCATCAAGATGTCATGACCTTCACCCACGGGCACTCCACACCAAAGATTG ACTACCC ATATTTCGACTCACCAAGTGGTCCTGACCAGGACGGCAAGGTCTTCACATGCAACTACACCGA CCTCAAA GGCTGGAAGCCATGCACAACTGCAGATGATCGCTCGTGTTGGTTGAAAGGTCCGTATGGGCAA AACTTCA CTATTAACACAGACTATGAGAACTTCTGGCCAATTGGAATAACAAGAGAGGTACGTCGCGGCT CATCAGC ATTAGCTTGCTTTGCTTTCTGACTGACAACCAGTACCACCTCAACGTTACTGACCAATCCATCA ATGGCG ATGGTGTTGATAATCCATTCGGCAAGGTTTTCAACGGCAAGTATCCCGGCCCTTGGATCCAAG CCTGCTG GGGCGACCTCATCAAAGTCACGGTGCACAACCATCTCAAGTACAATGGTACAACTATCCACTG GCACGGT CTCCGACAACTGGAGACCTTTGAGATGGATGGTGTCAACGGCGTGACTCAATGCCCCATTGCA CCTGGTG ACAGTTATACCTACACCTTCCGTGCTGTTCAGTACGGTACTTCATGGTACCATAGCCATTATTC TCTGCA GTATGCTGATGGCTTGGCTGGCCCTATCACTATTTACGGGCCTTCTTCTGCGCCGTTCGATGAG GGACGA AATCCAATTCTTATCACCGATTGGAGTCATCGCAGTGCGTTCCAGTCTTGGCAGAGGGAGCTT GTGCCGA ATCCTACGAGACCTATGATGAATGGTGTTTTAATCAATGGCGTGGGGAACTTTGCTGGTAGTT TCCCTCG TGAGCGGTTCAACATGACTGTGACCAAGGTAGGCTACTTAAGCGCAGCAGCTGATAAGTCTGT ACTGACA ATCAATAGGGCAGGAAATATGTTCTTCGGGTGATCAACACCTCTGTGGCTACAACATGGATCT TCAGTAT CGACAATCACAACTTCACTGTTATGTCGACCGACTTTGTGCCGATCCATCCTTACTCAGTCTCT CACATT GTCCTCGGAATCGGTAAGCATATCTTCTCATTACAACCAATTGAAGACATTCTCACTGATGTCG GTGAAC AGGCCAGGGATATCACATTGTCCTGGATGCAAACCCCACCAACACCACAAAAATGCCCGCAA ACCCCGAT GGAAACTACTGGATTCGGACCGTCGGAGCAACTCGCTGCAAGGGCTTCGAGCCAGGCAATGA GCCTGATG AGCGACAAGGTATTCTACGGTACAATGCATTAAGCAAACTTGTTCCAACAACGTTCCGAGAGG ACTATTC CTTGGAATGTCGAGATGAAGCATATGATCGACTCAGCCCGGTTTACGAGTGGAATGTTGACCC TGTCAAG ATCAACTGTAAGTCACCGACGACCTTAATATTGTATGATTCCTCTAACTTTTGACTCAGACACC AAGAGC CAGTTCGACATTGGTCTAGCGAAGTTTGCACACAGGCCTGAGCTGATGGACAACTTCACCTGG TGGGCCT TTGGCGAGAATCCTCTCTGGTTGAACTTCTCCAACCCTACTATTCTGAATCTCAAGAACACCAC ATGGAA TCCCGACTATGCTGTGGATCTGGTGGTACCTGACTCGAAGAAAGATAAATGGGTCTACATCGC TATCACA 140 GCCCCTCCGGCTCCCATTCAGACCAAACCCAACAGAGCTTTTGCTCCCGTTGCTCATCCTGTAA GCCAAC CTCATCCCTCCAAATAACTATCTCTAATGCGTAACAGCTCCATCTTCACGGTCACGACTTTGCC CTTCTA GCGCAAGGTACCAACTTCTCAGACCTGGACACAGGAAAGGTCAATCTCAAGTTCAACAACCCT CCTCGTC GAGATGTTGCGCTTCTTCCCGCCGGAGGATATCTCGTCGTTGCCTTCAAGGCCGACAACCCTG GTTCTTG GCTGTTCCACTGCCATATTGCGTGGCATGCGTCTAGTGGTCTGGCGATTCAGATCCTGGAGCA ACAGACG TTGCTGAATAGGATCTTGGATCAGTATCCTGAGAAGATGAAGGAGGTGAATAGAGTCTGTGAT AACTGGA ATAAGTGGTTCAAGAATGATACGAACCTTTGGAATGCCCATATCTTCCAGGATGACTCGGG TATCTAA Hình Trình tự nucleotide gen Folac4 phân lập từ chủng F oxysporum HUIB02 Trình tự vùng khơng mã hóa intron thích chữ màu trắng đen 141 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDDRVLPLVCCTCGWRWIAALIVVALLSAIGVVVALH MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDARTPPSVCCTCGWRWIAALIVVALLSAIGVVVALY MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDDRTPPSVCRTCGWRWITALIVVALLSAIGVVVVLH MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDDRTPPSVCRTCGWRWIAALIVVALLSAIGVVVVLH MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDDRTPPSVCRTCGWRWITALIVVALLSAIGVVVVLH MVAHDEEADALLEEFELREEVKVRDDRTPPSVCRTCGWRCMTALIVVALLSAIGVVVVLH ************************* * * ** ***** ::***************.*: 60 60 60 60 60 60 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 GLSSSQPSNDTTGHLGYRLHPQNHTSRPPTTLSFNWTITTGTRSPDGVEKQVYLVNDEFP GPSSSPPGNDTTGHLGYRLHPEDHAKRPPTTQYFNWTIAAGTKSPDGVEKRVYLVNNEFP GPLSNQLSDDATGHLGYRLHPQSHASRPPTTQSFNWTITAGTRSPDGVEKRVYLVNNEFP GLLSNQLSDDATGHLGYRLHPQSHASRPPTTQSFNWTITAGTRSPDGVEKRVYLVNNEFP GPLSNQLSDDATSHLGYRLHPQSHASRPPTTQSFNWTITAGTRSPDGVEKRVYLVNNEFP GPLSNQLSDDATSHLGYRLHPQSHASRPPTTQSFNWTITAGTRSPDGVEKRVYLVNNEFP * * .:*:*.********:.*:.***** *****::**:*******:*****:*** 120 120 120 120 120 120 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 GPLIEARSGDRVVIHVHNGLQDESVSLHWHGLRMKDQNNMDGAVGFTQCPIAPGRTFTYN GPLIEARSGDRIVIHVRNGLQDEGLSLHWHGLRMRYQNSMDGAVGFTQCPITPGTSFTYN GPLIEARSGDRLVIHVHNGVQDEGVSLHWHGLRMKYQNSMDGAVGFTQCPIAPGRSFTYN GPLIEARSGDRLVIHVHNGVQDEGVSLHWHGLRMKDQNSVDGAVGFTQCPIAPGRSFTYN GPLIEARSGDRLVIHIHNGVQDEGVSLHWHGLRMKDQNSVDGAVGFTQCPIAPGRSFTYN GPLIEARSGDRLVIHVHNGVQDEGVSLHWHGLRMKDQNSVDGAVGFTQCPIAPGRSFTYN ***********:***::**:***.:*********: **.:***********:** :**** 180 180 180 180 180 180 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 FTIGAEEYGTFWWHSHSDVQRADGLWGGLVVHYPHEVDIPQEDYLVMIGDWFHQNQTEVL FTIGAEEQGTFWWHSHSDVQRADGLWGGLVVHSPDEVDVPPEDYLLMIGDWFHRNQTEVL FTIGAEEHGTFWWHSHSDVQRADGLWGGLIVHSPDEIDLQREEYLLMVSDWFHQNQTEVL FTIGGEEHGTFWWHSHSDVQRADGLWGGLIVHSPDEIDLQRGEYLLMVGDWFHQNQTEVL FTIGAEEHGTFWWHPHSDVQRADGLWGGLIVHSPDEIDLQREEYLLMVGDWFHQNQTEVL FTIGAEEHGTFWWHSHSDVQRADGLWGGLIVHSPDEIDLQREEYLLMVGDWFHQNQTEVL ****.** ****** **************:** *.*:*: :**:*:.****:****** 240 240 240 240 240 240 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 RWYADASSRGNEPVPDSLLVNGKGRFNCSMVVPARPVACSQVQFSDLKPLMTSRSQNKVR GWYADASSRGNEPVPDSLLVNGRGRFNCSMAVPARPVVCSQVHLSDLKPLIMSGSLKKVR RWYADASSRGNEPVPDSLLLNGQGRFNCSMAVPARPVACSQVQFSDLKPLVMSRGQKKAR RWYADASSRGNEPVPDSMLVNGQGRFNCSMAVPARPIACSQVQFSDLKPLMMSRGQKKAR RWYADASSRGNEPVPDSLLVNGQGRFNCSMAVPARPVACSQVQFSDLKPLMMSRSQKKAR RWYADASSRGNEPVPDSLLVNGQGRFNCSMAVPARPVACSQVQFSDLKPLMMSRGQKKAR ****************:*:**:*******.*****:.****::******: * :*.* 300 300 300 300 300 300 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 LRVVNTGSVAGLSLGVGRAILRPVRMDGGFAVKSEAAETVGTLYPGERVDLEVEWKRNHP IRVVNTGSVAGLSLRVGGAIIRPVRVDGGFAVKTEATETVGVLYPGERVDLEVEWKENYA LRVVNAGSVAGLSLRVGGAIIRPVCVDGGFAVKAEATETVGILYPGERVDLEVEWKGNHA LRVVNTGSVAGLSLRVGGAIIRPVRVDGGFAVKAEATETVGILYPGERVDLEVEWKGNHA LRVVNTGSVAGLSLRAGGAIIRPVRVDGGFAVKAEATETVGNLYPGERVDLEVEWKGNHA LRVVNTGSVAGLSLRVGGAIIRPVRVDGGFAVKAEATETVGILYPGERVDLEVEWKGNHA :****:******** * **:*** :*******:**:**** ************** *: 360 360 360 360 360 360 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 GDDWLTIYMDDENFGYPNLALNPTQSFPMFSSSTKGSFNEPVPQPLDEGAIQVLDSQNLK GDRWLTVYMDDENFGYPNPALHPTQSFPMFSSSAKGSFDEAVPQPLKQDEIQVLDSQNLK GDHRLTVYLDDENFGYPNPALNPTQSFPMFSSSTKGSSNEPVPQPLEQDEIQVLDSQNLK GDHRLTVYLDDENFGYPNPALNPTQSFPMFSSSTKEPSNEPVPQPLEQDEIQVLDSHNLK GDHRLTVYLDDENFGYPNPALNPTQSFPMFSSSTKESSNEPVPQPLEQDEIQVLDSHNLK GDHRLTVYLDDENFGYSNPALNPTQSFPMFSSSTKESSNEPVPQALEQDEIQVLDSHNLK ** **:*:******* * **:***********:* :* *** *.: ******:*** 420 420 420 420 420 420 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 AAAKVSDLPPKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWGDDQ AVIKVSDLPAKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWDENQ TATKVSDLPAKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWDENQ AATKVSDLPAKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWDENQ AATKVSDLPAKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWDENQ AATKVSDLPAKAEQTILLYAKVEKLAHMDYAPVGFINHTSWTPQTPPLLAQNRTSWDENQ : ****** **********************************************.::* 480 480 480 480 480 480 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 LIPFIGISDRKPKRVDLIINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTDEA LVPFIGISDSKPKRVDVVINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTGEA LIPFIGISGSKPKRVDIVINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTDEA LIPFIGISDSKPKRVDIVINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTDEA LIPFIGISDSKPKRVDIVINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTDEA LIPFIGISDSKPKRVDIVINNLDDGAHPFHLHGHSFYVLSSYRNPGRGSWGSYNPYTDEA *:****** ******::***************************************.** 540 540 540 540 540 540 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 PPNGLNLAFPVRKDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHMLVHMARGMAMGLHVGDIE PPNGLDLEFPVRKDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHMLVHMARGMAMGLHVGDID PPNGLNLEFPVRRDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHMLVHMARGMAMGLHVGDIE PPNGLNLEFLVRRDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHMLVHMARGMAMGLHVGDIK PPNGLNLEFPVRRDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHTLVHMARGMAMGLRVGDIE PPNGLNLEFPVRRDTVSVPRRGHVVLALVADNPGIWALHCHMLVHMARGMAMGLHVGDIE *****:* * **:**************************** ************:**** 600 600 600 600 600 600 XP_018760174.1 XP_031078469.1 XP_031059432.1 XP_031031156.1 HUIB02 XP_018252396.1 DPEHISSVDQRAAELCDSEHVA AELCDPERVGSVDVRAAELCE DPEHVGSVDVRAAELCE DPEHVGSVDVRAAELCE DPEHVGSVDVRAAELCE * *:: **** 616 610 617 617 617 617 Hình So sánh trình tự amino acid suy diễn gen Folac4 chủng F oxysporum HUIB02 với chủng nấm khác Sự sai khác aa chủng biểu diễn đen 142 Phụ lục Các peak giải trình tự gen Folac1 143 Hình Peak giải trình tự gen Folac1 pGEM®T-Easy sử dụng mồi T7promoter 144 145 146 Hình Peak giải trình tự gen Folac1 pGEM®T-Easy sử dụng mồi SP6Long 147 148 149 Hình Peak giải trình tự gen Folac1 pPICZαA sử dụng mồi AOX1-F 150 151 152 Hình Peak giải trình tự gen Folac1 pPICZαA sử dụng mồi AOX1-R 153 154 ... THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỐC NHUỘM CƠNG NGHIỆP Ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người... lợi ưu việt vậy, chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo laccase tái tổ hợp thử nghiệm khả khử màu số thuốc nhuộm công nghiệp? ?? nhằm mục đích tạo laccase tái tổ hợp để phân giải hợp chất hữu khó phân hủy gây... 100 4.3.2 Khảo sát đặc tính enzyme tái tổ hợp .102 4.3.3 Tối ưu hóa biểu laccase tái tổ hợp 103 4.4 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP