Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm a h7n9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2019 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hoàng Hà hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi ln nhận đƣợc giúp đỡ tập thể cán hƣớng dẫn, thầy cô giáo, nhà khoa học, anh chị em đồng nghiệp quý quan, phòng ban Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, phòng chức Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho tơi học tập hồn thành luận án Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Luận án đƣợc thực tại, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Với hỗ trợ tài điều kiện làm việc khn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thủy Lê Thị Thủy ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu thân số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần cịn lại chƣa cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày tháng Tác giả Lê Thị Thủy năm 2019 iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN Ii MỤC LỤC Iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Vi DANH MỤC BẢNG Viii DANH MỤC HÌNH Xi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/ H7N9 1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9 1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9 1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt virus cúm A/H7N9 10 1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9 13 1.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A 16 1.2.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A 16 1.2.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật 19 1.2.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm Việt Nam 20 1.2.4 Một số nghiên cứu vắc xin cúm Việt Nam 21 1.3 Biểu tạm thời protein tái tổ hợp thực vật thông qua Agrobacterium 24 1.3.1 Hệ thống biểu tạm thời protein tái tổ hợp thực vât 24 1.3.2 Quá trình biểu tạm thời thông qua Agrobacterium 26 iv 1.3.3 Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu protein tái tổ hơp thực vật……… 28 1.3.4 Tinh protein tái tổ hợp thực vật……………………………… 1.4 Nano kim cƣơng (NDs) ứng dụng tiềm công 34 nghệ sinh học 37 1.4.1 Giới thiệu chung vật liệu nano kim cƣơng 37 1.4.2 Ứng dụng Nanodiamons khoa học sống công nghệ sinh học 37 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Vật liệu 41 2.1.1 Chủng vi khuẩn 41 2.1.2 Các vector vật liệu thực vật, động vật 41 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 42 2.1.4 Hóa chất……………………………………………………………… 42 2.1.5 Thiết bị……………………………………………………………… 43 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen tạo chủng A tumefaciens cho biểu tạm thời 43 2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen 45 2.2.3 Các phƣơng pháp biểu tạm thời đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hợp thuốc 47 2.2.4 Tách chiết tinh protein tái tổ hợp …………………………… 2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học protein kháng nguyên 2.2.6 tinh sạch……………………………………………………………… 51 Phân tích thống kê kết thực nghiệm……………………………… 55 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU 3.1 50 56 Tổng hợp nhân tạo thiết kế vector hỗ trợ biểu gen mã hóa kháng nguyên HA…………………………………………………… 56 3.1.1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA…………………… 56 3.1.2 Kết tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ELP 59 3.1.3 Kết tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP 62 v 3.1.4 Kết tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric 65 3.1.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc 68 3.2 Tối ƣu điểu kiện biểu tinh protein HA tái tổ hợp 3.2.1 Tối ƣu điểu kiện biểu protein HA tái tổ hợp………………… 71 3.2.2 Kết biểu tinh protein HA…………………………… 75 3.2.3 Kết đánh giá khả hình thành oligomer protein HA 71 trimeric phản ứng liên kết ngang……………………………… 83 3.3 Kết tạo phức hệ, khả gây ngƣng kết hồng cầu kháng nguyên HA phức hệ HA trimeric:ND 3.3.1 Kết tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND 3.3.2 Đánh giá khả ngƣng kết hồng cầu protein tinh HA trimeric-IgMFc 3.3.3 84 88 Đánh giá khả ngƣng kết hồng cầu protein tinh HA mono_ELP HA trimeric_ELP…………………………………… 3.4 84 89 Đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HA phức hệ HA trimeric:ND động vật………… 91 3.4.1 Kết thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch chuột…………… 91 3.4.2 Khả kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu với HA………… 92 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 95 Tổng hợp nhân tạo thiết kế vector hỗ trợ biểu gen mã hóa kháng nguyên HA…………………………………………………… 95 4.1.1 Lựa chọn gen thiết kế vector biểu 95 4.1.2 Cấu trúc vector biểu gen mã hóa kháng nguyên HA 96 4.2 Biểu tạm thời gen mã hóa kháng nguyên HA thông qua vi khuẩn Agrobacterium……………………………………………… 101 4.2.1 Mức độ biểu tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp 101 4.2.2 Khả hình thành oligomer 103 4.3 Khả tạo phức hệ gây ngƣng kết hồng cầu kháng nguyên HA 104 vi 4.3.1 Khả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND 104 4.3.2 Khả gây ngƣng kết hồng cầu kháng nguyên HA phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12) 4.4 105 Khả kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu chuột 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b virus khảm dƣa chuột) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) Aa Amino acid (axit amin) Bp Base pair (Cặp base) BSA Bovine serum albumin CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELP Elastin-like polypeptide ER Endoplasmic reticulum (Lƣới nội chất) Fc Fragment crystallizable HA Hemagglutinin HAU Hemagglutination unit HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) HRP Horseradish peroxidase IgG Immunoglobulin G IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatoraphy (sắc khí lực) Kb Kilobase KDa Kilodalton LB Luria-Bertani (Môi trƣờng nuôi vi khuẩn) mITC Membrane-based ITC (phƣơng pháp tinh qua màng) NA Neuraminidase OD Optical density (Mật độ quang) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction viii PCS Polycloning site ARN Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SAP Shrimp alkaline phosphatase ScFv Single chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA TaqDNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) v/p vòng/phút VLP Virus-like particle WHO World Health Oganization WT Wild type (Cây không chuyển gen) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả lây nhiễm, gây bệnh tính nhạy cảm với thuốc kháng virus virus cúm gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm……………… 14 Bảng 1.2 Danh sách số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao cho sở có nhu cầu sản xuất………………………………… Bảng 1.3 Sự so sánh đặc trƣng kỹ thuật CVD diamons, Titanium thép không gỉ Bảng 2.1 20 38 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric HA trimeric-IgMFc 42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 44 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (34)……………………… 49 Bảng 3.1 Nồng độ protein HA mẫu biểu tạm thời protein HA 44 khơng sử dụng vector hỗ trợ có sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV/2b CMV………………………………………… Bảng 3.2 72 Kết phân tích phƣơng sai cơng thức thí nghiệm thí nghiệm trực giao……………………………………… 75 Bảng 3.3 Mức độ biểu khả gây ngƣng kết hồng cầu protein HA 90 126 102 Nguyễn Thị Bích Nga, Đỗ Văn Khiên, Lê Thanh Hòa (2013) Xác định phân nhánh (clade) 2.3.2.1A 2.3.2.1C virus cúm A/H5N1 phân lập năm 2013 Việt Nam Khoa học Kỹ thuật thú y 20(7): 16-23 103 P Steppert, D Burgstaller, M Klausberger, A Tover, E Berger, A Jungbauer (2017.) Quantification and characterization of virus-like particles by sizeexclusion chromatography and nanoparticle tracking analysis J Chromatography A 104 Patel, J., Zhu, H., Menassa, R., Gyenis, L., Richman, A., and Brandle, J (2007) Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves Transgenic Res 16: 239-249 105 Peyre M., Fusheng G., Desvaux S., Roger F (2009), “Avian influenza vaccines: a practical review in relation to their alication in the field with a focus on the Asian experience”, Epidemiology and infection, 137(1), pp 1-21 106 Peyret H, Lomonossoff GP (2013) The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants Plant Mol Biol Volume 83(1-2): 51–58 107 Pham MD, Yu SSF, Han CC, and Chan SI (2013) Improved Mass Spectrometric Analysis of Membrane Proteins Based on Rapid and Versatile Sample Preparation on Nanodiamond Particles Anal Chem 85(14): 6748-6755 108 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2008) Xác định virus gây bệnh khảm dƣa chuột (cucumber mosaic virus-CMV) thuốc Cao Bằng Hà Tây thơng qua tách dịng giải trình tự gen mã hố protein MP CP Tạp chí Khoa học & Công nghệ 47(3): 83-93 109 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2009) Tạo thuốc chuyển gen kháng virus CMV kỹ thuật RNAi Tạp chí CNSH 6(4A):679-687 110 Prasad V, Satyavathi VV, Sanjaya, Valli KM, Khandelwal A, Shaila MS, and Lakshmi Sita G (2004) Expression of biologically active Hemagglutininneuraminidase protein of Peste des petits ruminants virus in transgenic pigeonpea [Cajanus cajan (L) Millsp.] Plant Science 166(1):199-205 127 111 Pushko P, Pujanauski LM, Sun X, Pearce M, Hidajat R, Kort T, Schwartzman LM, Tretyakova I, Chunqing L, Taubenberger JK, Tumpey TM (2015) Recombinant H7 hemagglutinin forms subviral particles that protect mice and ferrets from challenge with H7N9 influenza virus Vaccine 33(38): 4975-4982 doi:10.1016/j.vaccine.2015.07.026 112 Rabadan R, Levine AJ, Robins H (2006) Comparison of avian and human influenza A viruses reveals a mutational bias on the viral genomes J Virol 80(23): 11887–11891 113 Reber A, Katz J Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection Expert Rev Vaccines 2013; 12:519–536 [PubMed: 23659300] 114 Rigano MM, Alvarez ML, Pinkhasov J, Jin Y, Sala F, Arntzen CJ, and Walmsley AM (2004) Production of a fusion protein consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana Plant Cell Reports 22(7):502-508 115 Rivera AL, Gómez-Lim M, Fernández F, Loske AM (2012) Physical methods for genetic plant transformation Phys Life Rev 9(3): 308–345 116 Rohit RB, Riyaz AO, Prasanna PG, et al (2013) Nanodiamonds: A newfangled drug delivery system Indo American Journal of Pharm Research 3(12) 117 Rybicki EP (2014) Plant-based vaccines against viruses J Virol 11(1): 205-224 118 Salazar-Gonzalez JA, Banuelos-Hernandez B and Rosales-Mendoza S (2015) Current status of viral expression systems in plants and perspectives for oral vaccines development Plant Mol Biol 87(3): 203-217 119 Sambrook J, Green MR (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition Cold Spring Harbor Laboratory Press New York Volume 120 Sarkar SK, Bumb A, Wu XF, Sochacki KA, Kellman P, Brechbiel MW, and Neuman KC (2014) Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence Biomed Opt Express (4): 1190-1202 128 121 Scheller J, Leps M, Conrad U (2006) Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptides Plant Biotechnol J 4(2): 243–249 122 Schillberg S, Fischer R, and Emans N (2003) Molecular farming of recombinant antibodies in plants Cellular and Molecular Life Sciences 60(3):433-445 123 Schmeisser F, Vasudevan A, Verma S, Wang W, Alvarado E, Weiss C, Atukorale V, Meseda C, Weir JP (2015) Antibodies to Antigenic Site A of Influenza H7 Hemagglutinin Provide Protection against H7N9 Challenge PloS One 10(1): e0117108 124 Senne D A, Panigrahy B, Kawaoka Y (1996) Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: Amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential Avian Dis 40: 425‒437 125 Seternes T, Tonheim TC, Myhr AI and Dalmo RA (2016) A plant 35S CaMV promoter induces long-term expression of luciferase in Atlantic salmon Sci Rep 6: 25096 126 Shimazu, M., Mulchandani, A., and Chen, W (2003) Thermally triggered purification and immobilization of elastin-OPH fusions Biotechnol Bioeng 81: 74-79 127 Shoji Y, Bi H, Musiychuk K, Rhee A, Horsey A, Roy G, Green B, Shamloul M, Farrance CE, Taggart B (2009) Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza Vaccine 27(7): 1087–1092 128 Shukla DD, Frenkel MJ, McKern NM, Ward CW, Jilka J, Tosic M, Ford RE (1992) Present status of the sugarcane mosaic subgroup of potyviruses Arch Virol., Suppl 5: 363–373 129 Shukla DD, Ward CW (1989) Identification and classification of potyviruses on the basis of coat protein sequence data and serology Brief review Arch Virol 106 (3 –4): 171 –200 129 130 Srinivasan K, Raman R, Jayaraman A (2013) Quantitative description of glycanreceptor binding of influenza A virus H7 hemagglutinin PLoS One 8: e49597 131 Staub, J M., B Garcia, J Graves, P T Hajdukiewicz, P Hunter, N Nehra, V Paradkar, M Schlittler, J A Carroll, L Spatola, D Ward, G Ye and D A Russell (2000) "High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts." Nat Biotechnol 18(3): 333-8 132 Subbarao K, Chen H, Swayne D (2003) Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza a virus vaccine candidate generated by plasmidbased reverse genetics Virology 305: 192‒ 200 133 Sun L, Cai H, Xu W, Hu Y and Lin Z (2002) CaMV 35S promoter directs βglucuronidase expression in Ganoderma lucidum and Pleurotus citrinopileatus Appl Biochem Biotechnol 20(3): 239-244 134 Svedda MM, Lai CJ (1981) Functional expression in primate cells if cloned DNA coding for the hemagglutinin surface glycoprotein of influenza virus Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of the America 78 (9): 5489-5492 135 Tepfer M, Gaubert S, Leroux-Coyau M, Prince S and Houdebine LM (2004) Transient expression in mammalian cells of transgenes transcribed from the Cauliflower mosaic virus 35S promoter Environ Biosafety Res 3(2): 91-97 136 To KK, Chan JF, Chen H, Li L, Yuen KY (2013) The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities Lancet Infect Dis 13: 809e21 137 Tơ Long Thành, Nguyễn Hồng Đăng, Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Văn Lâm (2018) Hiệu lực vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm gà chống lại virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c Tạp chí hội phịng thử nghiệm việt nam Số 10 Tháng 08/2018 138 Trabbic-Carlson, K., Liu, L., Kim, B., and Chilkoti, A (2004) Expression and purification of recombinant proteins from Escherichia coli: Comparison of an elastin-like polypeptide fusion with an oligohistidine fusion Protein Sci 13: 3274-3284 130 139 Trần Xuân Hạnh (2004),“Một vài vấn đề phịng bệnh cúm gia cầm vacxin”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, XI (3), tr 84-85 140 Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Đỗ Thanh Thủy, Phạm Sĩ Tú, Tơ Long Thành, Tống Hữu Hiến, Nguyễn Hồng Đăng, Đàm Thị Vui (2013) Thử hiệu lực Vắc xin Navet-vifluvac phòng bệnh cúm A/H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1 c phƣơng pháp công cƣờng độc tiếp xúc trực tiếp Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XX, số 5, tr 22-29 141 Twyman RM, Stoger E, Schillberg S, Christou P and Fischer R (2003) Molecular farming in plants: Host systems and expression technology Trends Biotechnol 21(12): 570-578 142 Vaghchhipawala Z, Rojas CM, Senthil-Kumar M, Mysore KS (2011) Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses Methods Mol Biol 678: 65–76 143 Vaijayanthimala V, Lee DK, Kim SV, Yen A, Tsai N, Ho D, Chang HC, and Shenderova O (2015) Nanodiamond-mediated drug delivery and imaging: challenges and opportunities Expert Opin Drug Del 12(5): 735-749 144 Văn Đăng Kỳ (2012) Dịch cúm gia cầm từ đầu năm 2012 đến biện pháp phòng chống Khoa học kỹ thuật Thú y 19(5): 83-87 145 Van Ginkel, JH, Gorissen A, and Polci D (2000) Elevated atmospheric carbon dioxide concentration: effects of increased carbon input in a Lolium perenne soil on microorganisms and decomposition Soil Biology & Biochemistry 32(4): 449-456 146 Verwoerd TC, van Paridon PA, van Ooyen AJ, van Lent JW, Hoekema A, and Pen J (1995) Stable accumulation of Aspergillus niger phytase in transgenic tobacco leaves Plant Physiology 109 (4):1199-1205 147 Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus J Plant 33(5): 949–956 131 148 Wagner B, Fuchs H, Adhami F, Ma Y, Scheiner O, and Breiteneder H (2004) Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana Methods 32(3):227-234 149 Wagner R., Maosovich M., Klenk H (2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in fluenza virus infection Reviews in medical virology 12(3): 159-166 150 Wirth S, Calamante G, Mentaberry A, Bussmann L, Lattanzi M, Bara L et al., (2004) Expression of active human epidermal growth factor (hEGF) in tobacco plants by integrative and non-integrative systems Mol Breed.13(1): 23–35 151 Wright, P.F (2008) Vaccine preparedness - are we ready for the next influenza pandemic ? New Engl J Med 358: 2540-2543 152 www.who.org 153 Xu C, Min J(2011) Structure and function of WD40 domain proteins Protein Cell 2(3): 202-214 154 Xu G, Stoffers DA, Habener JF, Bonner-Weir S (1999) Exendin-4 stimulates both beta-cell replication and neogenesis, resulting in increased beta-cell mass and improved glucose tolerance in diabetic rats Diabetes 48 (12):2270–2276 155 Yang P, Wang Q, Pang X, Chen L, Tian L, Deng Y (2013) A case of avian influenza A (H7N9) virus occurring in the summer season, China J Infect 67(6): 624-5 156 Ye J, Qu J, Zhang J, Geng Y, Fang R (2009) A critical domain of the Cucumber mosaic virus 2b protein for RNA silencing suppressor activity FEBS Letters 583(1): 101–106 157 Ye J, Qu J, Zhang J, Geng Y, Fang R (2009) A critical domain of the Cucumber mosaic virus 2b protein for RNA silencing suppressor activity FEBS Letters 583(1): 101–106 158 Yu H, Wu JT, Cowling BJ, Liao Q, Fang VJ, Zhou S, Wu P, Zhou H, Lau EH, Guo D, Ni MY, Peng Z, Feng L, Jiang H, Luo H, Li Q, Feng Z, Wang Y, Yang 132 W, Leung GM (2013) Effect of closure of live poultry markets on poultry-toperson transmission of avian influenza A H7N9 virus: an ecological study Lancet Oct 30 pii:S0140-6736(13)61904-2 doi: 10.1016/S0140- 6736(13)61904-2 [Epub ahead of print] PubMed PMID: 24183056 159 Yu X, Jin T, Cui Y, Pu X, Li J, Xu J, Liu G, Jia H, Liu D, Song S, Yu Y, Xie L, Huang R, Ding H, Kou Y, Zhou Y, Wang Y, Xu X, Yin Y, Wang J, Guo C, Yang X, Hu L, Wu X, Wang H, Liu J, Zhao G, Zhou J, Pan J, Gao GF, Yang R, Wang J (2014) Coexistence of influenza H7N9 and H9N2 in poultry linked to human H7N9 infection and their genome characteristics J Virol 2014 Jan [Epub ahead of print] PubMed PMID: 24403589 160 Zelada AM, Calamante G, de la Paz SM, Bigi F, Verna F, Mentaberry A, and Cataldi A (2006) Expression of tuberculosis antigen ESAT-6 in Nicotiana tabacum using a potato virus X-based vector Tuberculosis (Edinb) 86 (3-4): 263-267 161 Zhang X, Du P, Lu L, Xiao Q, Wang Q, Cao X, Ren B, Wei C, Li Y(2008) Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the accumulation of siRNAs Virology 374 (2): 351 – 360 162 Zhong Y, Guo A, Li C, Zhuang B, Lai M, Wei C, Luo J, Li Y (2005) Identification of a naturally occurring recombinant isolate of Sugarcane mosaic virus causing maize dwarf mosaic disease Virus Genes 30 (1): 75 –83 133 PHỤ LỤC Hình 3.1 So sánh trình tự axit amin chuỗi polypeptide H7 số chủng virus H7N9 phân lập người gia cầm Trung Quốc giai đoạn từ 2013-2016 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLG A/Shanghai/1/2013 A/Guangdong/1/2013 K A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 K A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 A/Beijing/40610/2015 A/Guangdong/15SF050/2015 A/Fujian/54840/2016 A/Jiangsu/60462/2016 A/Zhejiang/6/2016 A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 K A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 QCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRT A/Shanghai/1/2013 A/Guangdong/1/2013 .A A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 I A/Beijing/40610/2015 N A/Guangdong/15SF050/2015 N A/Fujian/54840/2016 .T N A/Jiangsu/60462/2016 .T N A/Zhejiang/6/2016 .T N A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 N A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 134 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 NGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKL A/Shanghai/1/2013 .S N G A/Guangdong/1/2013 A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 A/Beijing/40610/2015 V I A/Guangdong/15SF050/2015 V I A/Fujian/54840/2016 V K I .N A/Jiangsu/60462/2016 V K I A/Zhejiang/6/2016 V K I A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 V I A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 VTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGV A/Shanghai/1/2013 .T Q A/Guangdong/1/2013 A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 .K A/Beijing/40610/2015 V A/Guangdong/15SF050/2015 A/Fujian/54840/2016 I A/Jiangsu/60462/2016 I A/Zhejiang/6/2016 I A A/chicken/Shanghai/019/2013 I A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 I A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 135 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 QVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIE A/Shanghai/1/2013 D Y A/Guangdong/1/2013 D A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 A/Beijing/40610/2015 A/Guangdong/15SF050/2015 A/Fujian/54840/2016 A/Jiangsu/60462/2016 A/Zhejiang/6/2016 A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 .N A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 NGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVI A/Shanghai/1/2013 .T A/Guangdong/1/2013 A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 G A/Zhejiang/1/2014 .I A/Fujian/2014 G A/Shanghai/PD-02/2014 .I A/Beijing/40610/2015 .A A/Guangdong/15SF050/2015 .A A/Fujian/54840/2016 .A A/Jiangsu/60462/2016 .A A/Zhejiang/6/2016 .A A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 .A .E A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 .A 136 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 NWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMAS A/Shanghai/1/2013 A/Guangdong/1/2013 A/Anhui/1/2013 A/Hangzhou/1/2013 A/Shantou/1002/2014 A/Zhejiang/1/2014 A/Fujian/2014 A/Shanghai/PD-02/2014 A/Beijing/40610/2015 A/Guangdong/15SF050/2015 A/Fujian/54840/2016 I A/Jiangsu/60462/2016 I A/Zhejiang/6/2016 I A/chicken/Shanghai/019/2013 A/chicken/Guangdong/SD641/2013 A/duck/Anhui/SC702/2013 A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 A/chicken/zhejiang/JX148/2014 A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 I 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | A/Shanghai/2/2013 IRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI* A/Shanghai/1/2013 A * A/Guangdong/1/2013 * A/Anhui/1/2013 * A/Hangzhou/1/2013 * A/Shantou/1002/2014 .M * A/Zhejiang/1/2014 * A/Fujian/2014 Q * A/Shanghai/PD-02/2014 * A/Beijing/40610/2015 R * A/Guangdong/15SF050/2015 R * A/Fujian/54840/2016 R * A/Jiangsu/60462/2016 R * A/Zhejiang/6/2016 R * A/chicken/Shanghai/019/2013 * A/chicken/Guangdong/SD641/2013 * A/duck/Anhui/SC702/2013 * A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 * A/chicken/zhejiang/JX148/2014 * A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 R * A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 R * 137 Hình 3.2 So sánh trình tự gen HA/H7N9 trƣớc sau tối ƣu 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCATTCCAACAA M HA/H7N9 opt N T Q I L V F A L I A I I P T ATGGCTTCCAAACCTTTTCTATCTTTGCTTTCACTTTCCTTGCTTCTCTTTACAAGCACATGTTTAGCAG M A S K P F L 80 S L L 90 S L S 100 L L L F 110 T S T 120 C L A 130 140 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACTGAAAG N HA/H7N9 opt A D K I C L G H H A V S N G T K V N T L T E R GATCC G A G T C A C C T T G G T G A G S D K I C L 150 G H H 160 A V S N 170 G T K 180 V N T 190 L T E 200 R 210 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGG HA/H7N9 opt .C T G A G G T GA C T A T T T A G V G E V V E V V N V A N 220 T A E T T E V T 230 E V R E T R 240 N T I N P I 250 R P I R C I S C 260 K S G K G 270 280 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAAT HA/H7N9 opt .A T C T.A G C TT C T T C T G G C T K R K T R V T D V L D G L Q G 290 C Q G C L G 300 L L G L T G 310 I T T I G T P G 320 P P Q P C Q 330 D C Q D Q 340 350 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) TCCTAGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATT F HA/H7N9 opt L E F S A D L I I E R R E G S D V C Y P G K F T.G CAGC C C A A G T C C T A T F L E F S A D 360 L I I 370 E R R E 380 G S D 390 V C Y 400 P G K 410 F 420 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) CGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTC HA/H7N9 opt .T G G CT.A .T.G G G T A A T A G C T V N V E N E E A E L A R L 430 Q R I Q L I 440 R L E R S E G S 450 G G I G D I 460 K D E K A E 470 M A G M F G 480 F 490 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ACATACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAG HA/H7N9 opt G TTCC G C C G G ATCG G C GAGT T C T T T Y Y S S G G 500 I I R R T T 510 N N G G A A 520 T T S S A A C C 530 R R R R S S 540 G G S S S S 550 F F Y Y A A 560 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATAC 138 E HA/H7N9 opt M K W L L S N T D N A A F P Q M T K S Y K N T G T T T C C A A A A G C E M K W L L S 570 N T D 580 N A A F 590 P Q M 600 T K S 610 Y K N 620 T 630 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTA HA/H7N9 opt C TCA T G G T G A A G C T G A AT.G R K R S K P S A P L A I L 640 V I W V G W I G 650 H I H H S H 660 V S S V T S 670 A T E A Q E T Q 680 K T L K L 690 700 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) TATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAG HA/H7N9 opt C TTCA T .TCAAGC C G A T C Y G Y S G G S N G K N L K V L 710 T V V T G V 720 S G S S N S 730 Y N Q Y Q Q S Q 740 F S V F P V 750 S P P S P 760 770 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) GAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGA G HA/H7N9 opt A R P Q V N G L S G R I D F H W L M L N P N D T A T CT AGC C A T .T T.G C G G A R P Q V N 780 G L S 790 G R I D 800 F H W 810 L M L 820 N P N D 830 840 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) TACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCT HA/H7N9 opt C C T C TC T G C G TA.A TTCT TT.A G G T V T T V F T S F F S N F 850 G N A G F A I F 860 A I P A D P 870 R D A R S A 880 F S L F R L G R 890 K G S K S 900 910 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAA HA/H7N9 opt .G T ATCA T C G G A T C TC A C M G M I G Q I S Q G S V G Q V 920 V Q D V A D 930 N A C N E C 940 G E D G C D Y C 950 H Y S H G S 960 G G T G T 970 980 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) TAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCA I HA/H7N9 opt I S N L P F Q N I D S R A V G K C P R Y V K Q T TTC T T T C A T C T G A G G A I I S N L P F 990 Q N I 1000 D S R 1010 A V G K 1020 C P R 1030 Y V K 1040 Q 1050 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAGGAGTCTGCTGCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGT HA/H7N9 opt .A T.AT.AT C C A A A A C G AT.G R R S S L L L L 1060 L L A A T T 1070 G G M M K K 1080 N N V V P P E E 1090 I I P P K K 1100 G G R R G G 1110 L L F F G G 1120 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) GCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGA 139 A HA/H7N9 opt I A G F I E N G W E G L I D G W Y G F R H Q .A G AT.G .G A A I A G F I E 1130 N G W 1140 E G L 1150 I D G W 1160 Y G F 1170 R H Q 1180 1190 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAAA N HA/H7N9 opt A Q G E G T A A D Y K S T Q S A I D Q I T G K T A A G A C C T GTC A AGC C C C T C G N A Q G E G T 1200 A A D 1210 Y K S T 1220 Q S A 1230 I D Q 1240 I T G 1250 K 1260 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATTAAACCGGCTTATAGAAAAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATAGACAATGAATTCAATGAGGTAGAG HA/H7N9 opt C.T A T.A T G G T AC.T T T C G T A T A L N L R N L R I L E I K E 1270 T K N T Q N Q Q 1280 F Q E F L E 1290 I L D I N D 1300 E N F E N F E N 1310 V E E V E 1320 1330 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAGCAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCATACAATGCTGAAC HA/H7N9 opt A G C C C G AG C C AGC T A K Q K I Q G I N G V N I V N I 1340 W N T W R T 1350 D R S D I S 1360 T I E T V E W V 1370 S W Y S N Y 1380 A N E A E 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) TCTTGGTAGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACG L HA/H7N9 opt L V A M E N Q H T I D L A D S E M D K L Y E R AC.A G G A T A T.A A G G T GT.A T A L L V A M E N 1410 Q H T 1420 I D L A 1430 D S E 1440 M D K 1450 L Y E 1460 R 1470 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGT HA/H7N9 opt .T G T.A A A T G A C T T A V K V R K Q R L Q R L E R 1480 N E A N E A E E 1490 D E G D T G 1500 G T C G F C 1510 E F I E F I H F 1520 K H C K C 1530 1540 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) GATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGC HA/H7N9 opt T ATCA C C A C C T T G A C D D D D D C D M C A M S A I S 1550 R I N R N N 1560 T N Y T D Y 1570 H D S H K S Y K 1580 R Y E R E E 1590 A E M A M 1600 1610 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) AAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTT Q HA/H7N9 opt N R I Q I D P V K L S S G Y K D V I L W F S F G T A C T T A T.GTCT T G T G C C G TCA Q N R I Q I D 1620 P V K 1630 L S S 1640 G Y K D 1650 V I L 1660 W F S 1670 F 1680 | | | | | | | | | | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) CGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTAAAGAATGGAAAC G A S C F I L L A I V M G L V F I C V K N G N 140 HA/H7N9 opt AGT T T.GT.G A C G T.A T T C A G A S C F I 1690 L L A I V M G L V F I C V K N G N 1700 | | | | | HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCGGTGCACTATTTGTATATAA HA/H7N9 opt .A .A C GGGCCC M M R R C C T T I I C C I I * G P Trình tự màu đen: 54 nucleotide mã hóa chuỗi peptide tín hiệu gồm 18 axit amin dẫn đầu Trình tự gạch chân: 75 nucleotide mã hóa cho LeB4 ER-signal peptide đoạn peptide tín hiệu gen LeB4 Trình tự bơi vàng: vị trí nhận biết enzyme hạn chế BamHI PspOMI