Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana

Luận án nghiên cứu với mục tiêu tìm hiểu biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA trimeric và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND. Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành:  Sinh lý thực vật Mã số:  9 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2019 Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học:  PGS.TS Phạm Bích Ngọc   PGS.TS Chu Hồng Hà Phản biện 1:  Phản biện 2:  Phản biện 3:  Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ phiên chính thức họp tại:  Viện Cơng nghệ sinh học Vào hồi   giờ    ngày   tháng     năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại:  ­ Thư viện Quốc Gia Việt Nam ­ Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn ­ Viện Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới được phát hiện tại Trung Quốc vào năm  2013. Virus cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ  gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus   cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên  bề  mặt capsid của hạt virus mang tính kháng ngun tham gia q trình đáp  ứng miễn dịch   Kháng ngun HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng ngun NA có 9 type (ký hiệu  từ  N1 đến N9). Kháng ngun HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có   đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả năng đột  biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng ngun, đặc biệt là điểm cắt của  enzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên  tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao  trên kháng ngun H7 của các chủng virus H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm chuỗi nối giữa  HA1 và HA), hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng ngun bề mặt dẫn đến sự  thay   đổi tương quan đáp  ứng miễn dịch. Kháng ngun NA do phân đoạn 6 mã hóa,   đây là một   protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân  tử acid sialic (N­acetylneuramic acid) giải phóng virus trong q trình lây nhiễm. Kháng ngun  NA do phân đoạn 6 mã hóa,  đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể  tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử  acid sialic (N­acetylneuramic acid) giải phóng virus  trong q trình lây nhiễm Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ  ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm virus cúm gia  cầm A/H7N9 trên người được phát hiện và cơng bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc.  Chỉ trong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra   11 tỉnh thành của Trung Quốc, gây ra 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị  suy hơ hấp   nặng, trong đó 39 người đã tử  vong (WHO, 2013). Trong đợt dịch cúm A/ H7N9  thứ  5  trên  người tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 đã khiến 36 người chết trên tổng số  304 người mắc bệnh (WHO, 2017). Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ  cao bất thường cho một sự lây nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối   với con người Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9 đã cho thấy virus  A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế bào của lồi có vú (người, heo,  ) so   với các chủng virus cúm gia cầm khác. Cho đến nay chưa có bằng chứng nào về  việc virus cúm  A/H7N9 lây truyền từ người sang người ­ yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một   đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch  H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền người­người của   virus H7N9 hiện nay Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng như trên gia cầm;   tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do Việt Nam có đường   biên giới trải dài với Trung Quốc. Vấn đề  cấp bách hiện nay ngồi việc triển khai các biện  pháp phịng bệnh chủ động như sử dung trang thiêt bi cho viêc giám sát nh ̣ ́ ̣ ̣ ư máy đo thân nhiêṭ   từ xa, các hê thơng xét nghiêm xác đinh virus… c ̣ ́ ̣ ̣ ần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin  phịng bệnh Trong những năm gần đây một hướng mới đã được ứng dụng để  phát triển cac loai vacxin ́ ̣   cúm khac nhau, trong đó có h ́ ướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật. Hệ thống biểu hiện ở thực vật   rất hữu dụng vì vacxin được tạo ra hứa hẹn sẽ có giá thành thấp hơn từ 10­20 lần so với phương   pháp truyền thống. Tuy nhiên, protein tái tổ hợp được tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại khơng   cao và thiếu một phương thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhược điểm   này, hiện nay hệ thống biểu hiện tạm thời là phương pháp hữu ích để sản xuất kháng ngun tái tổ  hợp ở thực vật. Phương pháp này có ưu điểm nhanh, hàm lượng protein tái tổ hợp cao, khơng bị ảnh  hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mơ đã biệt   hóa hồn tồn như lá Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng ngun của virus cúm A/H7N9 trong tế bào   thực vật là rất cấp thiết. Hơn nữa mơ hình sản xuất kháng ngun tái tổ hợp bằng phương pháp   biểu hiện tạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin với số lượng lớn và nhanh chóng (1­2 tháng)  đáp  ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Việc kết hợp kháng ngun tái tổ  hợp với vật liệu nano  (ND) nhằm sản xuất vacxin dạng như virus nhằm tăng cường hoạt tính kháng ngun. Với cơ sở  khoa học và ứng dụng như trên, chúng tơi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu tạo kháng ngun tái tổ  hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá  (Nicotiana benthamiana.) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium” 2. Mục tiêu nghiên cứu   Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng ngun HA trimeric và phức hệ  kháng ngun HA trimeric:ND  Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả  năng kích thích đáp  ứng miễn dịch trên động vật  thí nghiệm của kháng ngun tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND 3. Nội dung nghiên cứu  (1):Thu thập thơng tin, tổng hợp gen mã hóa kháng ngun và thiết kế vector biểu hiện  mang gen mã hóa kháng ngun HA; (2) :Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng ngun HA  của virus H7N9 ở thuốc lá ;(3): Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu  của kháng ngun HA và HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng  miễn dịch của kháng ngun HA và phức hệ  kháng ngun HA trimeric:ND trên động vật thí   nghiệm 4. Đóng góp mới của luận án ­ Đã thiết kế  thành cơng 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP pCB301/HA   trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric­IgMFc  mang gen HA được tổng hợp  nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo chủng  Agrobacterium mang vector tương  ứng.  ­ Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP,  pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric­IgMFc trong cây  thuốc lá bằng phương pháp mITC và IMAC ­ Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngưng kết  hồng cầu của protein HA với hiệu giá ngưng kết của HA trimeric_ELP và HA trimeric bằng 2  HAU, HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lượng 5 µg tại giếng đầu tiên ­ Các kháng ngun HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây đáp  ứng miễn  dịch ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn HA trimeric 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển  gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric­IgMFc mã hóa cho các  kháng ngun HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng ngun tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp  biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể  của các kháng ngun tái tổ  hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả  đề  tài luận án là bằng   chứng khoa học về  tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị  phịng virus cúm  trong thực vật 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng ngun tái tổ  hợp  HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric­IgMFc  của chủng virus  cúm đang lưu hành tai Trung Quốc và các chủng  A. tumefaciens  mang các vector này có thể  được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phịng virus   cúm Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời với các  điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng ngun tái tổ hợp HA  mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric­IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác Kháng ngun tái tổ  hợp HA trimeric : ND được tạo ra trong đề  tài luận án là  ứng viên   tiềm năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phịng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 19 tài liệu trong nước, 140 tài liệu nước ngồi với các nội dung  liên quan bao gồm: (1) Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 như: nguồn gốc virus cúm A/H7N9,   đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9, đa hợp tạo nên phân type A/H7N9, đặc điểm kháng ngun bề  mặt của virus cúm A/H7N9, tình hình dịch cúm A/H7N9; (2) Vacxin phịng chống bệnh cúm A như:  Một số loại vacxin phịng bệnh cúm A hiện nay, vacxin tái tổ hợp từ thực vật, các nghiên cứu về vacxin  cúm A/H7N9 trên thế giới,  một số nghiên cứu vacxin cúm gia cầm ở Việt Nam hiện nay; (3) Biểu hiện  tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật như: Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât,   q trình biểu hiện tạm thời thơng qua Agrobacterium tumefaciens, các chiến lược tăng cường biểu  hiện protein tái tổ hơp ở thực vật, sản xuất protein tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời,   tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật; (4) Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong  cơng nghệ sinh học  như: giới thiệu chung về vật liệu nano kim cương, Ứng dụng của Nanodiamons  trong khoa học sự sống và cơng nghệ sinh học Với các tài liệu thu thập được cũng như kết quả phân tích cho thấy chủng virus cúm H7N9  trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉ gây ra dịch bệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản và   Hoa Kỳ. Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện   và công bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013).  Đặc  biệt,  sự  bùng phát dịch cúm H7N9 trên người gần đây nhất được ghi nhận tại Trung Quốc   diễn ra từ  19/1/2017 đến 14/2/2017 được xem là đợt dịch thứ  5 đã khiến 36 người chết trên  tổng số  304 người mắc bệnh (WHO, 2017). Dữ  liệu theo dõi về  mặt virus học đã phân tích   trình tự  genome của 83 chủng phân lập từ  mơi trường (2 trường hợp) và người bệnh (81   trường hợp) cho thấy các chủng gây bệnh trên người vẫn tương tự  những chủng đã được  phân tích năm 2013 Phân tích hiện đang được tiến hành để xác định xem các virus vacxin hiện có liên quan kháng  ngun với virus  ở đợt dịch thứ năm hay khơng. Theo Tổ chức Y tế thế giới khơng loại trừ  khả  năng cúm gia cầm A/H7N9 lây từ người sang người trong những ổ dịch mới đây tại Trung Quốc   Mặc dù, cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang  người ­ yếu tố cơ bản để H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan   truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng   cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền người­người của virus H7N9 hiện nay. Điều này gây ra  nhiều khó khắn cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin phịng chống virus cúm A. Các vacxin được  sản xuất từ các chủng virus dịng châu Âu và dịng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống  – nhược độc và vacxin vơ hoạt. Vacxin vơ hoạt thường an tồn, có khả năng phịng ngừa các triệu   chứng lâm sang nhưng hiệu quả bảo hộ khơng cao. Vacxin nhược độc tạo ra miễn dịch nhược độc   tốt hơn với các chủng tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng   với các chủng mới, có nguy cơ phát triển độc tính trở lại, bản thân của virus vacxin sau nhiều lần   truyền nhiễm có thể đột biết trở thành cường độc Để nâng cao hiệu quả phịng chống virus cúm A, việc nghiên cứu sản xuất các loại vacxin thế  hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới hiện nay là rất cần thiết. Vacxin tiểu đơn vị được   sản xuất trong thực vật phịng chống virus cúm là hướng nghiên cứu mới đã được đánh giá là có   triển vọng và ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với   khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp. Protein HA là những protein kháng ngun mang gen của  chủng virus H7N9 được lựa chọn là những ứng viên có tiềm năng để sản xuất vacxin tiểu đơn vị  phịng chống virus cúm A. Hiện này có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein HA của virus cúm đã   được thử nghiệm, trong những hệ thống đó chúng tơi đã sử dụng hệ thống biểu hiện gen tạm thời  ở thực vật bằng phương pháp biểu hiện tạm thời nhờ Agrobacterrium là phương pháp để sản xuất  kháng ngun có nhiều ưu điểm đã được chứng minh như: Hàm lượng kháng ngun cao, thời gian  biểu hiện nhanh, khơng bị ảnh hưởng của vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến  hành biểu hiện trong các mơ đã biệt hóa hồn tồn như mơ lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ  gen và tính kháng ngun của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và các thành tựu đạt được về biểu   hiện, sản xuất vacxin tiểu đơn vị trong thực vật phịng chống bệnh cúm là căn cứ để chúng tơi thực   hiện đề tài luận án này CHƯƠNG 2  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng  Escherichia coli DH5α; Chủng A. tumefaciens C58C1; Chủng A.  tumefaciens  C58C1 mang vector pIBT­35S­HC­Pro PVY chứa gen mã hóa protein HcPro PVY 2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật Vector   pUC/HA   mang  gen   mã   hóa   cho   kháng   nguyên  nhân  tạo     tổng   hợp     cơng  ty   SGIDNA của Thụy Điển; Vector tách dịng pBT (Phan và cs., 2005); Vector pRTRA35S­HA­ histag­cmyc­100xELP­KDEL     vector   pRTRA­35S­H5pII­histag­cmyc­ELP­KDEL    Vector  pRTRA_35S_SP_His_  H5_pII_IgMFc  _cmyc_KDEL  đã được thiết kế  (Phan  và cs.,  2013); Các  vector chuyển gen pCB301­Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và cs., 1999) và pBT/Hcpro PRSV;  Cây thuốc lá N. benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C  2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Các mồi sử dụng để khuếch đại vùng mang các gen mã hóa H7: cặp mồi nhân gen HA  mono_ELP  là  H7­BamHI_F, H7­BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric TrH7­PspOMI_R,  H7­BamHI_F và H7­BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric­IgMFc là M­BamHI­trimer_R,  H7­BamHI_F; cặp Mồi giải trình tự gen H7 35S­SQF và 35STerm 2.1.4 Hóa chất Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep (Sigma), kit tách chiết  plasmid QIAprep Spin Miniprep , kit thơi gel QIAquick Gel Extraction và kit tinh sạch DNA   QIAamp DNA mini của hãng QIAGEN, thang DNA 1 Kb, protein (Fermentas), cac loai enzyme han ́ ̣ ̣   chê cua Fermentas. Các hố ch ́ ̉ ất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl,   Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử  ion; các loại  kháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các hóa chất thơng dụng khác của các hãng   Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech… Kháng thể  kháng cmyc   được tổng hợp từ khuẩn bởi phịng thí nghiệm trọng điểm­Viện Cơng nghệ sinh học, kháng thể  anti­mouse IgG cộng hợp HRP  (Promega ­ USA), kháng ngun scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc  được tổng hợp bởi phịng thí nghiệm trọng điểm­Viện Cơng nghệ sinh học, hóa chất hiện màu   TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine). Kit hiện phim Super Signal West  Pico Trial (Thermo Scientific) 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1   Các   phương   pháp   thiết   kế   gen,   thiết   kế   vector   chuyển   gen     tạo   chủng   A   tumefaciens cho biểu hiện tạm thời Phân tích và tổng hợp thơng tin về trình tự gen HA mã hóa cho kháng ngun hemagglutinin  của virus cúm A/H7N9 đang gây bệnh ở Trung Quốc trên Ngân hàng GenBank. Thu thập thơng tin   về các bộ mã phổ biến được ưu tiên sử dụng trong bộ máy sản xuất protein của thực vật. Lựa  chọn các bộ mã ưu tiên tương thích để cải biến trình tự gen HA sao cho phù hợp với hệ biểu hiện  thực vật, đồng thời bổ sung trình tự nhận biết của một số enzyme cắt hạn chế cho mục đích thiết   kế vector chuyển gen. Đặt hàng cơng ty để tổng hợp nhân tạo đoạn gen HA đã đổi mã Thành phần phản ứng PCR bao gồm : DNA khn 50 ng, Mồi xi 0,1 µM, Mồi ngược  0,1 µM, dNTPs 0,2 µM, Pfu DNA polymerase 2,5 U, 10X  đệm Pfu DNA polymerase 5 µl, Tổng  thể tích 50 µl. Chu trình nhiệt như sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại các bước 94oC/30 giây,  58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/5 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose  0,8% sau đó đưuọc tinh sahj và xử  lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế  để  ghép nối   vào plasmid pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP và biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc  nhiệt của Sambrook và cộng sự (2012) Khuẩn lạc mang vector tái tổ  hợp đượ c chọn lọc trên môi trườ ng LB đặc bổ  sung kháng  sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ  hợp đượ c tách chiết từ  các khuẩn lạc cho kết quả  PCR dương tính (Colony­PCR) được giải trình tự, sử dụng các cặp mồi như trình bày trong  Bảng 2.1 và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7  (DNAstarinc, Madison, WI, USA) 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA ph ục vụ chuy ển gen Vector   nhân   dòng   pRTRA   tái   tổ   hợp   mang   gen   mã   hóa   kháng   HA   mono_ELP,   HA  trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimeric­IgFMc và vector chuyển gen thực vật pCB301 cùng  được phân cắt bằng enzyme HindIII. Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao pCB301 35S­HA   mono_ELP, pCB301 35S­HA trimeric_ELP, pCB301 35S­HA trimeric – KDE và pCB301 35S­ HA trimeric_ELP–KDE và được ghép nối vào khung vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và   được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook  và  cs., 2012). Việc chọn các dịng khuẩn lạc mang vector tái tổ  hợp được thực hiện trên mơi  trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản  ứng Colony­PCR. Các vector tái tổ  hợp mang gen đích pCB301 35S­HA mono_ELP, pCB301 35S­HA trimeric_ELP, pCB301 35S­ HA   trimeric   –   KDE     pCB301   35S­HA   trimeric_ELP–KDE,     tách   chiết   từ     dịng  khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản  ứng cắt với enzyme giới hạn  HindIII và NcoI.  Các vector chuyển gen  sau đó được biến nạp vào chủng  A. tumefaciens  C58C1 bằng phương  pháp xung điện. Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid đượ c tinh sạch theo ph ương pháp   Sambrook và cộng sự  (2012). Sử  dụng bộ  kít do hãng Fermentas cung cấp để  tinh sạch  plasmid. Phương pháp xử lý AND bằng enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được  thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bọ Kit sử dụng enzyme 2.2.3  Các phương pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá   mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá   C h u ẩ n   b ị  d ị c h   k h u ẩ n Các dịng khuẩn lạc của vi khuẩn  Agrobacterium tumefaciens  C58C1 mang vector đích  chứa đoạn gen mã hóa protein  HA và Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector chứa gen mã  hóa protein HcPro PRSV cũng được ni trong 5 ml mơi trường YEB có bổ sung 50 µg/ml Rif và  100 µg/ml Spectinomycin (Spec) qua đêm. Sau đó 1 ml dịch ni được ni tiếp trong 50 ml YEB   chứa 50 µg/ml Rif và 100µg/ml Spec qua đêm. Tồn bộ dịch ni này được dùng để ni chuyển   tiếp trong 500 ml YEB bổ sung 50 µg/ml Rif và 100 µg/ml Spec qua đêm. Khuẩn được thu nhận   bằng cách ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Cặn khuẩn của 2 chủng được hịa tan trong đệm  MES (10 mM MgCl2; 10 mM MES; pH 5,6) tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có   thể dùng riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm.     P h n g   p h p   x â m   n h i ễ m   k h u ẩ n   v o   c â y   t h u ố c   l Cây Nicotiana benthamiana từ  4­8 tuần tuổi được dùng để  biến nạp. Trước khi biến nạp, bọc  giấy quanh bầu đất sau đó mới úp ngược cây xuống. Tồn bộ lá cây bị nhấn dìm trong bình chứa   vi khuẩn bên trong bình hút chân khơng. Hút chân khơng ở 27 inches Hg, 2 phút. Xả khơng khí ra  từ từ, mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục ni và chăm sóc trong buồng sinh  trưởng có điều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 ­ 70%.   2.2.3.3. Tách chiết protein tổng số Protein tổng số  từ  mẫu lá được tách bằng dịch chiết: PBS (Phosphate­buffered saline) 0 ,05%  Tween theo tỉ lệ 1:2 (Trọng lượng mẫu lá ­ g) :  Thể tích dịch chiết ­ ml) và bảo quản ­20oC. Hàm  lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford năm (1976)   với đường chuẩn được dựng bằng BSA (Bovine Serum Albumin) 3.1.5. Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric­IgMFc 3.1.5.1. Tạo vector tách dịng mang gen mã hóa protein HA trimeric­IgMFc Thiết kế  vector tách dịng pRTRA_35S_SP_His_  HA trimeric­IgMFc.  Xử  lý đồng thời  đoạn  gen  HA  trimeric­IgMFc     khuếch  đại    vector   pRTRA _35S_SP_His_  HA   trimeric­ IgMFc bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI. Gen HA đã xử lý enzyme và đoạn khung vector   sau khi loại bỏ  gen mã hóa kháng ngun H5 (khoảng 1,5 kb) cịn lại có chiều dài gần 4,3   kb được thu nhận và tinh sạch (Hình 3.10 A, B) phục vụ cho phản  ứng n ối ghép bằng T4­ DNA ligase để tạo vector tái tổ hợp pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric­IgMFc. Kết quả điện  di sản phẩm cắt cho 2 băng vạch khoảng 1,5 kb và 4,3 kb theo đúng tính tốn lý thuyết   (Hình 3.10.D). Như  vậy đã thiết kế  thành cơng vector  pRTRA_35S_SP_His_  HA trimeric­ IgMFc Hình 3.10.  Kết quả  thiết kế  vector pRTRA_35S_SP_His_  HA trimeric­IgMFc  xử  lý vector  bằng BamHI và PspOMI B): sản phẩm tinh sạch đoạn gen HA (1) và khung vector  (2) sau  khi đã xử lý bằng BamHI và PspOMI (C): colony­PCR chọn lọc các khuẩn lạc mang plasmid  tái tổ hợp (D): cắt kiểm tra vector bằng BamHI và PspOMI 3.1.5.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_SP_His_HA trimeric­IgMFc  Kết quả  điện di cho thấy,  với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm   kích  thước khoảng 5,5 kb theo đúng tính tốn lý thuyết (Hình 3.11.A.1); trong khi đó sản phẩm cắt  vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc cho 2 vạch băng: 1 vạch có kích thước gần  3,2 kb tương  ứng với cassette   35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc, vạch băng cịn lại có kích  thước gần 2,7 kb là đoạn khung vector cịn lại (Hình 3.11.A.2). Các phân đoạn DNA có kích  thước 5,5 kb và 3,2 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép   tạo vector chuyển gen  CB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc. Vector tái tổ  hợp này được  kiểm chứng bằng xử  lý enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.11. B). Đồng thời để  chọn được   vector chứa gen mã hóa protein HA­pII­IgMFc có chiều biểu hiện ngược chiều gen kháng   kháng sinh, chúng tơi đã cắt kiểm tra bằng enzyme   NcoI (Hình 3.11.C). Các kết quả  trên đã  chứng minh vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc đã được thiết kế thành cơng 33 Hình 3. 11.  Kết quả  thiết kế  vector pCB301 _35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc  (A): xử  lý  vector pCB301­Kan (1) và  RTRA_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc  (2) bằng HindIIIB): Cắt  kiểm tra vector CB301_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc bằng HindIII (C): Cắt kiểm tra vector  pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc bằng NcoI.  3.2. Tối ưu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp 3.2.1. Tối ưu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp 3.2.1.1. Anh h ̉ ưởng của vector hỗ trợ Để đánh giá mức độ hoạt động của vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp HA và   vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein HcPro_PRSV   ức chế bất hoạt gen hoạt động dưới sự  kiểm sốt của promotor CaMV35S, hai thí nghiệm khác nhau được thực hiện đồng thời sử dụng   chủng  Agrobacterium tumefaciens  mang   vector hỗ  trợ    trên.  Ở  thí nghiệm đầu tiên chủng vi   khuẩn mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA được ni đến khi nồng độ khuẩn OD600 đạt  0,5 và được xâm nhiễm vào cây thuốc lá (4­6 tuần tuổi) bằng phương pháp hút chân khơng. Ở thí   nghiệm thứ 2 chủng vi khuẩn mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA được ni đến khi nồng   độ  khuẩn OD600  đạt 0,5 và được xâm nhiễm vào cây (4­6 tuần tuổi) cùng với vector hỗ  trợ  pIBT/HC­Pro PRSV bằng phương pháp hút chân khơng. Mẫu lá sẽ  được thu sau 6 ngày xâm  nhiễm   để   tách   protein.  Mức độ  biểu hiện của HA    khơng   có   vector   hỗ  trợ và có vector hỗ trợ được  đánh   giá     phương  pháp lai miễn dịch. Kết quả  thể hiện ở Hình 3.12 Hình 3.12. Kết quả đánh giá biểu hiện kháng ngun HA  (A): Dịch chiết protein  khi khơng sử dụng vector hỗ  trợ  ; (B): Dịch chiết protein khi sử dụng   vector hỗ trợ HcPro PRSV.  3.2.1.2. Kết quả tối ưu quy trình biểu hiện tạm thời kháng ngun HA trên cây thuốc lá Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp nói chung và kháng ngun HA nói riêng ở thực vật  bằng phương pháp biểu hiện tậm thời khi sử dụng máy hút chân khơng chưa từng được tiến hành  ở Việt Nam. Mặc dù quy trình thực hiện đơn giản nhưng có nhiều yếu tố  ảnh hưởng đến khả  năng biểu hiện của protein tái tổ hợp như: Nồng độ chất dẵn dụ Acetone syringone (AS), nồng   độ vi khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí lá xâm nhiễm, thời gian thu mẫu lá. Vì vậy, việc tiến hành xây   dựng một quy trình chuẩn cho biểu hiện protein tái tổ hợp là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này,  chúng tơi tiến hành tối ưu bốn yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện tạm thời HA trong điều kiện có   sự hỗ  trợ  của protein HC­pro là: Nồng độ  chất dẫn dụ  acetone syringone (AS), nồng độ  khuẩn   cho xâm nhiễm, vị trí lá xâm nhiễm và thời gian thu mẫu. Kết quả biểu hiện của HA tại các điều  kiện khác nhau được đánh giá bằng lai miễn dịch (Hình 3.13) và phân tích bằng phần mềm  34 ImageJ. Số liệu được xử lý trên Excel và ảnh hưởng của các yếu tố đến biểu hiện của protein  HA được đánh giá bằng phần mềm INOVA.  Hình 3.13. Kết quả biểu hiện protein HA tại các điều kiện thí nghiệm khác nhau M: Marker; 1,2,3,4,5,6,7,8,9: Dịch chiết protein từ  lá biểu hiện protein tại các cơng thức thí   nghiệm   L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9;   10,11,12,13   lần   lượt   là:  50,100,150,200   ng   ScFv­ cmyc;14: Đối chứng âm là dịch chiết protein từ cây hút chân khơng với đệm MES 3.2.1.3. Tối ưu nồng độ PEG cho tinh sạch protein HA có gắn đi ELP Kháng ngun tái tổ hợp cần được tinh sạch cho nghiên cứu đặc tính kháng ngun, khả  năng gây miễn dịch động vật Trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra  phương pháp đơn giản  để  tinh sạch protein tái tổ  hợp dựa trên sự  gắn đuôi ELP. Sự  chuyển pha nghịch đảo của   protein gắn ELP phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ muối. Sự tăng nồng độ muối và nhiệt độ  dẫn đến sự hình thành các protein khơng tan, những phân tử protein này sẽ được tách ra khỏi  dung dịch bằng ly tâm   nhiệt độ  nhất định. Protein gắn ELP khơng tan sẽ  được hịa tan lại  bằng đệm lạnh nồng độ  ion thấp. Meyer và cộng sự  đã quan sát thấy ngun nhân gây ra sự  chuyển pha nghịch đảo là do sự  hình thành các khối kết tụ  kích thước nhỏ  của protein gắn   ELP. Những khối kết tụ  này có thể  được gắn trên màng. Đây là cơ  sở  cho thí nghiệm tinh  sạch HA mono_ELP và HA trimeric_ ELP bằng màng lọc dựa trên sự chuyển pha nghịch đảo  (mITC). Tuy nhiên, trong q trình tinh sạch qua màng ES 0,2 µm khi cho dịch protein trong   muối NaCl 2M   nhiệt độ  thường dịch khơng đi được qua màng. Ngun nhân là do có q   nhiều protein tạp chưa bị loại ở các bước li tâm và qua màng PES 0,22 µm. Vì vậy, để loại bớt   protein tạp chúng tơi đã bổ  sung PEG 8000 vào dịch protein sau khi li tâm. Nồng độ  PEG đã   được tối  ưu nhằm thu lại được nhiều HA nhất và ít tạp nhất. Kết quả  tối  ưu nồng độ  PEG  được thể hiện qua (Hình 3.14) Hình 3.14. Kết quả tối ưu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _ ELP (A): được đánh giá bằng SDS­PAGE; (B): lai miễn dịch  3.2.2. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA 3.2.2.1. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA trimeric bằng IMAC 35 Protein tái tổ hợp HA sau khi biểu hiện trên lá thuốc lá được tiến hành tách chiết và tinh  sạch để  sử  dụng cho thí nghiệm gây đáp  ứng miễn dịch trên chuột. Trong nghiên cứu này  chúng tơi có sử dụng phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực. Nhằm loại bỏ sự ảnh   hưởng của các protein khơng đặc hiệu đến hoạt tính sinh học của kháng ngun đích HA. Đây  là phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với His­tag. Phương pháp này  dựa trên xu hướng tự nhiên của histidine tạo thành một phức hợp với các kim loại hóa trị II (ví  dụ như niken) ở pH trung tính. Sự biểu hiện kháng ngun HA trimeric và kết  quả tinh sạch   đã được kiểm tra bằng điện di SDS­PAGE và phương pháp Western­blot (Hình 3.15.A,B) Hình 3. 15. Kết quả biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính protein HA trimeric (A):  Kết quả biểu hiện HA trimeric được đánh giá bằng lai miễn dịch. WT: Mẫu protein tách  chiết từ cây khơng chuyển gen được sử dụng làm đối chứng âm (B): Kết quả tinh sạch protein HA trimeric được đánh giá bằng điện di SDS­page và lai miễn  dịch. M: marker, RE: Dịch thơ, FL: Dịch qua cột, W: Dịch rửa c ột, P: D ịch thu protein HA   trimeric tinh sạch 3.2.2.2. Kết quả biểu hiện và tinh sạch kháng ngun HA trimeric­IgMFc bằng IMAC Kết quả  biểu hiện đúng protein HA trimeric IgM­Fc được đánh giá bằng Western blot  bằng Coomassie­blue (Hình 3.16) cho thấy có vạch băng có kích thước khoảng 1 00 kDa  và 33  kDa tương ứng với HA trimeric dung hợp IgM­Fc.  Hình 3.16. Kết quả western blot chứng tỏ sự biểu hiện của kháng nguyên HA dung hợp IgM­Fc và   một trimeric dung hợp IgM­Fc sử dụng kháng thể kháng c­myc. M: Marker protein 10­170 kDa; 1:   Dịch chiết protein chứa kháng nguyên HA dung hợp IgM­Fc; (2): Dịch chiết protein chứa một   trimeric Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng điện di SDS­PAGE và lai miễn dịch (Hình 3.17)  cho thấy HA trimeric­IgMFc chỉ xuất hiện một băng mầu nâu duy nhất có kích thước khoảng   100 kDa . Điều này chứng tỏ HApII trimeric­IgMFc đã tinh sạch bàng phương pháp sắc ký ion  cố định kim loại với hiệu suất thu hồi 72,6% và độ tinh sạch là 89,6% 36 Hình 3.17. Kết quả tinh sạch HA trimeric­IgMFc bằng sắc ký ái lực (IMAC) 3.2.2.3. Kết quả tinh sạch proten HA mono_ELP bằng mITC Kết quả cho thấy lượng protein giảm đi rất nhiều ngay khi cho nồng độ PEG 2%,và nồng  độ PEG 10% là protein mất đi nhiều nhất bao gồm cả protein HA và protein tạp. Tuy nhiên, kết   quả lai miễn dịch lại ở hai nồng độ PEG 2%,và nồng độ PEG 10%  cho thấy gần như khơng cịn  protein tạp. Phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J cho thấy ở nồng độ 2% PEG 8000 là có   băng đậm nhất (Hình 3.18) Hình 3.18. Kết quả tối ưu nồng độ PEG cho tinh sạch protein HA trimeric _ ELP được đánh  giá bằng SDS­PAGE (A) và lai miễn dịch (B) 3.3.2.1. Kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng mITC Kết quả kiểm tra (Hình 3.19.A) cho thấy ở giếng số 1 (Dịch chiết thơ trước xử lý) xuất   hiện nhiều băng protein và trong đó có một băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa.  Ở  giếng số  2 không xuất hiện băng vạch (dịch chiết cây không chuyển gen), giếng số  3 là   đối chứng dương ScFv­Cmyc. Điều này cho thấy protein HA mono đã biểu hiện thành công  trên mô lá cây thuốc lá  Kết quả  chạy điện di các mẫu sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch  chiết thô trước xử  lý, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch thơ qua màng và dịch tinh sạch  protein HA tách rửa khỏi màng bằng nước lạnh cho thấy protein tái tổ  hợp có gắn đi ELP  đã được giữ lại một cách chọn lọc trên màng trong khi các protein khác đi qua khỏi màng thể  hiện  ở một băng vạch duy nhất tương  ứng với kích thước chính xác của HA mono_ELP, và  các vạch băng protein giống nhau giữa dịch thơ và dịch đi qua màng trừ  băng tương  ứng với   kích thước với protein tái tổ hợp gắn ELP. Gel nhuộm Coomassie blue cũng cho thấy protein   được tinh sạch bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch và nồng độ cao (Hình 3.19.B). Mức   độ  tinh sạch, kích thước protein  được đánh giá bằng SDS­PAGE và lai miễn dịch (Hình  3.19) 37 Hình 3.19. Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng SDS­PAGE và lai miễn  dịch (A). 1: Dịch chiết thơ chứa protein HA mono_ELP, 2: dịch chiết từ cây khơng chuyển gen, 3:  đối chứng dương ScFv­Cmyc; M:Marker (B).1,4: Dịch chiết thơ chứa protein HA mono_ELP trước xử lý; 2,3: Dịch chiết từ cây khơng  chuyển gen; 6,7: Dịch rửa màng sau khi khi đưa dịch thơ qua màng 5,8;  Dịch tách rửa HA mono_ELP khỏi màng bằng nước lạnh 3.2.2.4. Kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng mITC  Kết quả kiểm tra (Hình 3.22. A) cho thấy  ở giếng số 1và 2 (Dịch chiết thơ trước xử  lý)  xuất hiện nhiều băng protein và trong đó có hai băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa   và 72 kDa. Điều này cho thấy protein HA trimeric_ELP đã biểu hiện thành cơng trên mơ lá cây  thuốc lá. Kết quả chạy điện di các mẫu sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thơ trước xử  lý, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch thơ qua màng và dịch tinh sạch protein HA tách rửa khỏi   màng bằng nước lạnh cho thấy protein tái tổ hợp có gắn đi ELP đã được giữ  lại một cách   chọn lọc trên màng trong khi các protein khác đi qua khỏi màng thể hiện ở một băng vạch duy   nhất tương ứng với kích thước chính xác của HA trimeric_ELP khoảng 108 kDa (Hình 3.20.B)  và các vạch băng protein giống nhau giữa dịch thơ và dịch đi qua màng trừ băng tương ứng kích  thước với protein tái tổ hợp gắn ELP. Gel nhuộm Coomassie blue cũng cho thấy protein được   tinh sạch bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch và nồng độ cao (Hình 3.20.B). Mức độ tinh  sạch, kích thước protein được đánh giá bằng SDS­PAGE và lai miễn dịch được thể  hiện trên   (Hình 3.20).  Hình 3.20. Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng SDS­PAGE và lai  miễn dịch (A). M:Marker; 1, 2:  Dịch chiết thơ chứa protein  HA trimeric_ELP,  (B). M: Marker; 1: Dịch  chiết thơ chứa protein HA trimeric_ELP trước khi tinh sạch; 2: Dịch đối chứng dương ScFv­ Cmyc; 3: Dịch rửa màng sau khi khi đưa dịch thơ qua màng; 4:  Dịch tách rửa HA trimeric_ELP  khỏi màng bằng nước lạnh 38 3.2.3   Kết     đánh   giá   khả     hình   thành   oligomer     protein   HA   trimeric     phản   ứng liên kết ngang B A Kết     lai   miễn   dịch   cho  thấy protein HA trimeric và HA  trimeric_ELP tinh sạch trong điều kiện biến tính khơng xử  lý BS3 chỉ  cho một băng duy nhất   tương ứng kích thước monomer của HA trimeric là khoảng 72 kDa và HA trimeric_ ELP  là 108   kDa   Trong     đó,  protein HA trimeric và HA trimeric_ELP khi được  xử lý BS3 đã hình thành  cấu   trúc   trimer   tương   ứng  với  kích thước   khoảng  hơn 200 kDa và hơn 300 kDa.  (Hình 3.21).  Hình 3.21. Kết quả kiểm tra khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric (A) và  HA trimeric_ELP (B) bằng phản ứng crosslinking sử dụng BS3 và lai miễn dịch +BS3: Protein được xử lý với BS3; ­BS3: Protein khơng được xử lý với BS3 3.3. Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng ngun HA và   phức hệ HA trimeric:ND  3.3.1. Kết quả tạo phức hệ kháng ngun HA trimeric:ND 3.3.1.1. Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt ND Kết quả phân tích phân bố kích thước và ảnh TEM của hạt NDs được thể hiện ở Hình  3.24. Kết quả  cho thấy rằng hạt NDs trong H 2O có kích thước khá đều và khơng khác nhau  nhiều dao động 5­50nm, trong khi trong PBS 1X các hạt NDs có xu hướng kết tủa lại với nhau   thành các hạt có kích thước lên đến hơn 2000 và độ  đồng đều kém (Hình 3.22.A).  Ảnh TEM   (Hình 3.22.B) chụp NDs trong H2O cho thấy các hạt nano gắn kết với nhau và có bề  mặt  khơng trịn đều.   Hình 3.22. Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt NDs (A): Sự phân bố kích thước hạt NDs trong H2O và 1X PBS; (B): Ảnh TEM của ND trong H2O 3.3.1.2. Kết quả tổng hợp phức hệ HA trimeric:ND Phức hệ HA trimeric­ND được tạo thành bằng cách siêu âm hỗn hợp hạt NDs với protein   HA trimeric trong 1 giờ. Mẫu được hịa trong H2O deion và PBS1X để  đo kích thước hạt và  zeta   potential.  Kết     được  thể  hiện   Hình  3.23 39 Hình 3.23. Kết quả tổng hợp và tính chất vật lý của HA trimeric­ND ( A): Kích thước của hạt NDs trước và sau khi gắn HA trimeric trong H2O deion  (B): PBS1X Zeta potential của HA trimeric­ND; (C):  ND 3.3.1.3. Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn protein HA trimeric và hạt ND Một trong những  ứng dụng quan trọng của vật liệu nano kim c ương là cố  định protein   lên trên bề mặt giúp tăng độ  bền và hoạt tính của protein. Trong nghiên cứu này, protein HA  trimeric được gắn lên tồn bộ  bề mặt hạt ND tạo cấu trúc tương tự  hạt virus nhằm tăng độ  bền của kháng ngun tinh sạch cũng như  tăng hoạt tính sinh học của kháng ngun. Bởi vì,  khả  năng kích thích kháng thể    vật chủ  của một kháng ngun phụ  thuộc nhiều vào đặc  điểm cấu trúc của kháng ngun. Chính vì vậy, việc gắn kháng ngun HA lên hạt ND sẽ giúp  tăng khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch ở vật chủ. Bên cạnh đó, hiệu quả tăng độ bền cho   protein tinh sạch cũng là một  ưu điểm của ND. Tuy nhiên, nồng độ, tỷ  lệ  hạt ND trộn với   kháng ngun để hiệu quả bám của kháng ngun và hoạt tính sinh học của HA cao nhất cần   được đánh giá. Các tỷ  lệ  trộn protein với hạt ND bao gồm 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 (g   protein : g hạt) đã được thử nghiệm. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.24 Hình 3.24. Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric và hạt ND được đánh giá bằng lai  miễn dịch với kháng thể kháng cmyc (A) và phản  ứng ngưng kết hồng cầu (B). 5µg HA trimeric tinh sạch trộn ND theo tỷ lệ khác   nhau( 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 , w/w). Sản phẩm được rửa bằng nước và pha trong   PBS cho lai miễn dịch và phản ứng ngưng kết hồng cầu 3.3.2. Đánh giá khả năng ngưng kết hồng cầu của protein tinh s ạch  HA trimeric­IgMFc Hoạt tính sinh học của kháng ngun tinh sạch HA trimeric­IgMFc và trimeric­IgMFc   được xác định bằng phản  ứng ngưng kết h ồng c ầu. Ph ản  ứng này dựa trên sự  tươ ng tác   của protein HA với các thụ thể có mặt trên tế  bào hồng cầu. Q trình tươ ng tác tạo thành  một mạng lưới, gây ngưng kết hồng cầu. N ếu khơng có q trình tươ ng tác giữa protein  40 với thụ thể, hồng cầu s ẽ khơng bị ngưng kết, các tế bào hồng cầu sẽ bị kéo xuống và hình   thành giọt máu ở đáy giếng chữ V (Hình 3.25) Hình 3.25. Kết quả phản ứng gây ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên trimeric­ IgMFc và HA trimeric­IgMFc. PBS được sử dụng làm đối chứng âm. Virus bất hoạt  chủng H5N1/Vietnam/2004 được sử dụng làm đối chứng dương 3.3.3. Đánh giá khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA mono ELP và   HA trimeric ELP K ế t qu ả  ngây ng ng k ế t h ng c ầ u cho th ấy  protein HA trimeric_ELP và HA trimeric  có khả năng gây ngưng kết hồng cầu với 5 µg protein, trong khi đó PBS dịch chiết protein từ cây  khơng chuyển gen và HA mono_ELP tinh sạch khơng có khả năng gây ngưng kết hồng cầu (Hình  3.26) Hình 3.26. Kết quả ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin HA Đối chứng dương virus bất hoạt H5N1­2004; protein HA trimeric_ELP; protein HA trimeric;   protein HA mono_ELP; WT­ cây khơng chuyển gen; PBS­ đối chứng âm 3.4. Đánh giá khả  năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng ngun HA và phức hệ  HA trimeric:ND trên động vật  3.4.1. Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Trong thí nghiệm trên chuột, tính sinh miễn dịch của kháng ngun HA trimeric_ELP, HA   trimeric và  HA trimeric trộn hạt ND tỷ lệ 1:12 được đánh giá. Các lơ chuột được  tiêm dưới da ba  lần, mỗi lần tiêm cách nhau 14 ngày, mỗi con khoảng 200 µl. Huyết thanh từ máu chuột được thu  vào ngày thứ 7 sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3, được sử dụng như kháng thể 1cho việc tìm kháng thể  đặc hiệu bằng ELISA và lai miễn dịch.  Sơ đồ thí  nghiệm được thể hiện ở (Hình 3.27).  41 Hình 3.27. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột Kết quả  (Hình 3.28 ) cho thấy HA trimeric và HA trimeric:ND đều kích thích sinh kháng thể đặc  hiệu với H7 sau lần tiêm thứ 2 và thứ  3 thể hiện ở vạch màu nâu tương đương kích thước H7   khoảng hơn 60 kDa giống đối chứng dương trong khi đối chứng âm khơng xuất hiện băng vạch  Hình 3.28.  Kết quả kiểm tra kháng thể IgG đặc hiệu với H7 bằng lai miễn dịch Kết quả cho thấy đáp ứng kháng thể được tìm thấy ở tất cả các con chuột khi tiêm HA trimeric   và HA trimeric:ND thể hiện ở sự sai khác giá trị ELISA giữa các nhóm này với  nhóm đối chứng   tiêm PBS:ND đều có ý nghĩa thống kê (P