Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Luận án nghiên cứu với mục tiêu tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:  1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Cơng nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hồng Hà  Viện Cơng nghệ sinh học học Hà Nội, 2019 Luận án hồn thành Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trung Nam, Viện Công nghệ sinh học PGS TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án phiên thức Họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: phút, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trang web Bộ giáo dục đào tạo (website: http://luanvan.moet.gov.vn) - Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người và gia cầm , do virus cúm A  subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1  thể độc lực cao (HPAI H5N1) thường gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang  người nên ln là mối nguy hiểm tiềm  ẩn trong chăn ni gia cầm và sức khỏe cộng  đồng. Biện pháp phịng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả  là tiêm phịng   vaccine Ở  Việt Nam, cơng tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ  năm 2003  (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng   virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược có nguồn gốc từ nước ngồi. Sự  phụ  thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến cơng tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt   Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn. Để  chủ  động đối phó với những diễn  biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần xây dựng   và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để   chủ động  tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả  bảo hộ cao với những chủng virus đang lưu   hành trong nước.  Trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lưu hành ở   Việt Nam, clade  1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tương đồng kháng ngun và đặc tính di truyền với nhiều   clade virus gây dịch ở Việt Nam nên đáp ứng u cầu của chủng dự tuyển vaccine phịng   chống cúm A/H5N1.  Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề  tài: “Nghiên cứu   tạo chủng virus tái tổ  hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ  thuật di   truyền ngược” Mục tiêu nghiên cứu Tạo được chủng virus cúm tái tổ  hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng  chống   bệnh   cúm   gia   cầm     virus   độc   lực   cao   A/H5N1   clade   1.1     A/H5N1   clade   2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các   protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dịng riêng rẽ từng gen vào plasmid   pHW2000 2. Thiết kế và tách dịng hai gen H5 HA (đã được loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí   vùng   độc     tránh   lại   độc)     hai   gen   N1   NA     chủng  A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1)   (clade   1.1)     A/duck/Viet   Nam/HT­ 02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000 3. Chuyển nhiễm hệ  thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen   khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade  2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg­A/H5N1 clade 1.1 và   rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c  Phân lập và  tuyển chọn chủng virus  rg­A/H5N1  clade  1.1   rg­A/H5N1  clade  2.3.2.1c đáp ứng u cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân  lên trong trứng gà sạch có phơi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền.  5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu  giá HI) của hai chủng virus  ứng viên vaccine rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1   clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi Đóng góp mới của luận án Là cơng trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ  cơng nghệ  di   truyền ngược để  tái tạo hiệu quả  chủng virus  ứng viên vaccine cúm A Trong  tương lai, trên cơ sở đã nắm vững qui trình cơng nghệ tạo chủng virus gốc bằng di   truyền ngược, có thể  kiểm sốt kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 ở  gia cầm bằng   ứng dụng cơng nghệ di truyền ngược  để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus  ứng  viên  cho  sản xuất vaccine có hiệu quả  phịng vệ  với các biến chủng virus mới   xuất hiện.   Đã tối  ưu một số yếu tố  cơng nghệ  trong qui trình chuyển nhiễm hệ  thống 6 + 2   plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp Tạo hai chủng virus  ứng viên  vaccine cúm  A/H5N1 (rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­  A/H5N1 clade 2.3.2.1c)  có khả  năng thích  ứng nhân  lên với hiệu suất cao trong  trứng gà sạch có phơi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 ­ P5), có tính ổn định di  truyền và kích thích sinh đáp  ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể  ở  gà sạch 3  ngày tuổi (100% gà tiêm kháng ngun virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2  ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phịng) Cấu trúc luận án Luận án gồm 150 trang, được chia thành các phần:  ­ Mở đầu: 4 trang ­ Chương 1. Tổng quan tài liệu: 34 trang ­ Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 25 trang ­ Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang ­ Chương 4. Bàn luận kết quả: 14 trang ­ Kết luận và kiến nghị: 1 trang ­ Các cơng trình đã cơng bố của tác giả: 1 trang.  ­ Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh: 5 trang ­ Tài liệu tham khảo: 16 trang Luận án có 20 bảng số liệu, 36 hình và 172 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt và   tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N1 Virus cúm A thuộc họ  Orthomyxoviridae, có genome RNA sợi đơn, âm (ss(­)RNA),  gồm 8 phân đoạn genome, trong đó 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa   các protein tạo bộ khung và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên (HA, NA) định   vị trên bề mặt virion.  Nhóm virus cúm A được phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên kháng nguyên  HA (Hemagglutinin) và NA (Neuraminidase) với 18 subtype HA (H1­ H18) và 11 subtype   NA (N1 ­ N11), có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm subtype khác nhau về độc tính   và khả  năng gây bệnh. Trong số các subtype virus cúm A, subtype H5N1 đã được chứng   minh có khả  năng lây nhiễm từ  động vật sang người. Các chủng virus cúm A/H5N1 độc  lực cao ­ Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1­ có thể  lây nhiễm nhanh trên  nhiều loại gia cầm, động vật có vú và người với khả  năng đột biến cao và tái tổ  hợp di   truyền lớn.  Protein HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân   (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2   (27 kDa) nối với nhau bằng một đoạn oligopeptide ngắn giàu các amino acid kiềm arginine   (R) và lysine (K) ở vị trí amino acid 338 – 345/346. Đặc điểm của vị trí giàu các amino acid  kiềm giữa HA1 và HA2 quy định tính độc của virus nên được gọi là “vùng độc”: Ở vị trí  vùng độc, các chủng virus A/H5N1 độc lực cao chứa một nhóm amino acid kiềm, trong khi   các chủng virus A/H5N1 độc lực thấp chỉ  chứa 1 amino acid kiềm arginin   hoặc lysine  (Suzuki et al., 2005).  Protein NA có hoạt tính enzyme Neuraminidase, xúc tác phản ứng cắt mối liên kết   glycoside giữa thụ thể chứa sialic acid trên bề mặt tế bào chủ và gai glycoprotein trên vỏ  virus, giúp virus xâm nhiễm vào tế bào chủ (Yano et al., 2008; da Silva et al., 2015).  1.2. Vaccine phịng chống cúm A/H5N1 ở gia cầm Vaccine cúm A cần được làm mới (thay đổi chủng giống) hàng năm để  chắc chắn  có hiệu lực phịng vệ với các chủng virus đang lưu hành hay mới xuất hiện. Đây là một  trong những trở ngại, thách thức và gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine, nhưng là cần   thiết để thích ứng với khả năng tiến hóa rất nhanh, dễ xuất hiện biến chủng do sự chuyển   dịch kháng ngun, đột biến và tái tổ hợp  gen xảy ra phổ biến ở virus cúm (Pronker et al.,  2012).  Hướng dẫn của WHO  cho  phát triển nhanh chủng virus vaccine vừa có đặc tính  kháng ngun (quy định bởi phân đoạn gen  HA  và  NA) giống các chủng virus đang lưu  hành, vừa có khả năng nhân lên tạo hạt virus với hiệu suất cao  là tái tạo chủng virus tái tổ  hợp làm  ứng viên vaccine có bộ  gen được lắp ráp nhân tạo theo cơng thức 6 + 2 (6 phân  đoạn gen  khung nguồn gốc   từ  virus  A/PR/8/1934(H1N1)  và  2  phân  đoạn  gen mã   hóa  protein kháng ngun ­ HA và NA ­ của virus hoang dại đang lưu hành).  1.3. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam Q trình hình thành các clade cúm HPAI H5N1 đã từng gây dịch   Việt Nam rất  phức tạp với các clade xuất hiện phổ biến như sau: ­ Giai đoạn năm 2003 đến 2006: Clade 1 và clade 2.3.2 xuất hiện và gây dịch trên  phạm vi tồn quốc.  ­ Giai đoạn năm 2007 đến 2013: Xuất hiện chủ  yếu các biến chủng thuộc   ba  clade:  1.1, 2.3.4 và 2.3.2.1. Trong đó: Clade 2.3.4 xuất hiện năm 2007 và gây dịch bệnh  trên gia cầm giai đoạn 2007 ­ 2010, từ năm 2011 đến 2013 khơng thấy xuất hiện; clade 1.1  phát sinh từ  clade 1, xuất hiện năm 2007 và gây bệnh chủ  yếu   các tỉnh phía Nam, từ  năm 2011 phân nhánh thành clade 1.1.1 và clade 1.1.2; clade 2.3.2 xuất hiện lần đầu năm  2005, từ  năm 2009 được phân nhánh thành clade 2.3.2.1, sau đó  tiếp tục phân thành các  nhánh 2.3.2.1 nhóm A (clade 2.3.2.1a), 2.3.2.1 nhóm B (clade 2.3.2.1b) và 2.3.2.1 nhóm C  (clade 2.3.2.1c). Trong số các clade thuộc nhánh 2.3.2.1, virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c  gây dịch trên diện rộng (từ Bắc vào Nam).  ­ Giai đoạn từ năm 2014 đến nay: Clade 2.3.2.1c tiếp tục lưu hành, clade 2.3.4 phân  nhánh thành clade 2.3.4.4 và clade 1.1 có nguy cơ  bùng phát trở  lại (Chu   et al., 2016,  Nguyen et al., 2017; Mellor et al., 2018).   1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu phịng chống virus cúm A Kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) được ứng dụng phổ biến trên thế giới  trong nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A từ các cDNA của virus đã được  tạo dịng vào plasmid. Ưu điểm của kỹ thuật là cho phép thao tác với genome virus ở mức   độ phân tử để tạo hạt virus mang đặc tính mong muốn (Chen et al., 2012; Palese & Shaw,  2007; Neumann et al., 2004).  Trong số các hệ thống di truyền ngược được ứng dụng hiệu quả  và đáp ứng mục  tiêu trong thời gian ngắn tạo chủng virus vaccine hiệu quả  là  hệ  thống  gồm 8 plasmid  pHW2000  mang PolI­PolII  của Hoffmann và đtg (2000)  Sự  có mặt của phức hợp PolI­ PolII trên cùng một plasmid cho phép sinh tổng hợp cả  mRNA của virus (nhờ PolII) và  vRNA (nhờ PolI) trong tế bào động vật từ cùng một phân đoạn cDNA của virus đã được  dịng hóa vào plasmid, cho phép hạt virus tái tổ hợp được tái tạo hiệu quả.  CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng NIBRG­14 Chủng NIBRG­14 do NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp là nguồn vật liệu cho  phân lập 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ  virus   A/PR/8/34 Plasmid và chủng khuẩn Plasmid   pHW2000     cung   cấp     Dr   Erich   Hoffmann     Dr   Robert   G   Webster (Bệnh viện Nhi St. Jude, Mỹ), là plasmid chứa phức hợp PolI­PolII hai chiều.  Chủng  E. coli  DH5α  [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi­1 relA1   lac   U169 ( 80 lacZM15)] của hãng Invitrogen (Mỹ) được dùng trong chọn dịng và nhân dịng  gen Cặp mồi sử dụng Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu cho nhân bản và xác định trình tự  8 phân  đoạn gen của virus cúm A được thiết kế theo Hoffmann và đtg (2001).  Tế bào  Tế bào 293T và tế bào MDCK được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture  Collection, Mỹ) Trứng gà sạch có phơi và gà sạch 3 ngày tuổi Trứng gà sạch có phơi 9 ­ 11 ngày tuổi và gà sạch 3 ngày tuổi được cung cấp bởi   Trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương (Viện Chăn ni), đã được kiểm định sạch   virus/kháng thể đặc hiệu với virus A/H5N1 và Newcastle 2.2. Địa điểm nghiên cứu Tất cả các thí nghiệm biến nạp và tái tạo virus A/H5N1 tái tổ hợp bằng di truyền   ngược, nhân giống virus, kiểm tra virus đều thực hiện trong phịng thí nghiệm an tồn  cấp 2+  của Viện Cơng nghệ  sinh học. Các thao tác tiến hành với virus (cấy truyền, thu   nhận, xác định sự  có mặt của virus  ) được thực hiện trong box cấy an tồn sinh học  cấp 2 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34  Tách chiết RNA tổng số  của chủng NIBRG­14 (mang 6 phân đoạn gen khung từ  virus A/PR/8/34 [PR8] bằng kit Tripure Isolation Reagent (Invitrogen, Mỹ). Nhân bản sáu   phân đoạn gen khung của virus PR8 từ các mẫu vRNA tổng số bằng phương pháp RT­ PCR hai bước để  chuyển hóa vRNA thành cDNA (bước 1) và PCR khuếch đại cDNA   (bước 2) theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001).  2.3.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c Hai gen HA và hai gen NA của hai clade virus (clade 1.1 và 2.3.2.1c) được thiết kế  có cấu trúc: Tương  ứng   hai đầu gen là hai đoạn nucleotide khơng mã hóa chứa điểm  bắt cặp đặc hiệu của mồi xi và mồi ngược trong phản  ứng PCR nhân gen; ở  giữa là   vùng mã hóa chứa trình tự nucleotide của gen H5 HA và gen N1 NA tương ứng. Đặc biệt,   để đảm bảo virus tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược là virus độc lực thấp, hai phân   đoạn gen H5 HA của hai clade virus đều được loại vùng độc (loại các nucleotide mã hóa  các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí giữa HA1 và HA2) và tránh lại độc  (Hình 2.1) Hình 2.1. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c  trước và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc 2.3.3  Ghép nối các phân đoạn gen của virus cúm A  vào plasmid pHW2000 tạo hệ  thống plasmid đơn gen 10 mẫu DNA plasmid của các dịng khuẩn lạc đã được chọn dịng (6 dịng dương   tính với plasmid tái tổ  hợp chứa các phân đoạn gen khung + 2 dịng dương tính với gen  kháng ngun H5 và N1 của clade 1.1 + 2 dịng mang gen kháng ngun H5 và N1 của   clade 2.3.2.1c) được tách và tinh sạch, sử  dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche,   Đức). Các plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn, thu nhận gen đích và ghép  nối gen vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001).  2.3.4. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái  tổ hợp rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c Thực hiện 2 cơng thức chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T: (i) 6 plasmid  mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng  A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng  ngun H5 và N1 từ  clalde 1.1; (ii) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ  chủng   A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng ngun H5 và N1 từ clalde 2.3.2.1c.  Xác định sự  có mặt của virus tái tổ  hợp trong dịch ni cấy bế  bào sau chuyển  nhiễm plasmid bằng kỹ  thuật RT­PCR một bước. Các mẫu có kết quả  RT­PCR dương   tính với sự có mặt của virus tái tổ hợp thế hệ P0 được thu nhận riêng rẽ và ghi ký hiệu   là virus rg­A/H5N1 clade 1.1 hoặc rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c (t ương ứng) 2.3.5. Nhân giống virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng   gà sạch có phơi Các mẫu virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c tái tổ  hợp được  cấy nhân giống trong trứng gà sạch có phơi 9 ­ 11 ngày tuổi. Ủ trứng trong tủ ấm ở 35°C,   độ  ẩm 60% trong 48h. Thu hoạch dịch niệu trong từng quả trứng (chứa virus tái tổ  hợp   thế hệ P1) riêng rẽ vào các ống vơ trùng. Xác định sự có mặt của virus rg­A/H5N1 clade   1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong dịch niệu trứng bằng các phương pháp: (i) Xác định  hiệu giá HA, (ii) xác định hiệu  ứng hủy hoại tế bào (CPE) và khả  năng tạo plaque trên   đĩa ni cấy tế  bào MDCK trong thí nghiệm plaque assay   theo hướng dẫn của WHO  (2011) 2.3.6. Phân lập chủng virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c  Chủng virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c được phân lập từ các   mẫu virus thế hệ P1 có kết quả kiểm tra hiệu giá HA và hiệu giá virus cao. Thí nghiệm phân   lập virus thực hiện theo hướng dẫn của WHO (2011).  2.3.7. Ni cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phơi và xác định tính  ổn định di truyền của chủng virus  Chủng virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế  hệ  P1 được cấy  truyền vào trứng gà sạch có phơi thêm 4 lần tiếp theo để thu nhận virus thế hệ từ P2 ­ P5.  Xác định hiệu giá HA, tính đầy đủ về di truyền (thể hiện ở sự có mặt của cả 8 phân đoạn   gen trong genome virus) và tính ổn định di truyền gen kháng ngun (thể hiện ở trình tự các   gen kháng ngun H5 HA và N1 NA khơng bị biến đổi) của các chủng virus thế hệ P5 2.3.8. Tạo vaccine trong phịng thí nghiệm từ virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1  clade 2.3.2.1c  Dịch niệu trứng thu hoạch từ thế hệ P2 đến P5 của hai chủng virus rg­A/H5N1 clade   1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của chủng virus  ứng viên vaccine (có khả  năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phơi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di   truyền gen kháng ngun H5 và N1) được làm đồng nhất đến cùng hiệu giá HA 1: 1024   Tiến hành vơ hoạt virus, tạo hai loại vaccine cúm vơ hoạt nhũ dầu từ hai chủng virus.   2.3.9. Xác định khả  năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể  đặc hiệu trên gà   sạch 3 ngày tuổi của virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c  Vaccine từ virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau khi đã kiểm tra  đảm bảo tính an tồn được tiêm phịng cho gà sạch 3 ngày tuổi theo 2 cơng thức: (i) Tiêm 1  liều 0,5 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi; (ii) tiêm 2 liều: Liều 1 tiêm 0,2 ml vaccine cho gà 3   ngày tuổi, tiêm nhắc lại (liều 2) 0,5 ml vaccine lúc gà 13 ngày tuổi. Mỗi cơng thức thí  nghiệm tiêm 20 gà. Xác định hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của  từng loại vaccine bằng phương pháp xác định hiệu giá HI (hiệu giá ức chế  khả  năng gây   ngưng kết hồng cầu) sau 2 tuần và 4 tuần tiêm phòng CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ  virus A/PR/8/34 vào plasmid  pHW2000 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng  NIBRG­14 mang sáu phân đoạn gen khung   nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Kiểm tra chất lượng các mẫu vRNA tổng số sau tách chiết bằng đo nồng độ và độ  tinh sạch trên máy Nanodrop cho kết quả  nồng độ  vRNA là 30,1 ­ 46,2 ng/µl và độ  tinh  sạch thể hiện ở tỷ số A260/280 khoảng 1,86 ­ 1,92.  3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dịng sáu phân đoạn gen khung  Sáu   phân   đoạn   gen   khung  (PB2,   PB1,   PA,   NP,   M     NS)  nguồn   gốc   từ   virus  A/PR/8/34 [PR8] được nhân bản bằng kỹ thuật RT­PCR hai bước theo phương pháp của  Hoffmann và đtg (2001): Bước 1 ­ chuyển hóa vRNA → cDNA; bước 2 ­ PCR khuếch đại  cDNA  →  dsDNA. Trong phản  ứng   bước 1, sử  dụng Reverse transcriptase v ới m ồi   Uni12 để chuyển toàn bộ các phân đoạn ssRNA sợi âm trong genome virus thành các phân  đoạn cDNA. Mồi Uni 12 có chiều dài 12 nucleotide (5’­AGCAAAAGCAGG­ 3’), bắt cặp   bổ  sung với 12 nucleotide bảo thủ có   tất cả  các đầu 3’ của các phân đoạn gen virus.  Các phân đoạn cDNA là sản phẩm của bước 1 được sử  dụng làm khn cho bước 2:   B Hình 3.10. Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­ A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h ni cấy trong trứng gà sạch có  phơi ĐC: Mẫu đối chứng A. Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg­A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1 B.  Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 Kết quả xác định khả năng thích ứng nhân lên của virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­ A/H5N1 clade 2.3.2.1c trên tế bào MDCK trình bày ở Hình 3.11. Các đĩa 6 giếng chứa tế  bào MDCK đã cấy truyền virus   các thời điểm sau 24h, 48h ni cấy được quan sát   dưới kính hiển vi soi ngược để  quan sát động thái phát triển của tế bào, và so sánh với  mẫu đối chứng (khơng lây nhiễm virus).  Kết quả  nhận được cho thấy: Sau 24h cấy truyền virus, bề  mặt  đáy   những  giếng nhất định của đĩa ni cấy của cả 2 loại virus đều xuất hiện các vùng mà ở đó các   tế bào bị phá hủy tạo hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE ­ Cytopathic effect), trong khi mẫu  đối chứng (tế bào MDCK khơng cấy truyền virus) khơng xuất hiện CPE (tế bào vẫn tiếp  tục biệt hóa, phân chia với trên 90% tế bào sống). Bên cạnh đó, diện tích của các vùng có  CPE ở khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm sau 48h cấy truyền cho thấy các vùng  này lan rộng hơn và số lượng CPE cũng nhiều hơn.  Các đĩa tế bào MDCK ni cấy virus khi được nhuộm với  gentian violet đã chỉ ra  sự sự xuất hiện các plaque (vết tan tế bào) (Hình 3.11).  A B C D E F Hình 3.11. Sự tạo thành CPE và plaque khi ni cấy virus trên tế bào MDCK A, B, C. Quan sát đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus để  phát hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE)   dưới kính hiển vi: Cơng thức đối chứng (tế bào MDCK khơng lây nhiễm virus) khơng xuất hiện CPE (A); tế  bào MDCK lây nhiễm virus rg­A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1 xuất hiện các CPE ở vị  trí các mũi tên màu đỏ  trong các giếng sau 24h (B) và 48h (C) lây nhiễm virus D, E, F. Nhuộm các đĩa tế bào MDCK với gentian violet để xác định sự tạo thành plaque: Cơng thức  đối chứng (đĩa tế  bào MDCK khơng lây nhiễm virus) khơng xuất hiện plaque (D); đĩa tế  bào MDCK cấy   truyền virus xuất hiện plaque sau 24h (E) và 48h (F) cấy truyền virus Kết quả nhận được của luận án phù hợp với nhiều cơng bố khoa học trên thế giới  khẳng định MDCK là loại tế bào rất thích hợp cho virus A/H5N1 lây nhiễm và nhân lên   theo phương thức nhiễm sinh sản (Chen et al., 2012; Milián et al., 2017) 3.6. Phân lập chủng virus và kiểm tra tính ổn định di truyền của giống Các chủng virus tái tổ  hợp (rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c) đã   phân lập được tiếp tục cấy truyền 4 lần liên tiếp vào trứng gà có phơi để  thu nhận các   thế hệ virus P2, P3, P4 và P5. Thu hoạch riêng rẽ các thế hệ virus trong dịch niệu trứng   để  kiểm tra: (i) Hiệu giá HA của mỗi thế  hệ  tương  ứng với từng chủng; (ii) RT­PCR   nhân bản 8 phân đoạn gen trong genome virus với mồi đặc hiệu của từng gen và xác định  trình tự nucleotide của hai gen kháng ngun (HA, NA) của virus thế hệ P5; (iii) kiểm tra   khả  năng thích  ứng nhân lên của các chủng virus   thế  hệ  P5 trên tế  bào MDCK. Kết   quả nhận được thống kê ở Bảng 3.5.  Kết quả xác định hiệu giá HA của các chủng virus trong dịch niệu trứng cho thấy:  Trong số các chủng virus, có 5/6 chủng (chủng 1.1, 2.1 và 3.3 của clade 1.1 + chủng 1.2 và  3.2 của clade 2.3.2.1c) có hiệu giá HA ln  ổn định   mức HA ≥ 1: 1024   các thế  hệ  virus từ P2 đến P5 (100% dịch niệu trứng có hiệu giá HA ≥ 1: 1024).  u cầu về chất lượng giống của chủng virus  ứng viên vaccine khơng những cần  thể  hiện   hiệu giá HA cao, mà cịn cần đảm bảo đặc điểm di truyền và biểu hiện  protein kháng ngun đúng đặc điểm di truyền qui định bởi gen kháng ngun ổn định qua  các thế  hệ  và ít bị  đột biến. Kết quả  kiểm tra nhanh sự  có mặt của đầy đủ  các phân   đoạn vRNA của các chủng virus  ở thế hệ P5 khẳng định thế  hệ P5 của các chủng virus  đều cho kết quả RT­PCR một bước dương tính với cả 8 phân đoạn vRNA Bảng   3.5   Kết     kiểm   tra   khả     thích   ứng   nhân   lên     trứng,   tế   bào   MDCK và tính ổn định di truyền của các chủng virus  Clade  Ký  Tỷ lệ  RT­ Trình  Trình  Khả năng tạo CPE trên MDCK hiệu  trứng  PCR  tự   tự   chủng  có  nhân  gen  gen  virus hiệu  8 gen    HA  NA  1.1 1.1 2.1 3.3 1.2 2.3.2.1c 2.2 3.2 giá  HA  ≥ 1:  1024  ở các  thế  hệ  (%)  P2 100 100 100 100 66,7 100 P3 100 100 100 100 100 100 P4 100 100 100 100 100 100 P5 100 100 100 100 66,7 100 + + + + + + KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ KTĐ + + + + + +  (+): Sản phẩm PCR dương tính với 8 phân đoạn gen có kích thước đúng theo tính tốn/ có khả năng tạo   plaque; (KTĐ): Trình tự gen khơng thay đổi Kết quả  xác định trình tự  gen H5 và N1 của 3 chủng virus thuộc clade 1.1 và 3   chủng thuộc clade 2.3.2.1c   thế  hệ  P5 chỉ  ra: Gen kháng nguyên HA và NA của các   chủng này khơng thay đổi so với các trình tự  gen HA và NA đã thiết kế  tương  ứng với   hai clade virus. Bên cạnh đó, vị  trí qui định độc lực của virus   trình tự  gen H5 của 3  chủng rg­A/H5N1 clade 1.1   amino acid 338­344 là QREGTR  ↓  G, và   3 chủng rg­ A/H5N1 clade 2.3.2.1c các amino acid 338­343 là QRETR ↓ G. Kết quả nhận được khẳng  định các chủng virus đã kiểm tra đặc điểm di truyền đều có tính kháng ngun giống   chủng gốc, chứa gen H5 mã hóa protein HA khơng chứa vùng độc và khơng bị lại độc.  Tiếp theo, để  kiểm tra tính thích nghi của các chủng virus khi nhân giống trên tế  bào MDCK, các chủng virus tái tổ hợp nguồn gốc di truyền ngược thu nhận từ dịch trứng   được cấy truyền trên các đĩa 6 giếng ni cấy tế bào MDCK. Kết quả nhận được (Bảng  3.5) khẳng định: Các mẫu nước trứng đã thu hoạch sau khi pha lỗng trong đệm PBS và   cấy truyền trên tế  bào MDCK đều cho kết quả  xuất hiện hiệu  ứng hủy hoại tế  bào   (CPE ­ cytopathic effect) do virus nhân lên và phá hủy tế bào MDCK. Hình ảnh thu thập  trong quá trình nghiên cứu thể hiện một phần ở Hình 3.12.  A B Hình 3.12. Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rg­A/H5N1  vào tế bào MDCK A. Quan sát CPE xuất hiện ở các đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus dưới kính hiển vi quang học  B.  Nhuộm phát hiện CPE với gential violet Kết quả kiểm tra các chủng virus tái tổ  hợp về hiệu suất nhân giống qua các thế  hệ  nhân trong trứng, tính  ổn định di truyền và khả  năng thích  ứng nhân lên trong tế bào  MDCK đều chỉ ra luận án đã tái tạo và sàng lọc được các chủng virus đáp ứng yêu cầu  của chủng virus ứng viên vaccine phịng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm 3.7. Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm   qui mơ phịng thí nghiệm và xác   định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine Hai loại chế phẩm vaccine được sản xuất từ hai chủng virus rg­A/H5N1 clade 1.1   và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1 có màu trắng đục, đồng nhất, khơng phân lớp.  Kết quả  kiểm tra các chỉ  tiêu (hiệu giá HA, hiệu giá virus của dịch niệu trứng   chứa virus tái tổ hợp trước khi vơ hoạt và sau khi vơ hoạt, tính vơ trùng đối với vi khuẩn  hiếu khí và kỵ khí, nấm men, nấm mốc) của hai chế phẩm vaccine rg­A/H5N1 clade 1.1   và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c trình bày ở Bảng 3.6 Bảng 3.6. Kiểm tra một số  chỉ  tiêu của kháng ngun virus trong vaccine, tính vơ  hoạt và vô trùng của chế phẩm vaccine  Kháng nguyên virus rg­A/H5N1  Nội dung kiểm tra Clade 1.1 Trước vô hoạt Clade 2.3.2.1c 1: 1024 1: 1024 ­ ­ 108 108,6 ­ ­ Hiệu giá HA Sau vô hoạt Trước vô hoạt Hiệu giá virus (EID50/ml) Sau vô hoạt Trước vô hoạt ­ ­ Sau vô hoạt ­ ­ Trước vô hoạt ­ ­ Sau vô hoạt ­ ­ Trước vô hoạt ­ ­ Sau vô hoạt ­ ­ Trước vô hoạt ­ ­ Sau vơ hoạt ­ ­ Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn yếm khí Nấ m Nấm men Số liệu ở Hình 3.13 trình bày kết quả xác định hiệu giá HI của từng cá thể gà trong   các cơng thức tiêm phịng vaccine sản xuất từ  virus rg­A/H5N1 clade 1.1 và rg­A/H5N1   clade 2.3.2.1c Hình 3.13. Hiệu giá kháng thể (HI log2) của các lơ gà tiêm vaccine rg­A/H5N1 clade 1.1  và rg­A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau 2 và 4 tuần tiêm phịng  Gà 3 ngày tuổi   tất cả  các lơ trong thí nghiệm trước tiêm phịng đều khơng có   miễn dịch (huyết thanh khơng chứa kháng thể thụ động) với virus cúm A/H5N1, thể hiện   ở hiệu giá kháng thể trung bình hình học (GMT ­  Geometric mean titer)