Mục tiêu nghiên cứu luận án là phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG LÚA CHUYỂN GEN MÃ HĨA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHĨM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 (DỰ THẢO) TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Xuân Hội Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi ., ngày .tháng .năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Dƣới tác động biến đổi khí hậu tồn cầu, tình trạng hạn hán xảy thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày trầm trọng, nguyên nhân làm giảm sản lƣợng trồng Trong đó, dân số tồn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 1950 tăng lên tỷ ngƣời, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo áp lực lớn cho việc đảm bảo lƣơng thực Vì vậy, an ninh lƣơng thực vấn đề then chốt khoa học nơng nghiệp giới nói chung Việt Nam nói riêng Lúa (Oryza sativa L.) ba loại lƣơng thực quan trọng ngƣời Trên giới, lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ sau lúa mì diện tích sản lƣợng Ở Việt Nam, đất nƣớc từ lâu đời gắn liền với văn minh lúa nƣớc, vai trò lúa đặc biệt quan trọng Cây lúa đóng vai trị sản xuất lƣơng thực, đóng góp sản lƣợng cao (60%) đƣợc canh tác với diện tích lớn (xấp xỉ 3,8 triệu ha) Chính vậy, việc tạo giống lúa có suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt hạn có ý nghĩa quan trọng việc trì tăng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa phƣơng pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu đạt đƣợc không thực cao Một số ứng dụng chọn giống trồng nhƣ dùng thị phân tử, gây đột biến đạt đƣợc số kết định nhƣng có hạn chế Phƣơng pháp chuyển gen đời đƣợc ví nhƣ “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vốn gây nhiều khó khăn cho nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo giống trồng “hoàn hảo” chúng đƣợc kết hợp với Với hƣớng nghiên cứu này, gen quy định tính trạng quan tâm đƣợc chủ động chuyển vào lúa, từ tạo giống lúa mang đặc tính nhƣ mong muốn ngƣời Tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen mà biểu gen liên quan chặt chẽ với q trình phiên mã Vì vậy, nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã tham gia điều khiển trình phiên mã trọng tâm nghiên cứu chọn tạo giống nhằm tăng cƣờng tính chống chịu trồng với điều kiện hạn Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã khơng tham gia trực tiếp vào trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng biểu chúng lại có vai trị điều hịa biểu nhiều gen chức khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả chịu hạn thực vật Nhiều nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã vào lúa đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả chịu hạn so với khơng chuyển gen Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (tên gọi đƣợc bắt nguồn từ tên gọi ba protein đƣợc phát có chứa vùng NAC NAM - no apica meristem, ATAF - trancription activation factor CUC - cup shaped cotyledon) họ nhân tố phiên mã lớn đặc trƣng thực vật Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào nhiều q trình sinh lý, sinh hóa khác tế bào, bao gồm trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn lạnh tế bào Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 OsNAC10 đƣợc chứng minh có liên quan tới trình đáp ứng hạn lúa Cây lúa chuyển gen SNAC1/OsNAC9, OsNAC5 OsNAC10 có khả kháng hạn suất cao so với không chuyển gen Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo dịng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu thu tạo dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không gây ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng, phát triển Các kết thu đƣợc nguồn vật liệu, số liệu quan trọng việc tạo giống trồng chuyển gen có khả chống chịu tốt với điều kiện hạn Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam Tạo dịng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả chống chịu hạn Đối tƣợng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn giống lúa Việt Nam ác n i ung nghiên cứu ch nh Nội dung 1: Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam; Nội dung 2: Thiết kế cấu trúc biểu gen OsNAC1 thực vật dƣới điều khiển promoter liên tục (Ubiquitine, 35S)/ cảm ứng (Lip9, Rd29A) Nội dung 3: Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1 vào lúa Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển khả chịu hạn dòng lúa chuyển gen Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực địa điểm chính: ộ mơn ệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam); Phịng Thí nghiệm tƣơng tác trồng - vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu phát triển Montpellier, Pháp Đóng góp luận án Luận án phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 từ giống lúa địa Việt Nam Luận án tạo đƣợc hệ vector biểu gen tế bào thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin 35S) promoter hoạt động cảm ứng (Lip9 Rd29A) Luận án tạo đƣợc số dòng lúa chuyển gen biểu gen đích, sinh trƣởng bình thƣờng điều kiện khơng xử lý hạn có khả chịu hạn tốt đối chứng không chuyển gen Ứng dụng thực tiễn luận án Kết nghiên cứu luận án tạo đƣợc dòng lúa T mang gen OsNAC1 dạng đồng hợp đặt dƣới điều khiển promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 promoter hoạt động liên tục Ubiquitin Cây chuyển gen có kiểu hình tƣơng đồng với đối chứng không chuyển gen (về khả sinh trƣởng, phát triển suất) điều kiện bình thƣờng khơng có stress hạn, tỷ lệ sống sót cao điều kiện xử lý stress hạn giai đoạn non tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa thể khả chịu hạn cao giai đoạn sinh sản điều kiện xử lý stress hạn Đây kết quan trọng, chứng tỏ tiềm ứng dụng gen OsNAC1 nói riêng gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung công tác tạo giống chuyển gen chịu hạn Trên sở kết luận án, vector biểu gen OsNAC1 luận án tạo đƣợc nghiên cứu chuyển vào giống trồng quan trọng nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo giống chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết sản xuất điều kiện thay đổi khí hậu tồn cầu Việt Nam Bố cục luận án Luận án gồm 144 trang, bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (42 trang); Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu (15 trang); Kết nghiên cứu thảo luận (47 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (22 trang) với 215 tài liệu gồm thứ tiếng: tiếng Việt (11 tài liệu) tiếng Anh (204 tài liệu); Phụ lục (7 trang) Luận án có bảng, 27 hình Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1.1.1 Đặc điểm nông sinh học lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza Chi Oryza phân bố rộng giới có từ 19 – 23 lồi, có lồi Oryza sativa L (2n = 24) đƣợc trồng phổ biến khắp nƣớc giới tập trung chủ yếu châu Á Lồi Oryza gluberrima S đƣợc trồng diện tích nhỏ số nƣớc thuộc châu Phi 1.1.2 Ảnh hƣởng hạn hán ngành sản xuất lúa gạo Việt Nam số quốc gia bị tác động nặng nề biến đổi khí hậu Sự xuất thƣờng xuyên hạn hán tiếp tục đe dọa nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo nƣớc Hệ tác động áp lực ngày tăng giá lúa gạo thị trƣờng giới Việt Nam nƣớc xuất gạo quan trọng giới 1.1.3 Ảnh hƣởng hạn tới đặc điểm chịu hạn cuả lúa Hạn hán mối đe dọa nghiêm trọng sản xuất lúa gạo Hạn ảnh hƣởng tiêu cực đến lúa tất đặc điểm, bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa, phân tử 1.2 VAI TRỊ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT Nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF) protein hoạt động kết hợp với số yếu tố điều hòa khác, bao gồm protein cải biến/thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, để điều hòa tƣơng tác RNA polymerase với DNA NAC nhân tố phiên mã lớn đặc chƣng thực vật Tên gọi NAC bắt nguồn từ tên ba protein đƣợc phát có chứa vùng liên kết DNA tƣơng tự (domain NAC), bao gồm NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) CUC (cup-shaped cotyledon) NAC tham gia vào nhiều q trình sinh lý, hóa sinh khác tế bào, bao gồm q trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng yếu tố stress phi sinh học hữu sinh NAC thành phần quan trọng đƣờng truyền tín hiệu đáp ứng chống chịu stress thực vật cho thấy tiềm ứng dụng họ gen NAC nghiên cứu tạo giống trồng chống chịu stress 1.3 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT Stress sinh học phi sinh học nguyên nhân làm giảm suất nhiều đối tƣợng trồng quan trọng nhƣ lúa, ngơ, bơng, lúa mì, cà chua Và để đối phó với vấn đề này, công nghệ chuyển gen thực vật đƣợc sử dụng đƣợc coi công cụ hiệu để chuyển gen ngoại lai nhằm cải thiện nguồn gen trồng 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU HẠN Một hƣớng giải đƣợc phủ, tổ chức xã hội nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu tạo giống lúa có suất cao, đồng thời có khả chống chịu tốt với điều kiện hạn Định hƣớng nghiên cứu phổ biến đƣợc quan tâm tăng cƣờng biểu gen đáp ứng liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn lúa chuyển gen Ở Việt Nam, định hƣớng chuyển gen vào lúa bắt đầu hình thành vào năm 1995 kỷ trƣớc Tuy nhiên, hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu hoàn chỉnh gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress, đặc biệt nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng hạn lúa Chƣơng VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Giống lúa J02 đƣợc mua từ Công ty Cổ phần giống – vật tƣ nông nghiệp công nghệ cao Việt Nam; Các giống lúa nƣơng IR64 Trung tâm Tài nguyên môi trƣờng – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp 2.1.2 Chủng vi sinh vật Vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α đƣợc mua từ hãng Thermo Scientifics (Mỹ); vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA4404 đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ) 2.1.3 Vector oligonucleotide Vector pBI-Lip9, pBI-Ubi, pBI-35S pCAM-Rd29A nhóm nghiên cứu Phạm Xuân Hội (Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp) thiết kế cung cấp; vector pGEM-T mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm kit pGEM®-T Easy Vector Systems hãng Promega Các cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi cho PCR đƣợc thiết kế dựa trình tự đƣợc cơng bố Gen ank đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) Sigma (Mỹ) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp Qin (2007), Dubouzet (2003) Tran (2004) - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA - Nhân dòng gen OsNAC1/ OsNAC5/ OsNAC10 vào vector pGEM-T - Thiết kế vector biểu gen OsNAC1 tinh phục vụ cho thí nghiệm phân lập gen (Hình 3.1) Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn Ghi chú: giếng – 4: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lúa xử lý hạn 1, 6, 12 24 điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb 3.1.2.2 Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC 3.1.2.2.1 Nhân gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC Các đoạn gen đích đƣợc nhân phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế, sau kiểm tra điện di gel agarose 1% Hình 3.2: Nhân gen OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 kỹ thuật PCR từ cDNA lúa Tẻ đỏ xử lý hạn Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân gen đích từ cDNA mẫu lúa Tẻ đỏ điện di gel agarose 1% (A) PCR nhân gen OsNAC1, giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý hạn); (B) PCR nhân gen OsNAC, giếng 2: khuôn cDNA; giếng 1: đối chứng âm (C) PCR nhân gen OsNAC10, giếng 2: khuôn cDNA; giếng 1: đối chứng âm Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb 11 Kết phân tích trình tự axit amin suy diễn gen OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 từ lúa Tẻ đỏ cho thấy, gen phân lập đƣợc mã hóa cho protein với vùng đặc trƣng họ protein NAC OsNAC1, OsNAC5 chứa đầy đủ domin bảo thủ A, B, C, D E, OsNAC10 thiếu domai E (Hình 3.3) Ngồi ra, ba protein chứa vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho nhân tố phiên mã, nằm domain C (Hình 3.3) Kết hồn tồn phù hợp với cơng bố trƣớc Hình 3.3: Phân tích trình tự axit amin protein OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 giống lúa Tẻ đỏ Ghi chú: Vùng tín hiệu định vị nhân kí hiệu dấu ngoặc; vùng bảo thủ protein NAC kí hiệu A, B, C, D, E; TĐ: gen phân lập từ lúa Tẻ đỏ, JA: gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare) công bố ngân hàng gen mã số AY596808.1, AB028184.1 AK069257.1 12 3.1.3 Phân tích biểu OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 điều kiện hạn Hình 3.4: Mức độ biểu OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 điều kiện xử lý hạn Ghi chú: Mức độ biểu gen OsNAC1 (cột màu xanh), OsNAC5 (cột màu đỏ) OsNAC10 (cột màu vàng) lúa Tẻ đỏ xử lý hạn (PEG 20%) thời gian giờ, giờ, giờ, 12 24 xác định RT - PCR Mức độ biểu gen thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị Actin sử dụng làm gen nội chuẩn Giá trị thể đồ thị kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp RT-PCR nghiên cứu mức độ biểu gen OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 giống lúa Tẻ đỏ điều kiện xử lý stress hạn Mức độ biểu khác gen khác nhau, OsNAC1 có mức độ biểu cao rõ rệt trì mức độ biểu cao thời gian dài đáng kể so với hai gen lại xử lý stress hạn Điều cho phép dự đốn OsNAC1 đóng góp vai trị nhiều đáp ứng chống chịu hạn lúa Tẻ đỏ so với OsNAC5 OsNAC10, đặc biệt stress hạn kéo dài Chính vậy, OsNAC1 đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm nhằm tạo dịng lúa chuyển gen có khả chống chịu hạn 13 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 3.2.1 Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301 Hình 3.5: PCR v cắt enzyme giới hạn kiểm tra có mặt OsNAC1 plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd/OsNAC1 Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 3: PCR với mồi OsNAC1-Fw/Rv; giếng 4: PCR với mồi RD-Fw/NAC1Rv; giếng 2: khuôn pCAM-Rd/OsNAC1; giếng 4: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn) (B) Sản phẩm cắt enzyme giới hạn plasmid pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn enzyme BamHI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn enzyme HindIII/EcoRI; giếng 2: vector nguyên Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb 3.2.2 Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101 Hình 3.6: PCR v cắt giới hạn kiểm tra có mặt OsNAC1 plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNAC1, pBI-Lip9/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1 Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1, 3: khuôn pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 5, 7: khuôn pBI-35S/OsNAC1; giếng 9, 11 : khuôn pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 1-2, 5-6 9-10: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 3, 4: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 7, 8: PCR với cặp mồi 35S-Fw/ OsNAC1-Rv;giếng 11,12: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 1, 3, 6, 8, 10, 12: đối chứng âm với khuôn nước (B) Sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp BamHI; giếng 2: pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 4: pBI-35S/OsNAC1; giếng 6: pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 2, 6: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 1, 5: plasmid nguyên Giếng M: thang chuẩn DNA kb 14 3.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN OsNAC1 TRONG CÂY LÚA 3.3.1 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens LBA4404 Hình 3.7: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1, pBI-35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1 Ghi chú: Sản phẩm PCR khuẩn lạc A tumefaciens với cặp mồi OsNAC1Fw/ OsNAC1-Rv điện di gel agarose 1% (A) Thể biến nạp pBI35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1, giếng 5, 13: đối chứng âm (khuôn nước); giếng – 4: khuôn thể biến nạp pBI35S/OsNAC1; giếng – 9: khuôn thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 10 – 12: khuôn thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1 (B) Thể biến nạp pCAM-Rd/OsNAC1; giếng – 4: khuôn thể biến nạp pCAMRd/OsNAC1; giếng 4: đối chứng âm Giếng M: thang chuẩn DNA kb 3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa Cấu trúc biểu gen OsNAC1 đƣợc chuyển vào mô sẹo lúa J02 (Oryza sativa L Japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mơ sẹo hình thành từ phơi lúa đƣợc lần lƣợt chuyển cấu trúc biểu gen OsNAC1 (Ubi:OsNAC1, Lip9:OsNAC1, 35S:OsNAC1, Rd29A:OsNAC1) cấu trúc vector nhị phân khơng mang gen đích (pCAM IA1301, p I101) Sau đó, mơ sẹo đƣợc chọn lọc tái sinh môi trƣờng nuôi cấy in vitro Bảng 3.2: Kết chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A tumefaciens Cấu trúc gen chuyển Callus Chọn lọc Tái sinh chồi Tái sinh rễ Lip9: OsNAC1 ~100 38 32 29 Ubi: OsNAC1 ~100 50 37 36 35S: OsNAC1 ~100 51 44 41 15 Rd29A: OsNAC1 pBI101 ~100 38 14 14 ~100 27 17 17 pCAMBIA1301 ~100 41 27 25 3.3.3 Chọn lọc lúa mang gen chuyển OsNAC1 có copy đời T0 Các tái sinh trƣớc đƣa bầu đất sinh trƣởng nhà lƣới đƣợc kiểm tra khả mang gen cần chuyển phản ứng PCR với ba cặp mồi Actin-Fw/ Actin-Rv, Hyg-Fw/ Hyg-Rv OsNAC1-Fw/ Nos-Rv (đối với dòng chuyển cấu trúc gen OsNAC1) xác định số lƣợng copy cấu trúc gen chuyển phƣơng pháp phân tích PCR định lƣợng thời gian thực (qRT-PCR) với cặp mồi Hyg-RT-Fw/ Hyg-RT-Rv Bảng 3.3: Kết s ng lọc lúa tái sinh mang cấu trúc biểu gen OsNAC1 PCR Cấu trúc gen chuyển Số kiểm tra Actin (ActinFw/Actin-Rv) Hygromycin (Hyg-Fw/ Hyg-Rv) OsNAC1:Nos OsNAC1-Fw/ Nos-Rv) Lip9: OsNAC1 29 29/29 21/29 21/29 Ubi: OsNAC1 36 36/36 30/36 30/36 35S: OsNAC1 Rd29A: OsNAC1 41 41/41 31/41 31/41 14 14/14 11/14 11/14 pBI101 17 17/17 13/17 0/0 pCAMBIA1301 25 25/25 18/25 0/0 Tổng 162 162/162 124/162 16 93/162 Bảng 3.4: Xác định copy cấu trúc gen chuyển lúa T0 qRT-PCR Cấu trúc gen Số chuyển kiểm tra copy > copy Lip9: OsNAC1 21 12/21 9/29 Ubi: OsNAC1 30 16/30 14/30 35S: OsNAC1 Rd29A: OsNAC1 pBI101 31 11/31 20/31 11 3/11 13 4/13 8/11 9/13 pCAMBIA1301 Tổng 18 124 6/18 52/124 12/18 72/124 3.3.4 Chọn lọc dòng lúa chuyển gen thể đồng hợp tử đời T1 Bảng 3.5: Kết s ng lọc dòng lúa chuyển gen T1 Số hạt nảy Số Số PCR (+) Các dòng lúa mầm hạt đồng hợp chuyển gen môi trƣờng kiểm (> Mồi Mồi Mồi T1 bổ sung tra copy) hygromycin actin Hygro (gen+nos) L1 3/3 3/3 3/3 1/3 L2 12 9/9 9/9 9/9 2/9 Lip9: L3 2/2 2/2 2/2 0/2 OsNAC1 L4 18 12 12/12 11/12 11/12 2/11 L5 4/4 3/4 3/4 1/3 U1 0/0 0/0 0/0 0/0 U2 5/5 5/5 5/5 1/5 U3 3/3 3/3 3/3 0/3 Ubi: U4 15 12 12/12 11/12 11/12 3/11 OsNAC1 U5 4/4 4/4 4/4 1/4 U6 10 7/7 7/7 7/7 2/7 U7 1/1 0/1 0/1 0/1 U8 0/0 0/0 0/0 0/0 Tổng cộng 95 62/95 62/62 17 58/62 58/62 13/58 3.3.5 Chọn lọc dịng lúa có biểu gen chuyển đời T2 Hình 3.8: Mức độ biểu OsNAC1 lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 Ghi chú: Mức độ biểu gen đích dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 đời T2 xác định dựa hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan dịng lúa chuyển gen với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) Mức độ biểu gen lúa khơng chuyển gen có giá trị Gen actin sử dụng làm gen nội chuẩn Giá trị thể đồ thị kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm Hình 3.9: Biểu OsNAC1 lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1 Ghi chú: Mức độ biểu gen chuyển dòng lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1 đời T2 xác định dựa hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan dòng lúa chuyển gen với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) Mức độ biểu gen lúa không chuyển gen có giá trị Gen actin sử dụng làm gen nội chuẩn Giá trị thể đồ thị kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm 18 3.4 ĐÁNH SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG HẠN DÒNG LÚA CHUYỂN GEN 3.3.1 Đánh giá sinh trưởng, phát triển dòng lúa chuyển gen Hình 3.10: Đánh giá sinh trƣởng dòng lúa chuyển gen dòng lúa chuyển gen có khả sinh trƣởng phát triển tƣơng đƣơng với đối chứng tiếp tục đƣợc sử dụng thí nghiệm đánh giá khả kháng hạn 3.3.2 Đánh giá khả chịu hạn dòng lúa chuyển gen T2 3.3.2.1.1 Đánh giá khả chịu hạn theo thang điểm chuẩn IRRI Bảng 3.6: Đánh giá khả chịu hạn theo thang chuẩn IRRI dòng lúa chuyển gen v dòng lúa đối chứng STT Dòng lúa Thang điểm Thứ tự chịu hạn Đối chứng (ĐC) L1.1 L4.1 L5.1 U4.2 U6.1 7,8 ± 0,96 4,2 ± 0,96 5,8 ± 1,44 6,2 ± 1,28 6,6 ± 0,64 5,4 ± 1,28 Nhƣ vậy, xét theo thang điểm chuẩn IRRI, thứ tự chịu hạn giảm dần dòng lúa nhƣ sau: L1.1, L4.1, L5.1, U4.2, U6.1, ĐC 19 3.3.2.1.2 Ảnh hưởng hạn đến hàm lượng nước tương đối Bảng 3.7: H m lƣợng nƣớc đƣơng đối dịng lúa chuyển gen v dịng lúa khơng chuyển gen H m lƣợng nƣớc tƣơng đối (%) Thứ tự Dòng lúa chịu ĐK Tỷ lệ % so với ĐK hạn hạn thƣờng ĐK thƣờng 92 ± 0,02 67 ± 0,01 73 ĐC 95 ± 0,03 88 ± 0,03 92 L1.1 94 ± 0,06 81 ± 0,05 87 L4.1 90 ± 0,08 76 ± 0,10 84 L5.1 91 ± 0,05 71 ± 0,12 78 U4.2 93 ± 0,06 80 ± 0,03 86 U6.1 Dựa vào tiêu RWC mơ lá, dịng xếp theo mức độ chịu hạn giảm dần nhƣ sau: L1.1, L4.1, U6.1, L5.1, U4.2, ĐC 3.3.2.1.3 Ảnh hưởng hạn đến hàm lượng diệp lục lúa Diệp lục sắc tố có vai trị quan trọng hoạt động quang hợp thực vật Chỉ tiêu hàm lƣợng diệp lục dùng để đánh giá khả quang hợp chống chịu hạn Bảng 3.8: H m lƣợng chất diệp lục a dòng lúa chuyển gen v dòng đối chứng Thứ H m lƣợng chất diệp lục tổng số (µg/mg lá) Dịng tự Tỷ lệ h m lúa chịu ĐK thƣờng ĐK hạn lƣợng giảm (%) hạn 1,95 ± 0,05 1,31 ± 0,12 67,21 ĐC L1.1 3,24 ± 0,08 2,91 ± 0,07 89,73 L4.1 2,04 ± 0,03 1,69 ± 0,06 82,89 L5.1 1,87 ± 0,02 1,44 ± 0,02 77,12 U4.2 2,02 ± 0,06 1,50 ± 0,08 74,36 U6.1 2,03 ± 0,03 1,63 ± 0,03 79,92 20 Từ kết nghiên cứu cho thấy, dựa vào tiêu hàm lƣợng diệp lục để đánh giá khả chịu hạn dịng lúa chuyển gen có khả chịu hạn tốt dịng lúa đối chứng 3.3.2.1.4 Hàm lượng proline Bảng 3.9: H m lƣợng proline dòng lúa H m lƣợng proline (%) Dòng H m lƣợng lúa ĐK thƣờng ĐK hạn proline tăng Thứ tự chịu hạn ĐC 121,09 ± 19,02 215,81 ± 28,94 174,92 L1.1 142,93 ± 9,84 347,57 ± 41,04 243,18 L4.1 131,95 ± 6,10 268,29 ± 16,46 203,32 L5.1 129,52 ± 6,26 254,38 ± 7,32 196,40 U4.2 132,09 ± 19,02 265,81 ± 28,94 201,23 U6.1 137,24 ± 2,75 282,10 ± 6,87 205,55 Nhƣ vậy, xét tiêu tăng tích lũy hàm lƣợng proline khẳng định, dịng lúa chuyển gen tích lũy hàm lƣợng proline cao dịng đối chứng có khả thích nghi có sức chống chịu hạn tốt dịng đối chứng 3.3.2.1.5 Ảnh hưởng hạn đến sản sinh ROS lúa Hình 3.11: Ảnh hƣởng hạn đến sản sinh ROS (H2O2) lúa Nhƣ vậy, mức độ tổn thƣơng oxy hóa dịng lúa khơng chuyển gen cao dịng lúa chuyển gen 3.3.2.1.6 Đánh giá chung khả chịu hạn dịng lúa chuyển gen theo tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa 21 Bảng 3.10: Đánh giá chung khả chịu hạn dựa tiêu hình thái, sinh lý v sinh hóa dịng lúa Chỉ tiêu đánh giá khả chịu hạn Dòng lúa Độ RWC H m lƣợng diệp lục a b Tổng số Hàm lƣợng proline Sự sản sinh ROS Tổng điểm Thứ tự chịu hạn ĐC 6 6 6 42 L1.1 1 1 1 L4.1 2 2 3 17 L5.1 4 4 5 30 U4.2 5 5 4 33 U6.1 3 3 2 18 Trong nghiên cứu này, dựa tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa, cho thấy dịng lúa chuyển gen có khả chịu hạn tốt so với dòng lúa đối chứng giai đoạn sinh sản 3.3.2.2 Đánh giá khả chịu hạn thơng qua tỷ lệ sống sót òng lúa chuyển gen sau xử lý hạn Hình 3.12: Tỷ lệ sống sót dịng lúa chuyển gen v dòng đối chứng sau tuần tƣới nƣớc trở lại thí nghiệm xử lý hạn 22 Kết quả, dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 Lip9:OsNAC1 có khả chống chịu stress hạn cao so với lúa không chuyển gen Đặc biệt, dịng U4.2, U6.1 L1.1 có tỷ lệ sống sót ~ 90%, dịng đối chứng ~ 50% KẾT LUẬN Đã phân lập thành công gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 từ giống lúa Việt Nam Các gen phân lập đƣợc có kích thƣớc lần lƣợt 951 bp, 993 bp, 1182 bp giống 99% (AY596808.1), 98% (AB028184.1) 92% (AK069257.1) giống lúa Japonica (Niponbare) đƣợc công bố Ngân hàng Gen giới Trình tự protein gen phân lâp đƣợc chứa đầy đủ vùng peptide đặc trƣng cho nhóm protein NAC vùng tín hiệu định vị nhân Các gen OsNAC1, OsNAC5 OsNAC10 biểu điều kiện xử lý hạn giả định, gen OsNAC1 có mức độ biểu cao rõ rệt trì mức độ biểu cao thời gian dài đáng kể so với hai gen cịn lại Đã thiết kế thành cơng hai hệ vector biểu gen tế bào thực vật: pCAMBIA1301 pBI101 mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển promoter hoạt động liên tục Ubiquitin 35S; promoter hoạt động cảm ứng stress Rd29A Lip9 Các vector mang cấu trúc biểu gen OsNAC1 đƣợc biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 Đã chuyển thành công cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos Lip9:OsNAC1:Nos vào giống lúa J02 Sự có mặt cấu trúc biểu gen đích dịng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra phƣơng pháp PCR Các dòng lúa chuyển gen đồng hợp mang 23 copy gen chuyển OsNAC1 đƣợc xác định phƣơng pháp qRT-PCR Biểu gen chuyển OsNAC1 chuyển gen T2 đƣợc chứng minh phƣơng pháp RT-PCR Đã đánh giá sinh trƣởng, phát triển thông qua tiêu nông học (chiều cao cây, số nhánh, số hạt chắc/ bông, thời gian sinh trƣởng) khả chịu hạn dịng lúa chuyển gen thơng qua tiêu hình thái (độ lá), sinh lý (hảm lƣợng nƣớc tƣơng đối, hàm lƣợng chất diệp lục) sinh hóa (hàm lƣợng proline, sản sinh chất hoạt hóa oxi hóa) dịng lúa chuyển cấu trúc biểu gen Ubi:OsNAC1:Nos dòng lúa chuyển cấu trúc biểu gen Lip9:OsNAC1:Nos có khả sinh trƣởng tƣơng đƣơng với đối chứng điều kiện bình thƣờng Trong điều kiện xử lý stress hạn, dòng lúa chuyển gen có tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa thể khả chịu hạn cao dòng lúa đối chứng thời kỳ sinh sản Đồng thời, tỷ lệ sống sót dịng lúa chuyển gen thời kỳ non cao so với dòng đối chứng xử lý hạn Cụ thể, dòng lúa chuyển gen L1.1, L4.2, U6.1, L5.1, U4.2 có tỷ lệ sống sót 90%, 84%, 81%, 67%, 62% cao dịng đối chứng với tỷ lệ sống sót đạt 53% KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu, phân tích dịng chuyển gen OsNAC1 hệ T3, T4… (tính bền vững di truyền, khả trì tính chống chịu, suất…) Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào đối tƣợng trồng khác với promoter điều khiển hoạt động cảm ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng Phạm Xuân Hội (2014), “Phân lập gen OsNAC10 liên quan tới tính chống chịu hạn từ giống lúa Indica”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(2), tr 319-326 Nguyễn Duy Phƣơng, Phạm Thu Hằng Phạm Xuân Hội (2014), “Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC5 liên quan tới tính chống chịu stress từ giống lúa Indica”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 30(4), tr 40-47 Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng, Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa Phạm Xuân Hội (2014), “Thiết kế vector biểu mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 30(4), tr 1-10 Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Xuân Hội (2016), “Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Japonica”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn 1, tr 17-22 Phạm Thu Hằng, Đàm Quang Hiếu, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Xuân Hội (2016), “Thiết kế vector chuyển gen OsNAC1 liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa J02 (Oryza sativa L japonica), Tạp chí Cơng nghệ sinh học 14(2), tr 271 – 277 ... lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn lúa 3.1.2 Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn 3.1.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa. .. chuyển gen Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài luận án tiến sĩ ? ?Nghiên cứu tạo dịng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn? ?? với mục tiêu thu tạo dòng lúa. .. nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả chống chịu hạn Đối tƣợng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn giống lúa Việt