T QU VÀ TH O LU Ậ

3.1. T ng h p nhân t o và thi t k t vector h  tr  bi u hi n gen mã hóa kháng nguyên HAổ ợ ạ ế ế ỗ ợ ể ệ

3.1.1. T ng h p nhân t o gen mã hóa kháng nguyên HAổ ợ ạ

3.1.1.1. Phân tích trình t  gen HAự

Tìm ki m và khai thác thông tin trên ngân hàng gen qu c t , chúng tôi đã thu th p đ cế ố ế ậ ượ   trình t  nucleotide c a gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin c a ch ng virus cúmự ủ ủ ủ   A/H7N9 đang gây b nh trên gia c m   Trung Qu c năm 2013 và 2014 v i mã s  KF918659.1 vàệ ầ ở ố ớ ố   KJ411975.1. Theo đó, gen H7 hoàn ch nh c a ch ng này bao g m 1683 nucleotide mã hóa cho 559ỉ ủ ủ ồ   axit amin, trong đó 18 axit amin d n đ u là đo n peptide tín hi u đóng vai trò quy t đ nh tham giaẫ ầ ạ ệ ế ị   vào vi c v n chuy n chu i polypeptide xuyên qua màng t  bào, ti u ph n HA1 g m 321 axit aminệ ậ ể ỗ ế ể ầ ồ   và ti u ph n HA2 g m 220 axit amin. Khi bi u hi n trong t  bào th c v t, v i m c đích gi  l iể ầ ồ ể ệ ế ự ậ ớ ụ ữ ạ   protein kháng nguyên hemagglutinin   m ng l i n i ch t, chúng tôi đã lo i b  chu i peptide tínở ạ ướ ộ ấ ạ ỏ ỗ   hi u g m 18 axit amin d n đ u (đ c ký hi u màu đen trong Hình 3.1), đ ng th i, trong quá trìnhệ ồ ẫ ầ ượ ệ ồ ờ   thi t k  vector chuy n gen sau này, chúng tôi s  s  d ng đo n trình t  g m 75 nucleotide (đ cế ế ể ẽ ử ụ ạ ự ồ ượ   g ch chân   Hình 3.1) mã hóa cho ạ ở LeB4 ER­signal peptide là đo n peptide tín hi u c a gen LeB4ạ ệ ủ   (mã hóa cho protein legumin type B   cây đ u răng ng a ở ậ ự Vicia faba) đ  n i ghép v i đo n gen HAể ố ớ ạ   đã đ c t i  u hóa. ượ ố ư

Trên c  s  trình t  axit amin suy di n, chúng tôi đã xác đ nh các v  trí axit amin quy đ nh đ c tínhơ ở ự ễ ị ị ị ặ   quan tr ng c a kháng nguyên HA ch ng A/Shanghai/2/2013 đang nghiên c u bao g m v  tríọ ủ ủ ứ ồ ị   glycosyl hóa, đi m c t protease, v  trí bám dính th  th  và v  trí epitope, đ ng th i so sánh v iể ắ ị ụ ể ị ồ ờ ớ  kháng nguyên HA c a m t s  ch ng virus H7N9 đ c phát hi n và phân l p trên ng i và giaủ ộ ố ủ ượ ệ ậ ườ   c m t i các vùng d ch   Trung Qu c trong các giai đo n tầ ạ ị ở ố ạ ừ 2013­2016. 

3.1.1.2. C i bi n trình t  gen mã hóa kháng nguyên HAả ế ự

Đ  c i bi n mã theo h ng phù h p v i b  máy s n xu t protein c a th c v t, căn c  vàoể ả ế ướ ợ ớ ộ ả ấ ủ ự ậ ứ   b ng t n su t s  d ng các codon   th c v t trên ả ầ ấ ử ụ ở ự ậ ngân hàng d  li u mã di truy n Codon Usageữ ệ ề   Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) k t h p v i vi c ế ợ ớ ệ s  d ng ph n m m Codonử ụ ầ ề   Optimization 2.0, chúng tôi đã lo i b  và thay th  các codon hi m (kho ng 10%) trong gen H7.ạ ỏ ế ế ả   Ngoài ra, trình t  ATTTA đ c cho là gây b t  n cho quá trình phiên mã (Gutierrez và đtg., 1999)ự ượ ấ ổ   cũng đ c lo i b . Thêm vào đó, s  hình thành c u trúc mRNA th  c p đ c gi m thi u nh  sượ ạ ỏ ự ấ ứ ấ ượ ả ể ờ ử  d ng ph n m m g c c a ụ ầ ề ố ủ Invitrogen. M c khác, đ  thu n ti n cho vi c c t và n i ghép genặ ể ậ ệ ệ ắ ố   trong quá trình thi t k  vector chuy n gen vào th c v t, hai v  trí nh n bi t c a enzyme h nế ế ể ự ậ ị ậ ế ủ ạ   ch  ếBamHI và PspOMI được thêm vào đ u 5’ và 3’ c a gen H7. ầ ủ Vi c đ i mã đệ ổ ược chúng tôi  th c hi n d a trên c  s  các b  mã thay đ i sao cho phù h p v i h  th ng bi u hi n   th cự ệ ự ơ ở ộ ổ ợ ớ ệ ố ể ệ ở ự   v t nh ng không làm thay đ i trình t  c a axit amin. Trình t  nucleotide và trình t  acid aminậ ư ổ ự ủ ự ự   suy di n c a các đo n gen trễ ủ ạ ước và sau khi đ i mã đổ ược ki m tra và so sánh b ng ph n m mể ằ ầ ề   BioEdit. K t qu  cho th y, gen ế ả ấ HA g c và gen ố HA đã c i bi n mã có trình t  nucleotide tả ế ự ương  đ ng 76%, tuy nhiên các v  trí sai khác không làm  nh hồ ị ả ưởng đ n quá trình d ch mã, trình tế ị ự  axit amin suy di n t  các gen v n đ t đ  tễ ừ ẫ ạ ộ ương đ ng là 100%   hình 3.2.ồ ở  

3.1.2. K t qu  t o vector chuy n gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ ELP ế ả ạ ể

3.1.2.1. T o vector tách dòng pRTRA _35S_HA mono_ạ  ELP 

Gen HA có kích th c 1644 bp đ c t ng h p nhân t o b i công ty SGI­DNA (USA) n mướ ượ ổ ợ ạ ở ằ   trong vector pUC/HA. Hai đ u đo n gen này đ u ch a trình t  nh n bi t c a c p enzyme c t gi iầ ạ ề ứ ự ậ ế ủ ặ ắ ớ  h n ạ BamHI và PspOMI. Do đó, chúng tôi đã s  d ng chính c p enzyme này đ  thu đo n gen HAử ụ ặ ể ạ  

t  vector ban đ u. S n ph m c t đ c đi n di thu đo n có kích th c t ng  ng v i HA kho ngừ ầ ả ẩ ắ ượ ệ ạ ướ ươ ứ ớ ả   1,7 kb. S n ph m đ c thôi gel, tinh s ch và  đ c đi n di ki m tra trên gel agarose 0,8 % v iả ẩ ượ ạ ượ ệ ể ớ   thang DNA 1 kb. K t qu  th  hi n (Hình 3.3.A.) đ ng th i vectoeer tách dòng trung gianế ả ể ệ ồ ờ   pRTRA35S_H5­histag­cmycELP­KDEL cũng đ c x  lý b ng c p ượ ử ằ ặ enzyme BamHI và PspOMI  đ  lo i b  đo n gen H5 thu đo n khu có kích th c 5,05kb. Các phân đo n ADN có kích th cể ạ ỏ ạ ạ ướ ạ ướ   kho ng 1,7kb và 5,05kb đ c thu nh n và tinh s ch ph c v  cho ph n  ng ghép n i t o vectorả ượ ậ ạ ụ ụ ả ứ ố ạ   tách dòng t ng  ng ươ ứ pRTRA_HA mono_ELP.

Theo lý thuy t khi c t ế ắ vector pRTRA_HA mono_ELP, b ng enzyme ằ BamHI/ và PspOMI thì 

plasmid pRTRA tái t  h p s  cho 2 v ch băng khi ki m tra trên gel agrose 0,8 %.   Hình 3.3.B choổ ợ ẽ ạ ể Ở   th y, khu n l c đ c tách plasmid đ c ki m tra c t b ng ấ ẩ ạ ượ ượ ể ắ ằ BamHI và PspOMI cho các v ch trùngạ   v i kích th c tính toán lý thuy t c a pRTRA_35S_100ELP là 5,05 kb và HA là 1,7 kb.ớ ướ ế ủ

Hình 3.3. K t ế qu  đi n di s n ph m xả ệ ả ẩ ử lý vector pRTRA_HA mono_ELP , b ng enzyme c tằ ắ   gi i h n ớ ạ BamHI/PspOMI

3.1.1.2. T o vector chuy n gen pCB301_35S_HA mono_ạ ể  ELP

Vector tách dòng trung gian pRTRA35S_HA mono_ELP, cùng đ c x  lý b ng enzymeượ ử ằ  

HindIII nh m thu đ c đo n gen m c tiêu bao g m promoter 35S_ HA mono_ELP và vector mằ ượ ạ ụ ồ ở  vòng. Đ i v i vector pCB301, đ  tránh hi n t ng đóng vòng, s n ph m c t sau khi tinh s chố ớ ể ệ ượ ả ẩ ắ ạ   đ c x  lý ti p v i enzyme ượ ử ế ớ SAP. K t qu  đi n di cho th y, v i s n ph m c t vector pCB301 choế ả ệ ấ ớ ả ẩ ắ   1 băng n m   kích th c kho ng 5,6 kb theo đúng tính toán lý thuy t (Hình 3.5A.2); s n ph m c tằ ở ướ ả ế ả ẩ ắ  vector pRTRA35S_ HA mono_ELP, cho 2 băng, 1 băng có kích th c kho ng 4,1 kb t ng  ngướ ả ươ ứ   v i cassette  ớ 35S_ HA mono_ELP và  băng còn l i có kích th c kho ng 2,6 kb là đo n khungạ ướ ả ạ   vector còn l i (ạ Hình 3.5A.1). Các phân đo n DNA có kích th c 5,6 kb và 4,1 kb sau đó đ c thuạ ướ ượ   nh n và tinh s ch đ  ph c v  cho ph n  ng n i ghép t o vector chuy n gen t ng  ngậ ạ ể ụ ụ ả ứ ố ạ ể ươ ứ   pCB301_35S_ HA mono_ELP. Đ  bi t ch c ch n plasmid đã đ c bi n n p vào t  bào kh  bi nể ế ắ ắ ượ ế ạ ế ả ế  

E.Coli DH5  b ng ph ng pháp s c nhi t, chúng tôi ti n hành nuôi và tách plasmid khu n bi nα ằ ươ ố ệ ế ẩ ế   n p vector tái t  h p (các plasmid cho k t qu  d ng tính v i colony­PCR), sau đó c t ki m traạ ổ ợ ế ả ươ ớ ắ ể   b ng c t enzyme gi i h n  ằ ắ ớ ạ HindIII (Hình 3.5.B). Các k t qu  ki m tra đã ch ng minh vectorế ả ể ứ   pCB301_35S_ HA mono_ELP đã đ c thi t k  thành công.ượ ế ế  Vector tái t  h p sau đó đổ ợ ược bi nế   n p vào t  bào ạ ế A. tumefaciens C58C1, đ ng th i ch ng ồ ờ ủ E.Coli mang vector này đ c gi  dòngượ ữ  

b ng   glycerolằ   100% b o qu n   ­80ả ả ở oC để 

Hình 3.5. K t qu  thi t k  vector pCB301_35S_ HA mono_ELPế ả ế ế

(A): X  lý vector pCB301­Kan và vector pRTRA_35S_HA mono_ELP b ng ử ằ HindIII

(B): K t qu   ki m tra s n ph m c t plasmid pCB301 tái t  h p b ng HindIIIế ả ể ả ẩ ắ ổ ợ ằ

3.1.3.  K t qu  t o vector chuy n gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP ế ả ạ ể

3.1.3.1. T o vector tách dòng pRTRA _35S_ạ  HA trimeric_ELP  

Vector tách dòng pRTRA_H5pII_  Histag­Cmyc­100xELP  cũng được x  lý b ng c pử ằ ặ   enzyme BamHI và PspOMI đ  lo i b  đo n gen H5 thu đo n khu có kích thể ạ ỏ ạ ạ ước 5,15 kb. Các  phân đo n ADN có kích thạ ước kho ng 1,7kb và 5,15kb đả ược thu nh n và tinh s ch ph c vậ ạ ụ ụ  cho   ph n   ng   ghép   n i   t o   vector   tách   dòng   tả ứ ố ạ ương   ng  ứ pRTRA_HApII_  Histag­Cmyc­ 100xELP  và được dòng hóa trong t  bào  ế E.coli DH5α.   (Hình 3.6) cho th y, khu n l cỞ ấ ẩ ạ   được tách plasmid và ki m tra b ng enzyme c t gi i h n  ể ằ ắ ớ ạ BamHI và  PspOMI cho các v chạ   trùng v i kích thớ ước tính toán lý thuy t c a pRTRA_35S_pII_ế ủ  Histag­Cmyc­100xELP là 5,15  kb và HA là 1,7 kb. 

Hình 3.6. K t qu  đi n di s n ph m xế ả ệ ả ẩ ử lý vector tách dòng b ng enzyme gi i h nằ ớ ạ  

BamHI/PspOMI . M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric_ELP. 3.1.3.2. T o vector chuy n gen pCB301_35S_ạ ể  HA trimeric_ELP. 

K t qu  c t vector pRTRA35S_ế ả ắ  HA trimeric_ELP và pBC301cùng đ c x  lý b ng enzymeượ ử ằ  

HindIII đi n di cho th y, v i s n ph m c t vector pCB301 cho 1 băng n m   kích th c kho ngệ ấ ớ ả ẩ ắ ằ ở ướ ả   5,6   kb   theo   đúng   tính   toán   lý   thuy t   (Hình   3.7.A);   s n   ph m   c t   vector   pRTRA35S_ế ả ẩ ắ   HA  trimeric_ELP, cho 2 băng, 1 băng có kích th c kho ng 4,2 kb t ng  ng v i cassette 35S_ướ ả ươ ứ ớ  HA  trimeric_ELP và băng còn l i có kích th c kho ng 2,6 kb là đo n khung vector còn l i (Hìnhạ ướ ả ạ ạ   3.7.A). 

Các phân đo n DNA có kích thạ ước 5,6 kb và 4,2 kb sau đó được thu nh n và tinh s ch đậ ạ ể  ph c   v   cho   ph n   ng   n i   ghép   t o   vector   chuy n   gen   t ng   ng   pCB301_35S_ụ ụ ả ứ ố ạ ể ươ ứ   HA  trimeric_ELP. Đ  bi t ch c ch n plasmid đã đ c bi n n p vào chúng tôi ti n hành nuôi và táchể ế ắ ắ ượ ế ạ ế   plasmid khu n bi n n p vector tái t  h p, sau đó ki m tra b ng enzyme c t gi i h n  ẩ ế ạ ổ ợ ể ằ ắ ớ ạ HindIII 

(Hình 3.7.B) Các k t qu  ki m tra đã ch ng minh vector pCB301_35S_ế ả ể ứ  HA trimeric_ELP đã đ cượ   thi tế  k  thành công.ế   Vector tái t  h p sau đó đổ ợ ược bi n n p vào t  bào  ế ạ ế A. tumefaciens 

Hình 3.7. K t qu  phân tích ki m tra vector chuy n gen ế ả ể ể pCB301_35S_ HA trimeric_ELP 3.1.4. K t qu  t o vector chuy n gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric ế ả ạ ể

3.1.4.1. T o vector tách dòng pRTRA _35S_ạ  HA trimeric

Vector tách dòng pRTRA_H5pII sau khi được x  lýử  b ng enzyme ằ BamHI/PspOMI được  g n v i gen HA và đắ ớ ược dòng hóa trong t  bào ế E.coli DH5α.  K t qu  ế ảcho th y   (Hình 3.8) ấ ở khu n l c đẩ ạ ược tách plasmid và ki m tra b ng enzyme gi i h n ể ằ ớ ạ BamHI/PspOMI cho các v ch ạ trùng v i kích thớ ước tính toán lý thuy t c a pRTRA_35S_pII_ế ủ  là 3,6 kb và HA là 1,7 kb. 

Hình 3.8. K t qu  đi n di s n ph m xế ả ệ ả ẩ ử lý vector tách dòng b ng enzyme gi i h nằ ớ ạ  

BamHI/PspOMI . M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric. 3.1.4.2. T o vector chuy n gen pCB301_35S_ạ ể  HA trimeric. 

Vector tách dòng trung gian pRTRA_35S_ HA trimeric và pBC301cùng đ c x  lý b ngượ ử ằ   enzyme HindIII nh m thu đ c đo n gen m c tiêu bao g m promoter 35S_ằ ượ ạ ụ ồ  HA trimeric. K t quế ả  đi n di cho th y, v i s n ph m c t vector pCB301 cho 1 băng n m   kích th c kho ng 5,6 kbệ ấ ớ ả ẩ ắ ằ ở ướ ả   theo đúng tính toán lý thuy t, s n ph m c t vector ế ả ẩ ắ pRTRA 35S_ HA trimeric cho 3 v ch băng: 1ạ   v ch có kích th c kho ng 2,5 kb t ng  ng v i cassette ạ ướ ả ươ ứ ớ 35S_ HA trimeric, 2 băng còn l i có kíchạ   th c kho ng 1,7 kb và 0,9 kb là đo n khung vector còn l i (Hình 3.9.A). ướ ả ạ ạ

Các phân đo n DNA có kích th c 5,6 kb và 2,6 kb sau đó đ c thu nh n và tinh s ch đ  ph c vạ ướ ượ ậ ạ ể ụ ụ  cho ph n  ng n i ghép t o vector chuy n gen t ng  ng pCB301_35S_ả ứ ố ạ ể ươ ứ  HA trimeric. Đ  bi tể ế  ch c ch n plasmid đã đ c bi n n p vào chúng tôi ti n hành nuôi và tách plasmid khu n bi n n pắ ắ ượ ế ạ ế ẩ ế ạ   vector tái t  h p, sau đó ki m tra b ng enzyme c t gi i h n ổ ợ ể ằ ắ ớ ạ HindIII (Hình 3.9.B) các k t quế ả  ki m tra đã ch ng minh vector pCB301_35S_ể ứ  HA trimeric đã đ c thi t k  thành công.ượ ế ế  Vector tái  t  h p sau đó đổ ợ ược bi n n p vào t  bào ế ạ ế A. tumefaciens C58C1.

3.1.5. T o c u trúc vector chuy n gen th c v t mang gen HA trimeric­IgMFcạ ấ ể ự ậ

3.1.5.1. T o vector tách dòng mang ạ gen mã hóa protein HA trimeric­IgMFc

Thi t k  vector tách dòng pRTRAế ế _35S_SP_His_ HA trimeric­IgMFc. X  lý đ ng th iử ồ ờ  đo n gen HA trimeric­IgMFc đã khu ch đ i và vector pRTRAạ ế ạ _35S_SP_His_ HA trimeric­ IgMFc b ng c p enzyme ằ ặ BamHI và PspOMI. Gen HA đã x  lý enzyme và đo n khung vectorử ạ   sau khi lo i b  gen mã hóa kháng nguyên H5 (kho ng 1,5 kb) còn l i có chi u dài g n 4,3ạ ỏ ả ạ ề ầ   kb được thu nh n và tinh s ch (Hình 3.10 A, B) ph c v  cho ph n  ng n i ghép b ng T4­ậ ạ ụ ụ ả ứ ố ằ DNA ligase đ  t o vector tái t  h p ể ạ ổ ợ pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric­IgMFc. K t qu  đi nế ả ệ   di s n ph m c t cho 2 băng v ch kho ng 1,5 kb và 4,3 kb theo đúng tính toán lý thuy tả ẩ ắ ạ ả ế   (Hình 3.10.D). Nh  v y đã thi t k  thành công vector  ư ậ ế ế pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric­ IgMFc

Hình 3.10.  K t qu  thi t k  vector pRTRAế ả ế ế _35S_SP_His_ HA trimeric­IgMFc  x  lý vectorử   b ng ằ BamHI và PspOMI B): s n ph m tinh s ch đo n gen HA (1) và khung vector ả ẩ ạ ạ (2) sau  khi đã x  lý b ng ử ằ BamHI và PspOMI (C): colony­PCR ch n l c các khu n l c mang plasmidọ ọ ẩ ạ   tái t  h p (D): c t ki m tra vector ổ ợ ắ ể b ng ằ BamHI và PspOMI.

3.1.5.2. T o vector chuy n gen pCB301ạ ể _35S_SP_His_HA trimeric­IgMFc 

K t qu  đi n di cho th y,  ế ả ệ ấ v i s n ph m c t vector pCB301 cho 1 băng n m   kíchớ ả ẩ ắ ằ ở   thước kho ng 5,5 kb theo đúng tính toán lý thuy t (Hình 3.11.A.1); trong khi đóả ế  s n ph m c tả ẩ ắ  vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc cho 2 v ch băng: 1 v ch có kích thạ ạ ước g nầ   3,2 kb tương  ng v i cassette  ứ ớ 35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc, v ch băng còn l i có kíchạ ạ   thước g n 2,7 kb là đo n khung vector còn l i (Hình 3.11.A.2). Các phân đo n DNA có kíchầ ạ ạ ạ   thước 5,5 kb và 3,2 kb sau đó được thu nh n và tinh s ch đ  ph c v  cho ph n  ng n i ghépậ ạ ể ụ ụ ả ứ ố   t o vector chuy n gen  ạ ể CB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc. Vector tái t  h p này đổ ợ ược  ki m ch ng b ng x  lý enzyme gi i h n HindIII (Hình 3.11. B). Đ ng th i đ  ch n để ứ ằ ử ớ ạ ồ ờ ể ọ ược  vector ch a gen mã hóa protein HA­pII­IgMFc có chi u bi u hi n ngứ ề ể ệ ược chi u gen khángề   kháng sinh, chúng tôi đã c t ki m tra b ng enzyme ắ ể ằ NcoI (Hình 3.11.C). Các k t qu  trên đãế ả   ch ng minh vector ứ pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc đã được thi t k  thành công.ế ế

Hình 3. 11.  K t qu  thi t k  vector pCB301ế ả ế ế _35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc (A): x  lýử   vector pCB301­Kan (1) và  RTRA_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc (2) b ng HindIIIB): C tằ ắ  ki m tra vector ể CB301_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc b ng HindIII ằ (C): C t ki m tra vectorắ ể   pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc b ng NcoI. ằ

3.2. T i  u các đi u ki n bi u hi n và tinh s ch protein HA tái t  h pố ư ể ệ ể ệ ạ ổ ợ

3.2.1. T i  u các đi u ki n bi u hi n protein HA tái t  h pố ư ể ệ ể ệ ổ ợ

3.2.1.1. Anh h̉ ưởng c a vector h  trủ ỗ ợ

Đ  đánh giá m c đ  ho t đ ng c a vector mang gen mã hóa cho protein tái t  h p HA vàể ứ ộ ạ ộ ủ ổ ợ   vector h  tr  mang gen mã hóa cho protein HcPro_PRSVỗ ợ   c ch  b t ho t gen ho t đ ng d i sứ ế ấ ạ ạ ộ ướ ự  ki m soát c a promotor CaMV35S, hai thí nghi m khác nhau đ c th c hi n đ ng th i s  d ngể ủ ệ ượ ự ệ ồ ờ ử ụ   ch ng  ủ Agrobacterium tumefaciens  mang   vector h  tr    trên.   thí nghi m đ u tiên ch ng viỗ ợ Ở ệ ầ ủ   khu n mang gan mã hóa cho protein tái t  h p HA đ c nuôi đ n khi n ng đ  khu n ODẩ ổ ợ ượ ế ồ ộ ẩ 600 đ tạ  0,5 và đ c xâm nhi m vào cây thu c lá (4­6 tu n tu i) b ng ph ng pháp hút chân không.   thíượ ễ ố ầ ổ ằ ươ Ở   nghi m th  2 ch ng vi khu n mang gan mã hóa cho protein tái t  h p HA đ c nuôi đ n khi n ngệ ứ ủ ẩ ổ ợ ượ ế ồ   đ  khu n ODộ ẩ 600  đ t 0,5 và đ c xâm nhi m vào cây (4­6 tu n tu i) cùng v i vector h  trạ ượ ễ ầ ổ ớ ỗ ợ  pIBT/HC­Pro PRSV b ng ph ng pháp hút chân không. M u lá s  đ c thu sau 6 ngày xâmằ ươ ẫ ẽ ượ   nhi m   đ   tách   protein.ễ ể   M c đ  bi u hi n c a HAứ ộ ể ệ ủ   khi   không   có   vector   hỗ  tr  và có vector h  tr  đ cợ ỗ ợ ượ   đánh   giá   b ng   ph ngằ ươ   pháp lai mi n d ch. K t quễ ị ế ả  th  hi n   Hình 3.12.ể ệ ở

Hình 3.12. K t qu  đánh giá bi u hi n kháng nguyên HAế ả ể ệ

 (A): D ch chi t protein  khi không s  d ng vector h  tr  ; (B): D ch chi t protein khi s  d ngị ế ử ụ ỗ ợ ị ế ử ụ   vector h  tr  HcPro PRSV. ỗ ợ

3.2.1.2. K t qu  t i  u quy trình bi u hi n t m th i kháng nguyên HA trên cây thu c láế ả ố ư ể ệ ạ ờ ố

Bi u hi n t m th i protein tái t  h p nói chung và kháng nguyên HA nói riêng   th c v tể ệ ạ ờ ổ ợ ở ự ậ  b ng ph ng pháp bi u hi n t m th i khi s  d ng máy hút chân không ch a t ng đ c ti n hànhằ ươ ể ệ ậ ờ ử ụ ư ừ ượ ế  

 Vi t Nam. M c dù quy trình th c hi n đ n gi n nh ng có nhi u y u t   nh h ng đ n kh

ở ệ ặ ự ệ ơ ả ư ề ế ố ả ưở ế ả 

năng bi u hi n c a protein tái t  h p nh : N ng đ  ch t d n d  Acetone syringone (AS), n ngể ệ ủ ổ ợ ư ồ ộ ấ ẵ ụ ồ   đ  vi khu n cho xâm nhi m, v  trí lá xâm nhi m, th i gian thu m u lá. Vì v y, vi c ti n hành xâyộ ẩ ễ ị ễ ờ ẫ ậ ệ ế   d ng m t quy trình chu n cho bi u hi n protein tái t  h p là r t c n thi t. Trong nghiên c u này,ự ộ ẩ ể ệ ổ ợ ấ ầ ế ứ   chúng tôi ti n hành t i  u b n y u t   nh h ng đ n bi u hi n t m th i HA trong đi u ki n cóế ố ư ố ế ố ả ưở ế ể ệ ạ ờ ề ệ   s  h  tr  c a protein HC­pro là: N ng đ  ch t d n d  acetone syringone (AS), n ng đ  khu nự ỗ ợ ủ ồ ộ ấ ẫ ụ ồ ộ ẩ   cho xâm nhi m, v  trí lá xâm nhi m và th i gian thu m u. K t qu  bi u hi n c a HA t i các đi uễ ị ễ ờ ẫ ế ả ể ệ ủ ạ ề   ki n khác nhau đ c đánh giá b ng lai mi n d ch (Hình 3.13) và phân tích b ng ph n m mệ ượ ằ ễ ị ằ ầ ề  

ImageJ. S  li u đ c x  lý trên Excel và  nh h ng c a các y u t  đ n bi u hi n c a proteinố ệ ượ ử ả ưở ủ ế ố ế ể ệ ủ   HA đ c đánh giá b ng ph n m m INOVA. ượ ằ ầ ề

Hình 3.13. K t qu  bi u hi n protein HA t i các đi u ki n thí nghi m khác nhauế ả ể ệ ạ ề ệ ệ

M: Marker; 1,2,3,4,5,6,7,8,9: D ch chi t protein t  lá bi u hi n protein t i các công th c thíị ế ừ ể ệ ạ ứ   nghi m   L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9;   10,11,12,13   l n   lệ ầ ượt   là:  50,100,150,200   ng   ScFv­ cmyc;14: Đ i ch ng âm là d ch chi t protein t  cây hút chân không v i đ m MES.ố ứ ị ế ừ ớ ệ

3.2.1.3. T i  u n ng đ  PEG cho tinh s ch protein HA có g n đuôi ELPố ư ồ ộ ạ ắ

Kháng nguyên tái t  h p c n đổ ợ ầ ược tinh s ch cho nghiên c u đ c tính kháng nguyên, khạ ứ ặ ả  năng gây mi n d ch đ ng v t...Trong nghiên c u này, chúng tôi đ a raễ ị ộ ậ ứ ư  phương pháp đ n gi nơ ả   đ  tinh s ch protein tái t  h p d a trên s  g n đuôi ELP. S  chuy n pha ngh ch đ o c aể ạ ổ ợ ự ự ắ ự ể ị ả ủ   protein g n ELP ph  thu c vào nhi t đ  và n ng đ  mu i. S  tăng n ng đ  mu i và nhi t đắ ụ ộ ệ ộ ồ ộ ố ự ồ ộ ố ệ ộ  d n đ n s  hình thành các protein không tan, nh ng phân t  protein này s  đẫ ế ự ữ ử ẽ ược tách ra kh iỏ   dung d ch b ng ly tâm   nhi t đ  nh t đ nh. Protein g n ELP không tan s  đị ằ ở ệ ộ ấ ị ắ ẽ ược hòa tan l iạ  b ng đ m l nh n ng đ  ion th p. Meyer và c ng s  đã quan sát th y nguyên nhân gây ra sằ ệ ạ ồ ộ ấ ộ ự ấ ự  chuy n pha ngh ch đ o là do s  hình thành các kh i k t t  kích thể ị ả ự ố ế ụ ước nh  c a protein g nỏ ủ ắ   ELP. Nh ng kh i k t t  này có th  đữ ố ế ụ ể ược g n trên màng. Đây là c  s  cho thí nghi m tinhắ ơ ở ệ   s ch ạ HA mono_ELP và HA trimeric_ ELP b ng màng l c d a trên s  chuy n pha ngh ch đ oằ ọ ự ự ể ị ả   (mITC). Tuy nhiên, trong quá trình tinh s ch qua màng ES 0,2 µm khi cho d ch protein trongạ ị   mu i NaCl 2M   nhi t đ  thố ở ệ ộ ường d ch không đi đị ược qua màng. Nguyên nhân là do có quá  nhi u protein t p ch a b  lo i   các bề ạ ư ị ạ ở ước li tâm và qua màng PES 0,22 µm. Vì v y, đ  lo i b tậ ể ạ ớ   protein t p chúng tôi đã b  sung PEG 8000 vào d ch protein sau khi li tâm. N ng đ  PEG đãạ ổ ị ồ ộ   đượ ố ưc t i  u nh m thu l i đằ ạ ược nhi u HA nh t và ít t p nh t. K t qu  t i  u n ng đ  PEGề ấ ạ ấ ế ả ố ư ồ ộ   được th  hi n qua (Hình 3.14).ể ệ

Hình 3.14. K t qu  t i  u n ng đ  PEG cho protein HA trimeric _ ELPế ả ố ư ồ ộ

(A): được đánh giá b ng SDS­PAGE; (B): lai mi n d ch ằ ễ ị 3.2.2. K t qu  bi u hi n và tinh s ch protein HAế ả ể ệ ạ

Protein tái t  h p HA sau khi bi u hi n trên lá thu c lá đổ ợ ể ệ ố ược ti n hành tách chi t và tinhế ế   s ch đ  s  d ng cho thí nghi m gây đáp  ng mi n d ch trên chu t. Trong nghiên c u nàyạ ể ử ụ ệ ứ ễ ị ộ ứ   chúng tôi có s  d ng phử ụ ương pháp tinh s ch protein b ng s c ký ái l c. Nh m lo i b  s   nhạ ằ ắ ự ằ ạ ỏ ự ả   hưởng c a các protein không đ c hi u đ n ho t tính sinh h c c a kháng nguyên đích HA. Đâyủ ặ ệ ế ạ ọ ủ   là phương pháp hi u qu  đ  tinh s ch protein tái t  h p liên k t v i His­tag. Phệ ả ể ạ ổ ợ ế ớ ương pháp này  d a trên xu hự ướng t  nhiên c a histidine t o thành m t ph c h p v i các kim lo i hóa tr  II (víự ủ ạ ộ ứ ợ ớ ạ ị   d  nh  niken)   pH trung tính. S  bi u hi n kháng nguyên HA trimeric và k t  qu  tinh s chụ ư ở ự ể ệ ế ả ạ   đã được ki m tra b ng đi n di SDS­PAGE và phể ằ ệ ương pháp Western­blot (Hình 3.15.A,B).

Hình 3. 15. K t qu  bi u hi n, tinh s ch và đánh giá ho t tính protein HA trimeric.ế ả ể ệ ạ ạ

(A):  K t qu  bi u hi n HA trimeric đ c đánh giá b ng lai mi n d ch. WT: M u protein táchế ả ể ệ ượ ằ ễ ị ẫ   chi t t  cây không chuy n gen đ c s  d ng làm đ i ch ng âmế ừ ể ượ ử ụ ố ứ

(B): K t qu  tinh s ch protein HA trimeric đế ả ạ ược đánh giá b ng đi n di SDS­page và lai mi nằ ệ ễ   d ch. M: marker, RE: D ch thô, FL: D ch qua c t, W: D ch r a c t, P: D ch thu protein HAị ị ị ộ ị ử ộ ị   trimeric tinh s chạ .

3.2.2.2. K t qu  bi u hi n và ế ả ể ệ tinh s chạ  kháng nguyên HA trimeric­IgMFc b ng IMACằ

K t qu  bi u hi n đúng protein HA trimeric ế ả ể ệ IgM­Fc được đánh giá b ng Western blotằ   b ng Coomassie­blue (Hình 3.16) cho th y có v ch băng có kích thằ ấ ạ ước kho ng 1ả 00 kDa  và 33  kDa tương  ng v i ứ ớ HA trimeric dung h p IgM­Fc. ợ

Hình 3.16. K t qu  western blot ch ng t  s  bi u hi n c a kháng nguyên HA dung h p IgM­Fc vàế ả ứ ỏ ự ể ệ ủ ợ   m t trimeric dung h p IgM­Fc s  d ng kháng th  kháng c­myc. M: Marker protein 10­170 kDa; 1:ộ ợ ử ụ ể   D ch chi t protein ch a kháng nguyên HA dung h p IgM­Fc; (2): D ch chi t protein ch a m tị ế ứ ợ ị ế ứ ộ   trimeric

K t qu  tinh s ch đế ả ạ ược ki m tra b ng đi n di SDS­PAGE và lai mi n d ch (Hình 3.17)ể ằ ệ ễ ị   cho th y HA trimeric­IgMFc ch  xu t hi n m t băng m u nâu duy nh t có kích thấ ỉ ấ ệ ộ ầ ấ ước kho ngả   100 kDa . Đi u này ch ng t  HApII trimeric­IgMFc đã tinh s ch bàng ề ứ ỏ ạ phương pháp s c ký ionắ   c  đ nh kim lo iố ị ạ  v i hi u su t thu h i 72,6% và đ  tinh s ch là 89,6%.ớ ệ ấ ồ ộ ạ

Hình 3.17. K t qu  tinh s ch HA trimeric­IgMFc b ng s c ký ái l c (IMAC).ế ả ạ ằ ắ ự

3.2.2.3. K t qu  tinh s ch proten HA mono_ELP b ng mITCế ả ạ ằ

K t qu  cho th y l ng protein gi m đi r t nhi u ngay khi cho n ng đ  PEG 2%,và n ngế ả ấ ượ ả ấ ề ồ ộ ồ   đ  PEG 10% là protein m t đi nhi u nh t bao g m c  protein HA và protein t p. Tuy nhiên, k tộ ấ ề ấ ồ ả ạ ế   qu  lai mi n d ch l i   hai n ng đ  PEG 2%,và n ng đ  PEG 10%  cho th y g n nh  không cònả ễ ị ạ ở ồ ộ ồ ộ ấ ầ ư   protein t p. Phân tích hình  nh b ng ph n m m Image J cho th y   n ng đ  2% PEG 8000 là cóạ ả ằ ầ ề ấ ở ồ ộ   băng đ m nh t ậ ấ (Hình 3.18).

Hình 3.18. K t qu  t i  u n ng đ  PEG cho tinh s ch protein HA trimeric _ ELP đế ả ố ư ồ ộ ạ ược đánh  giá b ng SDS­PAGE (A) và lai mi n d ch (B).ằ ễ ị

3.3.2.1. K t qu  tinh s ch protein HA mono_ELP b ng mITCế ả ạ ằ

K t qu  ki m tra (Hình 3.19.A) cho th y   gi ng s  1 (D ch chi t thô trế ả ể ấ ở ế ố ị ế ước x  lý) xu tử ấ   hi n nhi u băng protein và trong đó có m t băng v ch đ m có kích thệ ề ộ ạ ậ ước kho ng 108 kDa.ả    gi ng s  2 không xu t hi n băng v ch (d ch chi t cây không chuy n gen), gi ng s  3 là

Ở ế ố ấ ệ ạ ị ế ể ế ố  

đ i ch ng dố ứ ương ScFv­Cmyc. Đi u này cho th y protein HA mono đã bi u hi n thành côngề ấ ể ệ   trên mô lá cây thu c lá.  ố K t qu  ch y đi n di các m u sau m i bế ả ạ ệ ẫ ỗ ước tinh s ch g m d chạ ồ ị   chi t thô trế ước x  lý, d ch ra kh i màng sau khi đ a d ch thô qua màng và d ch tinh s chử ị ỏ ư ị ị ạ   protein HA tách r a kh i màng b ng nử ỏ ằ ướ ạc l nh cho th y protein tái t  h p có g n đuôi ELPấ ổ ợ ắ   đã được gi  l i m t cách ch n l c trên màng trong khi các protein khác đi qua kh i màng thữ ạ ộ ọ ọ ỏ ể  hi n   m t băng v ch duy nh t tệ ở ộ ạ ấ ương  ng v i kích thứ ớ ước chính xác c a HA mono_ELP, vàủ   các v ch băng protein gi ng nhau gi a d ch thô và d ch đi qua màng tr  băng tạ ố ữ ị ị ừ ương  ng v iứ ớ   kích thước v i protein tái t  h p g n ELP. Gel nhu m Coomassie blue cũng cho th y proteinớ ổ ợ ắ ộ ấ   được tinh s ch b ng phạ ằ ương pháp mITC có đ  tinh s ch và n ng đ  cao (Hình 3.19.B). M cộ ạ ồ ộ ứ   đ  tinh s ch, kích thộ ạ ước protein được đánh giá b ng SDS­PAGE và lai mi n d ch (Hìnhằ ễ ị   3.19).

37

Hình 3.19. Đánh giá k t qu  tinh s ch protein HA mono_ELP b ng SDS­PAGE và lai mi nế ả ạ ằ ễ   d chị

(A). 1: D ch chi t thô ch a protein HA mono_ELP, 2: d ch chi t t  cây không chuy n gen, 3:ị ế ứ ị ế ừ ể   đ i ch ng dố ứ ương ScFv­Cmyc; M:Marker

(B).1,4: D ch chi t thô ch a protein HA mono_ELP trị ế ứ ước x  lý; 2,3: D ch chi t t  cây khôngử ị ế ừ   chuy n gen; 6,7: D ch r a màng sau khi khi đ a d ch thô qua màngể ị ử ư ị

5,8;  D ch tách r a HA mono_ELP kh i màng b ng nị ử ỏ ằ ướ ạc l nh.

3.2.2.4. K t qu  tinh s ch protein HA trimeric_ELP b ngế ả ạ ằ  mITC 

K t qu  ki m tra (Hình 3.22. A) cho th y   gi ng s  1và 2 (D ch chi t thô trế ả ể ấ ở ế ố ị ế ước x  lý)ử   xu t hi n nhi u băng protein và trong đó có hai băng v ch đ m có kích thấ ệ ề ạ ậ ước kho ng 108 kDaả   và 72 kDa. Đi u này cho th y protein HA trimeric_ELP đã bi u hi n thành công trên mô lá câyề ấ ể ệ   thu c lá. ố K t qu  ch y đi n di các m u sau m i bế ả ạ ệ ẫ ỗ ước tinh s ch g m d ch chi t thô trạ ồ ị ế ước xử  lý, d ch ra kh i màng sau khi đ a d ch thô qua màng và d ch tinh s ch protein HA tách r a kh iị ỏ ư ị ị ạ ử ỏ   màng b ng nằ ướ ạc l nh cho th y protein tái t  h p có g n đuôi ELP đã đấ ổ ợ ắ ược gi  l i m t cáchữ ạ ộ   ch n l c trên màng trong khi các protein khác đi qua kh i màng th  hi n   m t băng v ch duyọ ọ ỏ ể ệ ở ộ ạ   nh t tấ ương  ng v i kích thứ ớ ước chính xác c a HA trimeric_ELP kho ng 108 kDa (Hình 3.20.B)ủ ả   và các v ch băng protein gi ng nhau gi a d ch thô và d ch đi qua màng tr  băng tạ ố ữ ị ị ừ ương  ng kíchứ