Nghiên cứu thiết kế vector và biểu hiện gen m của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (pedv) trên cây thuốc lá nicotiana benthamiana tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN GEN M CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA TẠI VIỆT NAM” Hà Nội – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN GEN M CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA TẠI VIỆT NAM” Sinh viên thực : Tống Thị Tuyết Chi Lớp : K63CNSHC Mã sinh viên : 637209 Giáo viên hiên hướng dẫn : PGS TS Phạm Bích Ngọc TS Nơng Thị Huệ Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Luận văn thực Phịng “Cơng nghệ ADN Ứng dụng”, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn khoa học PGS TS Phạm Bích Ngọc, ThS Hồ Thị Thương, CN Trịnh Thái Vy anh chị nghiên cứu viên phịng Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, khách quan chưa sử dụng nghiên cứu khoa học Các thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 07 năm 2022 Sinh viên Tống Thị Tuyết Chi i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Bích Ngọc, Trưởng phịng “Cơng nghệ ADN Ứng dụng” định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới TS Nơng Thị Huệ tận tình hướng dẫn bảo tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán bộ môn Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện giúp tơi hồn thiện tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn chị ThS Hồ Thị Thương, chị CN Trịnh Thái Vy anh chị nghiên cứu viên phịng “Cơng nghệ ADN Ứng dụng” tạo điều kiện giúp đỡ trình suốt trình học tập, hướng dẫn tơi thiết kế hồn thành thí nghiệm đề tài Cuối cùng, tơi xin kính chúc q thầy, có thật nhiều sức khỏe ln thành cơng cơng việc Đồng kính chúc cơ, chú, anh, chị phịng “Cơng nghệ ADN Ứng dụng” ln dồi sức khỏe đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Hà Nội, ngày tháng 07 năm 2022 Sinh viên Tống Thị Tuyết Chi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.1 Nguồn gốc bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.3 Tình hình dịch bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.4 Khả lây truyền virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn (PEDV) 1.2 Tổng quan protein M 1.2.1 Tính kháng nguyên protein M 1.2.2 Vai trò cấu tạo nên virus 10 1.2.3 Ứng dụng nghiên cứu protein M sản xuất vắc xin 11 1.3 Tổng quan GCN4-pII motif (pII) 12 1.4 Tổng quan Elastin like polypeptide (ELP) 12 1.5 Hệ thống biểu protein tái tổ hợp thực vật 13 1.6 Sản xuất protein tái tổ hợp phương pháp Agroinfiltration 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Nguồn vật liệu thực vật 17 2.1.2 Chủng vi sinh vật, vector trình tự gen 17 2.1.3 Các mồi sử dụng 18 2.1.4 Hóa chất 18 2.1.5 Thiết bị 19 2.1 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 19 2.2.1.1 Phương pháp tạo vector tách dịng pRTRA mang gen mã hóa kháng ngun M 19 2.2.1.2 Phương pháp tạo vector biểu pCB301 mang gen mã hóa kháng nguyên M tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng 22 iii 2.2.2 Phương pháp biểu tạm thời kháng nguyên M tái tổ hợp thuốc Agroinfiltration 25 2.3.3 Phương pháp đánh giá mức độ biểu kháng nguyên M tái tổ hợp điện di SDS-PAGE Western blot 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Thiết kế cấu trúc vector mang gen mã hóa kháng nguyên M-pII 28 3.1.1 Thiết kế vector tách dịng mang gen mã hóa kháng nguyên M-pII 28 3.1.2 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên M-pII tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng 30 3.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen mã hóa kháng nguyên M-ELP 32 3.2.1 Thiết kế vector tách dịng mang gen mã hóa kháng nguyên M-ELP 32 3.2.2 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên M-ELP tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng 34 3.3 Thiết kế cấu trúc vector mang gen mã hóa kháng nguyên M-pII-ELP 36 3.3.1 Thiết kế vector tách dịng mang gen mã hóa kháng nguyên M-pII-ELP 37 3.3.2 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên M–pII-ELP tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng 39 3.4 Biểu tạm thời kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp thuốc N benthamiana Agroinfiltration 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Danh sách mồi sử dụng (phịng “Cơng Nghệ ADN Ứng dụng” cung cấp) 18 Bảng Thành phần phản ứng PCR nhân gen 19 Bảng Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen 20 Bảng Xử lý vector enzyme cắt giới hạn 20 Bảng Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pRTRA 21 Bảng Thành phần phản ứng Colony PCR khuẩn lạc 22 Bảng Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Colony PCR khuẩn lạc 22 Bảng Xử lý vector enzyme cắt giới hạn HindIII 23 Bảng Thành phần phản ứng nối ghép gen 23 Bảng 10 Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn 24 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh virus tiêu chảy cấp lợn chụp kính hiển vi điện tử (Jung cs., 2016; Lee cs., 2015) Hình 1.2 Mơ hình cấu trúc hạt virus PED khung đọc mở hệ gen virus PED (Lee, 2015; Sekhon cs., 2016) Hình 1.3 Lớp lơng nhung tế bào niêm mạc ruột non lợn bị nhiễm PEDV (A) lợn khỏe mạnh (B) (Zhou Y cs., 2021) Hình 2.1 Cây thuốc N benthamiana tuần tuổi trồng thuỷ canh 25 Hình 3.1 Bản đồ cấu trúc vector pRTRA_His_M_pII_cmyc_KDEL 28 Hình 3.2 Kết thiết kế vector pRTRA_His_M_pII_cmyc_KDEL 29 Hình 3.3 Bản đồ cấu trúc vector pCB301-His-M-pII-cmyc 31 Hình 3.4 Kết thiết kế vector pCB301-His-M-pII-cmyc 32 Hình 3.5 Bản đồ cấu trúc vector pRTRA_ M_His-cmyc-ELP 33 Hình 3.6 Kết thiết kế vector pRTRA_ M_His-cmyc-ELP 33 Hình 3.7 Bản đồ cấu trúc vector pCB301-M-His-cmyc-ELP 35 Hình 3.8 Kết thiết kế vector pCB301-M-His-cmyc-ELP 36 Hình 3.9 Bản đồ cấu trúc vector pRTRA_ M_pII_His_cmyc_ELP 37 Hình 3.10 Kết thiết kế vector pRTRA_ M_pII_His_cmyc_ELP 38 Hình 3.11 Bản đồ cấu trúc vector pCB301-M-pII-His-cmyc-ELP 40 Hình 3.12 Kết thiết kế vector pCB301-M-pII-His-cmyc-ELP 41 Hình 3.13 Kết biểu kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp thuốc sau 4, 5, ngày biến nạp 42 Hình 3.14 Kiểm tra mức độ biểu kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp Western blot 43 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT l Microlitter A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens aa Amino acid (axit amin) bp Base pair cs Cộng DAB Diaminobenzidine DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay ELP Elastin-like polypeptide Hc-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) His Histidine HRP Horseradish peroxidase IgG Immunoglobulin G Kb Kilobase kDa Kilodalton KDEL ER retrieval signal LB Luria-Bertani medium (môi trường nuôi khuẩn LuriaBertani) M Membrane protein MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid mg milligram vii ml milliliter N benthamiana Nicotiana benthamiana N tabacum Nicotiana tabacum nm nanomet OD Optical density (mật độ quang) ORF Open Reading Frame PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus pII GCN4-pII motif RNA Ribonucleic acid SAP Shrimp alkaline phosphatase SARS-CoV Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis UTR Untranslated region v/p vòng/phút v/s vòng/giây VLP Virus like particle w/v weight per volume viii hóa kháng nguyên M gắn kết pII-ELP vector biến nạp thành công vào khuẩn E coli 10G 3.3.2 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên M–pIIELP tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng Đoạn gen chứa cassette biểu sau thu nhận cách xử lý với vector pRTRA-M-pII-ELP tái tổ hợp HindIII, chèn vào vector pCB301 vị trí HindIII Với pCB301, để tránh tượng đóng vịng, sản phẩm cắt sau tinh xử lý tiếp với enzyme SAP (Shrimp alkaline phosphatase - enzyme có tác dụng loại bỏ gốc 5’- phosphate ADN, làm cho gốc 5’- phosphate khơng kết hợp với OH, tránh hình thành liên kết với phosphodieste giúp vector khơng bị đóng vịng) Dòng khuẩn E coli 10G mang vector pCB301 tái tổ hợp lựa chọn phản ứng Colony PCR (sử dụng cặp mồi 35S-SQF/pspOMI-Mopti-R) phản ứng cắt chọn dòng plasmid tái tổ hợp pCB301 enzyme NcoI Các plasmid pCB301 tái tổ hợp biến nạp vào chủng A tumefaciens AGL1 phương pháp xung điện (Mersereau cs., 1990) Sản phẩm trình biến nạp cấy trải đĩa peptri chứa mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh 50 mg/l rifamycin, 50 mg/l carbenicilin, 50 mg/l kanamycin Ủ đĩa 28oC ngày Các dịng khuẩn dương tính AGL1 chọn lọc phản ứng Colony PCR 39 Hình 3.11 Bản đồ cấu trúc vector pCB301-M-pII-His-cmyc-ELP Kết điện di sản phẩm Colony PCR sử dụng cặp mồi 35S-SQF pspOMI-Mopti-R (hình 3.12 A) cho thấy dòng khuẩn E coli 10G xuất đoạn gen có kích thước khoảng 900 bp (bằng kích thước đoạn gen M + 200 bp), điều với tính tốn lý thuyết Hình 3.12 B kết kiểm tra dịng khuẩn E coli 10G xử lý enzyme NcoI cho băng vạch trùng với kích thước tính tốn lý thuyết 4871 bp 3863 bp Kết Colony PCR sử dụng cặp mồi 35S-SQF/pspOMI-M-R kiểm tra dòng khuẩn A tumefaciens AGL1 cho thấy dòng khuẩn có băng vạch sáng rõ, kích 40 thước khoảng 900 bp (trùng kích thước lý thuyết tính tốn gen M + 200 bp) (hình 3.12 C) Hình 3.12 Kết thiết kế vector pCB301-M-pII-His-cmyc-ELP A Kết Colony PCR khuẩn E coli 10G sau nối đoạn M xử lý với HindIII vào vecror pCB301; B Kết điện di sản phẩm sau xử lý với enzyme NcoI chọn lọc dòng khuẩn pCB301 tái tổ hợp mang gen mã hóa MpII-ELP; C Kết chọn dòng khuẩn AGL1 mang vector tái tổ hợp Colony PCR Marker: kb Như vậy, thiết kế thành công cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên M gắn kết pII ELP tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng Đây nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích sản xuất kháng nguyên M virus PEDV phương pháp biểu protein tạm thời Agroinfiltration 3.4 Biểu tạm thời kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp thuốc N benthamiana Agroinfiltration Trong nghiên cứu này, kháng nguyên tái tổ hợp M-pII, M-ELP M- pII-ELP biến nạp vào thuốc hệ thống biểu tạm thời Agroinfiltration nhờ chủng A tumefaciens AGL1 Sau biến nạp chủng khuẩn AGL1 mang gen mã hóa kháng nguyên M tái tổ hợp vào thuốc lá, chúng tơi nhận thấy mơ có thay đổi màu sắc chất lượng theo ngày Cụ thể cấu trúc, vào ngày thứ 4, 5, sau biến nạp, có 41 tượng khảm héo úa vàng (hình 3.13) Sự biểu tạm thời kháng nguyên M PEDV tái tổ hợp đánh giá phản ứng Western blot Ưu điểm phương pháp giá thành rẻ, bước thí nghiệm đơn giản, dễ thao tác phát xác khối lượng, kích thước protein tái tổ hợp Ngồi Western blot, chúng tơi sử dụng phương pháp ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) Phương pháp sử dụng chủ yếu miễn dịch học để phát diện kháng thể kháng nguyên mẫu dựa màu sắc thông qua đo mật độ OD quang học bước sóng khác Hình 3.13 Kết biểu kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp thuốc sau 4, 5, ngày biến nạp (D4, D5, D6 tương ứng với ngày 4, 5, 6) Sự biểu M-pII, M-ELP M-pII-ELP thuốc phát phương pháp Western blot Trong đó, mức độ biểu 42 protein M có gắn kết pII M gắn kết pII-ELP thấp nhiều so với mức độ biểu protein M gắn kết ELP (hình 3.14) Sự biểu cấu trúc M có dung hợp ELP mạnh Sự biểu protein mục tiêu thuốc lồi N benthamiana thí nghiệm tương đối mạnh, cấu trúc vector biểu mang gen mã hoá protein M dung hợp với ELP làm tăng cường mức độ biểu protein tái tổ hợp Mức độ biểu protein M đồng thời protein HC-Pro thuốc N benthamiana phương pháp Agroinfiltration nhờ chủng AGL1 đạt giá trị cao ngày thứ sau biến nạp Hình 3.14 Kiểm tra mức độ biểu kháng nguyên M (PEDV) tái tổ hợp Western blot (Primary anti body: his-tag; Second anti body: goat anti-mouse IgG cộng hợp HRP, phát DAB có bổ sung H2O2) D4, D5, D6 tương ứng với ngày 4, 5, Marker: PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa 43 Nghiên cứu gần Khamis, Zayn cộng năm 2016 việc tối ưu hóa trình tự gen dẫn đến việc thay đổi đáng kể mức độ biểu protein thực vật Khi protein mục tiêu ER dung hợp ELP hydrophobin (HFBI), có băng ELP-ER dẫn đến tích tụ protein M mức độ biểu cao biểu tạm thời N benthamiana (Conley cs., 2009; Joensuu cs., 2010) Sự biểu protein M PEDV tái tổ hợp phát thuốc số nguyên nhân: Các protein M biểu lưới nội chất gắn vào vector có trình tự KDEL Đây trình tự thiết kế có mặt vector biểu gen mã hoá protein tái tổ hợp pCB301-M-pII nhằm hướng protein nghiên cứu tới lưới nội chất giúp protein hoàn thiện cấu trúc, chức ổn định tế bào thực vật Do đó, protein mục tiêu tránh phân cắt protease nội bào Đây nguyên nhân làm tăng mức độ biểu protein đích tế bào thực vật protein tích luỹ nhiều lưới nội chất Ngoài ra, protein tái tổ hợp dung hợp với ELP tích lũy lên tới 25% protein tổng số hạt (Scheller cs., 2006) Điều chứng minh thành công phương pháp biểu tạm thời virus PEDV từ thuốc N benthamiana thời gian ngắn Nhìn chung, nghiên cứu cho thấy protein dung hợp ELP tăng cường tích luỹ protein tái tổ hợp từ đến 100 lần Có thể giảm mức độ nhạy cảm protein dung hợp ELP protease thực vật (Zhang cs., 1996) giảm khả bị thủy phân (Chilkoti cs., 2001) Sự đa dạng ELP cải thiện độ hòa tan protein, giảm biến tính protein đặc (TrabbicCarlson cs., 2004) Protein dung hợp ELP gắn tín hiệu dẫn tới lưới nội chất tích lũy thuốc (Conley cs., 2010) hạt (Floss cs., 2009) Những protein tích luỹ bảo vệ khỏi phân hủy 44 protein phân giải nhằm loại trừ chúng khỏi hoạt động sinh lý bình thường (Conley cs., 2010) Vì vậy, dung hợp ELP vào kháng nguyên mục tiêu sửa đổi có lợi cần thiết cho việc tăng sản lượng protein tái tổ hợp tích tụ protein trình thu hồi protein từ dịch chiết thơ thực vật (Floss Conrad, 2010) Do đó, trình tự gen mã hố protein M dung hợp với ELP cấu trúc vector biểu tạo thành protein dung hợp ELP nguyên nhân làm tăng mức độ biểu protein tái tổ hợp mô thuốc ELP chứng minh khơng ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch protein mục tiêu dung hợp ELP Như nghiên cứu này, việc dung hợp ELP với protein M lý giúp cho phân tử M-ELP có khả tăng kích thước, trọng lượng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt Kết góp phần chứng minh thành công phương pháp biểu tạm thời Sự đồng biểu với gen mã hóa protein Hc-Pro làm tăng mức độ biểu protein đích Mức độ biểu protein đích tốt ngày thứ Đối với hệ thống biểu thực vật, mức độ biểu protein thường bị cản trở chế câm gen phiên mã sau phiên mã (Fagard M cs., 2000) Trong việc thiết kế vector chuyển gen mang gen M, lựa chọn cấu trúc vector có cassette gen chuyển đảo chiều để biểu tạm thời protein mục tiêu thuốc Đây lý để tăng cường mức độ biểu gen tạm thời Tất lý nêu góp phần làm tăng mức độ biểu ba loại protein đích tế bào thực vật Đây sở để chúng tơi lựa chọn cấu trúc vector biểu pCB301-M-pII, pCB301-M-ELP, pCB301-M-pII-ELP cho nghiên cứu khẳng định thành công việc biểu tạm thời protein tái tổ hợp thuốc phương pháp Agroinfiltration nhờ chủng A tumefaciens AGL1 để sản xuất kháng nguyên virus PED phát 45 triển từ thực vật Đồng thời, kết góp phần chứng minh ưu điểm nhanh, đơn giản phương pháp biểu tạm thời đánh giá mức độ biểu cấu trúc vector chuyển gen 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế thành công 03 cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen mang gen mã hóa kháng nguyên M tái tổ hợp gắn kết pII, ELP pII-ELP tạo chủng A tumefaciens AGL1 mang vector tương ứng Đã biểu thành công protein M-pII, M-ELP M-pII-ELP thuốc phương pháp Agroinfiltration với điều kiện biểu tạm thời tối ưu, mật độ vi khuẩn (OD600 = 1) Kiến nghị Trên sở kết đạt được, để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu, đề xuất số kiến nghị sau: Biểu tinh protein M nhằm định hướng ứng dụng cho việc sản xuất vắc xin hệ Ứng dụng hệ thống biểu tạm thời phương pháp Agroinfiltration để biểu protein tái tổ hợp khác thực vật 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Antoine AF de V, Marian CH, Peter JMR, Raoul J de G (1997) The Genome Organization of the Nidovirales: Similarities and Differences between Arteri-, Toro-, and Coronaviruses" Seminars in Virology (1): 33–47 Arakawa T, Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997) Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants Transgenic Research 6: 403413 Arndt AL, Larson BJ, Hogue BG (2010) A conserved domain in the coronavirus membrane protein tail is important for virus assembly J Virol 84:11418-11428 Arndt K, Fink GR GCN4 protein, a positive transcription factor in yeast, binds general control promoters at all 5’ TGACTC 3’ sequences Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83:8516–20 doi: 10.1073/pnas.83.22.8516 Cavanagh D Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae Arch Virol 1997;142:629–633 Chang CY, Cheng IC, Chang YC, Tsai PS, Lai SY, Huang YL, et al Identification of neutralizing monoclonal antibodies targeting novel conformational epitopes of the porcine epidemic diarrhoea virus spike protein Sci Rep (2019) 9:2529 doi: 10.1038/s41598-019-39844-5 Chasey D, Cartwright SF Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhoea Res Vet Sci 1978;25(2):255–6 Epub 1978/09/01 Chiou HY, Huang YL, Deng MC, Chang CY, Jeng CR, Tsai PS, et al Phylogenetic analysis of the spike (S) gene of the new variants of porcine epidemic diarrhoea virus in Taiwan Transbound Emerg Dis (2015) 64:157–66 doi: 10.1111/tbed.12357 Conley AJ, Joensuu JJ, Jevnikar A, Menassa R and Brandle JE (2009) Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants Biotechnol Bioeng 103(3): 562-573 10 Curtiss, R.I., and Cardineau,C.A (1990) Oral immunisation by transgenic plants World Patent Application 1990, WO90/02484 11 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001) Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants Trends Plant Sci 6:219226 12 De Groot RJ, Baker SC, Baric R, Enjuanes L, Gorbalenya AE, Holmes KV, Perlman S, Poon L, Rottier PJ, Talbot PJ, Woo PC, Ziebuhr J (2012) Family Coronaviridae Virus Taxonomy 806–828 13 de Haan CAM, Kuo L, Masters PS, Vennema H, Peter JMR (1998) Coronavirus Particle Assembly: Primary Structure Requirements of the Membrane Protein J Virol 72: 6838-6850 14 de Haan CAM, Vennema H, Peter JMR (2000) Assembly of the coronavirus envelope: homotypic interactions between the M proteins J Virol 74: 4967-4978 15 Deblaere R, Bytebier B, De Greve H, Deboeck F, Schell J, Van Montagu M, et al Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacteriummediated gene transfer to plants Nucleic Acids Res (1985) 13:4777–88 doi:10.1093/nar/13.13.4777 48 16 Deng, F., Ye, G., Liu, Q., Navid, M.T., Zhong, X., Li, Y., et al (2016) Identification and comparison of receptor binding haracteristics of the spike protein of two porcine pidemic diarrheavirus strains Viruses doi: 10.3390/v8030055 17 Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, and Laude H (1994) Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF Virology 198(2):466-476 18 Fagard M, Vaucheret H (2000) (Trans)gene silencing in plants: how many mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51:167-194 19 Fischer,R., and Emans,N (2000) Molecular farming of pharmaceutical proteins Transgenic Research 9:279-299 20 Floss D and Conrad U (2010) Expression of complete antibodies in transgenic plants In Antibody Engineering; pp 489–502 Berlin, Heidelberg: Springer 21 Floss DM, Sack M, Arcalis E, Stadlmann J, Quendler H, Rademacher T, Stoger E, Scheller J, Fischer R and Conrad U (2009) Influence of elastin- like peptide fusions on the quantity and quality of a tobacco-derived human immunodeficiency virusneutralizing antibody J Plant Biotechnol.(7): 899–913 22 Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T A switch between two-, three-, and fourstranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants Science (1993) 262:1401– 7.doi: 10.1126/science.8248779 23 Ho, T T., Nguyen, G T., Pham, N B., Le, V P., Trinh, T B N., Vu, T H., … Chu, H H (2020) Plant-Derived Trimeric CO-26K-Equivalent Epitope Induced Neutralizing Antibodies Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus Frontiers in Immunology, 11 doi:10.3389/fimmu.2020.02152 24 Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK (2002) Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants Transgenic Res 1: 447-454 25 Ji, CM, Wang B, Zhou J, Huang YW (2018) Aminopeptidase-N-independent entry of porcine epidemic diarrhea virus into Vero or porcine small intestine epithelial cells Virology 517:16–23 26 Joensuu JJ, Conley AJ, Lienemann M, Brandle JE, Linder MB and Menassa R (2010) Hydrophobin fusions for high-level transient protein expression and purification in Nicotiana benthamiana Plant Physiol 152: 622-633 27 Jung K, Saif LJ Porcine epidemic diarrhea virus infection: Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis Vet J (2015) 204:134– 43 doi:10.1016/j.tvjl.2015.02.017 28 Laemmli U.K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259): 680-5 29 Laude H, Gelfi J, Lavenant L, Charley B (1992) Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus J Virol 66:743-749 30 Lee C (2015) Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus Virol J 12:193 31 Lee S, Kim Y, Lee C Isolation and characterization of a Korean porcine epidemic diarrhea virus strain KNU-141112 Virus Res 2015;208:215–24 32 Li B, Du L, Yu Z, Sun B, Xu X, Fan B, Guo R, Yuan W, He K Poly (d, l-lactide-coglycolide) nanoparticle-entrapped vaccine induces a protective immune response 49 against porcine epidemic diarrhea virus infection in piglets Vaccine 2017;35:7010– 7017 33 Li BX, Ge JW, Li YJ (2007) Porcine aminopeptidase N is a functional receptor for the PEDV coronavirus Virology 365:166–72 34 Liu J, Sun Y, Qi J, Chu F, Wu H, Gao F, Li T, Yan J, Gao GF (2010) The membrane protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus acts as a dominant immunogen revealed by a clustering region of novel functionally andstructurally defined cytotoxic T-lymphocyte epitopes J Infect Dis 202:1171-1180 35 Mason HS, Lam DM, RNAtzen CJ (1992) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants PNAS USA 89: 11745-11749 36 Mersereau, M., Pazour, G.J., and Das, A (1990) Efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens by electroporation Gene 90: 149-151 37 Meyer DE and Chilkoti A (1999) Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides Nat Biotechnol 17(11): 1112-1115 38 Mogler, M.A., Gander, J.R., Ray, D.D., Harris, D.L., 2014b Vaccination of PEDVnaïve dams with replicon RNA particle vaccine protects suckling piglets from challenge North American PRRS Symposium, abstract 75 39 Nguyen VP, Hogue BG (1997) Protein interactions during coronavirus assembly J Virol 71(12):9278-84 40 Opressnig T (2016) Porcine epidemic diarrhea (PED) in Europe and strategies to control outbreaks Jap J Vet Res 64:35–38 41 Patel J, Zhu H, Menassa R, Gyenis L, Richman A and Brandle J (2007) Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves Transgenic Res 16(2): 239–249 42 Pensaert MB, de Bouck P (1978) A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine Arch Virol 58:243–7 43 Pensaert MB, Martelli P (2016) Porcine epidemic diarrhea: a retrospect from Europe and matters of debate Virus Res 226:1–6 44 Phan HT, Ho TT, Chu HH, Vu TH, Gresch U, Conrad U Neutralizing immune responses induced by oligomeric H5N1-hemagglutinins from plants Vet Res (2017) 48:53 doi: 10.1186/s13567-017-0458-x 45 Phan HT, Pohl J, Floss DM, Rabenstein F, Veits J, Le BT, et al ELPylated haemagglutinins produced in tobacco plants induce potentially neutralizing antibodies against H5N1 viruses in mice Plant Biotechnol J (2013) 11:582–93 doi: 10.1111/pbi.12049 46 Phan, H.T.; Pham, V.T.; Ho, T.T.; Pham, N.B.; Chu, H.H.; Vu, T.H.; Abdelwhab, E.M.; Scheibner, D.; Mettenleiter, T.C.; Hanh, T.X.; Meister, A.; Gresch, U.; Conrad, U Immunization with Plant-Derived Multimeric H5 Hemagglutinins Protect Chicken against Highly Pathogenic Avian Influenza Virus H5N1 Vaccines 2020, 8, 593 47 Pospischi A., A Stuedli and M Kiupel (2002) Diagnostic notes: update on porcine epidemic diarrhea Journal of Swine Health and production 10 pp 81-85 48 Prasad,V., Satyavathi,V.V., Sanjaya, Valli,K.M., Khandelwal,A., Shaila,M.S., and Lakshmi Sita,G (2004) Expression of biologically active Hemagglutinin-neuraminidase protein of Peste des petits ruminants virus in transgenic pigeonpea [Cajanus cajan (L) Millsp.] Plant Science 166:199-205 49 Saif LJ (1993) Coronavirus immunogens Vet Microbiol 37(3-4):285-97 50 50 Sambrook, J., and Russell, D.W (2006) Transformation of E coli by electroporation Cold Spring Harbor Protocols 2006: pdb.prot3933 51 Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, Hutchison CA, Slocombe PM, Smith M (1977) Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA Nature 265(5596):687-695 52 Scheller J, Leps M, and Conrad U (2006) Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptids Plant Biotechnology Journal 4(2): 243-249 53 Schillberg,S., Fischer,R., and Emans,N (2003) Molecular farming of recombinant antibodies in plants Cellular and Molecular Life Sciences 60:433445 54 Schulz LL, Tonsor GT (2015) Assessment of the economic impacts of porcine epidemic diarrhea virus in the United States J Anim Sci 93:5111–5118 55 Sekhon SS, Nguyen P, Ahn J, Lee K, Lee L, Kim SY, Yoon H, Park J, Ko JH, Kim Y (2016) Porcine epidemic diarrhea (PED) infection, diagnosis and vaccination: A mini review Toxicol Environ Health Sci 8: 277–289 56 Shenyang G, Enhui Z, Baoxian L, Xinyuan Q, Lijie T, Junwei G, Yijing L (2007) High-level prokaryotic expression of envelope exterior of membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus Vet Microbiol.123:187-193 57 Shirato K, Maejima M, Islam MT, Miyazaki A, Kawase M, Matsuyama S, Taguchi F (2016) Porcine aminopeptidase N is not a cellular receptor of porcine epidemic diarrhea virus, but promotes its infectivity via aminopeptidase activity J Gen Virol 97:2528–2539 58 Silhavy D, Burgya´n J (2004) Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs Trends Plant Sci 9(2): 76–83 59 Song D, Park B (2012) Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines Virus Genes 44:167–175 60 Song D, Moon H, Kang B (2015) Porcine epidemic diarrhea: a review of current epidemiology and available vaccines Clin Exp Vaccine Res 166-76 61 Streatfield SJ and JA Howard (2003) Plant-based vaccines Int J Parasitol 33:479493 62 Sun RQ, Leng ZM, Zhai SL, Chen DK, Song CX (2014) Genetic variability and phylogeny of current Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains based on spike, ORF3, and membrane Genes Sci 1-8 63 Sun, R.Q., Cai, R.J., Chen, Y.Q., Liang, P.S., Chen, D.K., Song, C.X (2012) Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China Emerg Infect Dis 18:161¬3 64 Topp E, Irwin R, McAllister T, Lessard M, Joensuu JJ, Kolotilin I, et al The case for plantmade veterinary immunotherapeutics Biotechnol Adv (2016) 34:597–604 doi: 10.1016/j.biotechadv.2016.02.007 65 Trabbic-Carlson K, Liu L, Kim B and Chilkoti A (2004) Expression and purification of recombinant proteins from Escherichia coli: comparison of an elastin-like polypeptide fusion with an oligohistidine fusion Protein Sci 13(12): 3274–3284 66 Utiger A, Tobler K, Bridgen A, Ackermann M (1995) Identification of the membrane protein of porcine epidemic diarrhoea virus Virus Genes 10:137–148 51 67 Vennema H, Godeke G, Rossen J, Voorhout W, Horzinek M, Opstelten D, Rottier P (1996) Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like particles by coexpression of viral envelope protein genes EMBO Journal 15: 2020 68 Verwoerd,T.C., van Paridon, P.A., van Ooyen,A.J., van Lent,J.W., Hoekema,A., and Pen,J (1995) Stable accumulation of Aspergillus niger phytase in transgenic tobacco leaves Plant Physiology 109:1199-1205 69 Wagner,B., Fuchs,H., Adhami,F., Ma,Y., Scheiner,O., and Breiteneder,H (2004) Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana Methods 32:227-234 70 Walls AC, Tortorici MA, Bosch BJ, Frenz B, Rottier PJM, DiMaio F Cryoelectron microscopy structure of a coronavirus spike glycoprotein trimer Nature (2016) 531:114–7 doi: 10.1038/nature16988 71 Xing J, Liu S, Han Z, Shao Y, Li H, Kong X (2009) Identification of a novel linear Bcell epitope in the M protein of avian infectious bronchitis coronaviruses J Microbiol 47:589-599 72 Xu X., Zhang H., Zhang Q., Dong J., Huang Y., Tong D Porcine epidemic diarrhea virus M protein blocks cell cycle progression at S-phase and its subcellular localization in the porcine intestinal epithelial cells Acta Virol 2015;59:265–275 73 Xue S, Jaszewski A, Perlman S (1995) Identification of a CD4+ T cell epitope within the M protein of a neurotropic coronavirus Virology 208:173-179 74 Zhang Q., Ke H., Blikslager A., Fujita T., Yoo D Type III interferon restriction by porcine epidemic diarrhea virus and the role of viral protein nsp1 in IRF1 signaling J Virol 2018;92(4) 75 Zhang X, Urry DW and Daniell H (1996) Expression of an environmentally friendly synthetic protein-based polymer gene in transgenic tobacco plants Plant Cell Rep 16(3-4): 174–179 76 Zhang Z, Chen J, Shi H, Chen X, Shi D, Feng L, Yang B (2012) Identification of a conserved linear B-cell epitope in the M protein of porcine epidemic diarrhea virus Virol J 9:225 77 Zhou Y, Ren Z, Zhang S, Wang H, Wu S, Bao W Analysis of Intestinal Mucosa Integrity and GLP-2 Gene Functions upon Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infection in Pigs Animals (Basel) 2021 Mar 1;11(3):644 doi: 10.3390/ani11030644 PMID: 33804466; PMCID: PMC8000733 Tiếng Việt Lê Văn Phan, Trịnh Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Thu Huyền, Vũ Xuân Đăng, (2020) Đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus dịch tả lợn châu phi phân lập số tỉnh miền bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(10): 803-811 Nguyễn Quang Đức Tiến, Lê Quang Mẫn, Nguyễn Duy Khiêm, Đặng Thị Trang, Nguyễn Ngọc Lương (2018) Tạo dòng vi khuẩn Escherichia Coli mang vector biểu kháng nguyên S1C S1C-CT24 virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 127(1C): 33–41 Nguyễn Tất Toàn, Đỗ Tiến Duy (2012) Đặc trưng kiểu gen virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) heo số tỉnh miền Đơng Nam Bộ Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y 19(7): 34 - 41 Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Qt, Trịnh Thị Thanh, Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Thị Thu Năm (2012) Phát virus gây 52 tiêu chảy cấp (PEDV) heo tỉnh miền Đơng Nam Bộ Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y, 19(5): 23 - 28 Vũ Huyền Trang, Hồ Thị Thương, Lê Thu Ngọc, Nguyễn Thu Giang, Trịnh Thái Vy, Phan Trọng Hồng, Phạm Bích Ngọc, Hồng Thị Thu Hằng, Chu Hoàng Hà (2020) Nghiên cứu biểu kháng nguyên S1 tái tổ hợp virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn (porcine epidemic diarrhea virus) thuốc Nicotiana benthamiana Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2011, 19(1): 95-105 53