Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp helper dependent adenovirus mang gen mã hóa interleukin 12 người và định hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN VIỆT HÀ Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người định hướng ứng dụng LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN VIỆT HÀ Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người định hướng ứng dụng Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Hoàng Quốc Trường Hà Nội - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn cơng trình nghiên cứu thực thực hướng dẫn khoa học Tiến sĩ Hoàng Quốc Trường, khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108 Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố hình thức Tôi xin chịu trách nhiệm kết nghiên cứu Học viên Nguyễn Việt Hà Lời cảm ơn Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quốc Trường trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, TS Bs Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Việt Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG 10 MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Tổng quan liệu pháp gen 13 1.2 Vector adenovirus 15 1.2.1 Đặc điểm sinh học adenovirus 15 1.2 Chu kỳ nhân lên adenovirus 17 1.2.2.1 Quá trình bám xâm nhập vào bên tế bào 17 1.2.2.2 Gen sớm trình chép ADN 19 1.2.2.3 Gen muộn đóng gói virus 21 1.2.3 Các hệ vector adenovirus 21 1.2.3.1 Vector adenovirus hệ thứ 22 1.2.3.2 Vector adenovirus hệ thứ hai 23 1.2.3.3 Helper-Dependent Adenovirus (HDAd) 24 1.3 Tổng quan Interleukine-12 ngƣời 26 1.3.1 Cấu trúc Interleukine-12 26 1.3.2 Vai trò Interleukine-12 điều trị ung thƣ 27 1.3.3 Một số nghiên cứu giới Việt Nam sử dụng hệ vector adenovirus mang gen IL12 nghiên cứu điều trị ung thƣ 28 1.4 Công nghệ Gateway 31 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Nguyên liệu………………………………………………… 35 2.2 Hóa chất, thiết bị 37 2.2.1 Hóa chất 37 2.2.2 Thiết bị, máy móc 39 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Phƣơng pháp khuếch đại gen phản ứng PCR 40 2.3.2 Phƣơng pháp điện di gel agarose 41 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự axit nucleic 41 2.3.4 Phƣơng pháp tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu IL12 ngƣời vào vector thể nhận pENTR/D-TOPO 43 2.3.4.1 Khuếch đại hộp gene biểu IL12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 43 2.3.4.2 Tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu IL12 người vào vector thể nhận pENTR/D-TOPO 45 2.3.4 Phƣơng pháp thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu gen mã hóa Interleukine-12 ngƣời (HDAd-GFP-Felix12) 48 2.3.5 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 50 2.3.5.1 Nuôi cấy dòng tế bào Q293A 293Cre4 từ stock 50 2.3.5.2 Cấy chuyển tế bào 51 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá khả biểu vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) dịng tế bào Q-293A 51 2.3.6.1 Cắt mở vòng vector HDAd-GFP/Felix12 51 2.3.6.2 Chuyển gen vào dòng tế bào Q293A sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) 53 2.3.6.3 Phương pháp tách chiết tinh ARN 54 2.3.6.4 Kĩ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR) 55 2.3.6.5 Khuếch đại cDNA phản ứng PCR 56 2.3.7 Phƣơng pháp sản xuất virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) dịng tế bào 293Cre4 57 2.3.7.1 Chuyển gen vào dòng tế bào 293Cre4 sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) 57 2.3.7.2 Nhiễm helper virus H14 vào tế bào 293Cre4 chuyển gen 57 2.3.7.3 Nuôi cấy tăng sinh số lượng virus HDAd-GFP-Felix12 57 2.3.7.4 Kiểm tra đánh giá kết sản xuất virus HDAd-GFP-Felix12 59 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Kết tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 ngƣời, CMV promoter - IL12B(p40) – Linker - IL12A(p35) - bGH_pA từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 vào vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO 62 3.1.1 Kết khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 ngƣời từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 62 3.1.2 Kết tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 ngƣời vào vector entry pENTR/D-TOPO 63 3.1.3 Kết giải trình tự xác nhận hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 ngƣời vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO 65 3.2 Kết thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu gen mã hóa Interleukine-12 ngƣời 67 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 phản ứng LR tái tổ hợp 67 3.2.2 Kết giải trình tự xác định vùng nối đầu 5’ đầu 3’ trình tự hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 ngƣời vector HDAd-GFP-DEST 70 3.3 Kết đánh giá khả biểu vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12ngƣời dòng tế bào Q-293A 72 3.3.1 Kết chuyển vector HDAd-GFP/Felix12/NotI vào dòng tế bào Q293A 72 3.3.2 Kết đánh giá khả biểu vector virus HDAd-GFP/Felix12 dòng tế bào Q-293A 74 Chƣơng IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 Tài liệu tham khảo 81 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (+) : Đối chứng dương (-) : Đối chứng âm Ad : Adenovirus ADN : Acid Deoxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleic bp : base pair cDNA : Complementary DNA DNase I : Deoxyribonuclease I dNTPs : Deoxynucleotide TriPhosphates GAPDH : Gryceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase H2 O : Nước HDAd : Helper-Dependent Adenovirus HEK : Human Embryonic Kidney hIL-12 : Interleukine-12 người (human Interleukine-12) IFN-γ : Interferon-gamma kb : kilobase kDa : kilo Dalton LB : Luria Bertani LR : Lamda reconstruction mARN : Messenger ARN PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RT-PCR : TAE : Phản ứng phiên mã ngược (Reverse Transcription Polymerase) Chain Reaction) Đệm Tris - Acetate– EDTA DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Cấu trúc adenovirus 16 Hình Quá trình bám xâm nhập tế bào Adenovirus 18 Hình Mơ q trình vận chuyển vào nhân tế bào Ad2 19 Hình Sơ đồ phiên mã hệ gen adenovirus type 20 Hình Sơ đồ cấu trúc hệ gen adenovirus type hệ vector adenovirus 22 Hình Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper dependent adenovirus sử dụng hệ thống Cre/loxP 26 Hình Cấu trúc phân tử Interleukine-12 27 Hình Tái tổ hợp tương đồng phage lamda tế bào E coli 32 Hình Sơ đồ mơ tả công nghệ Gateway ứng dụng chế tái tổ hợp tương đồng phage lamda tế bào E coli 33 Hình 10 Sơ đồ cấu trúc vector pcDNA3.1(+)/Felix12 (Vector 1) 35 Hình 11 Sơ đồ cấu trúc vector pENTR/D-TOPO (Vector 2) 36 Hình 12 Sơ đồ cấu trúc vector HDAd-GFP-DEST (Vector 3) 37 Hình 13 Sơ đồ trình sản xuất virus Helper - dependent Adenovirus 58 Hình 14 Kết điện di sản phẩm khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 62 Hình 15 Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại hộp gene biểu IL12 người, CMV– Felix12–bGH_PA entry vector pENTR/D-TOPO phản ứng plasmid PCR 64 Hình 16 Kết điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR/D-TOPO mang không mang hộp gene biểu IL12 người, CMV–Felix12–bGH_PA 65 Hình 17 Sơ đồ vị trí cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết kế biểu IL12 người vector pENTR/D-TOPO 66 Hình 18 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh 04 đoạn gene tương ứng với trình tự 2566 bp hộp gene biểu IL12 người 67 Hình 19 Sơ đồ vị trí cặp mồi pC4HSU phát có mặt hộp gen mang thiết kế biểu IL-12 người CMV promoter-IL12(p40)-Linker-IL12(p35)-bGH_pA vector HDAd-GFPDEST 68 Hình 20 Kết điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu IL12 người vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU phản ứng Clony-PCR 69 Hình 21 Kết điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu IL12 người vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU phản ứng PCR 69 Hình 22 Sơ đồ vị trí cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết kế biểu IL12 người vector HDAd-GFP-DEST 71 Hình 23 Kết điện di sản phẩm khuyếch đại sản phẩm tinh sử dụng cặp mồi pC4HSUFor&P2 P5&pc4HSURev 71 Hình 24 Kết giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu Il12 người vector HDAdGFP-DEST 72 Hình 25 Hình ảnh ni cấy dịng tế bào Q-293Atrên mơi trường nuôi cấy DMEM low glucose Ảnh chụp sử dụng vật kính 20X 73 Hình 26 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 enzyme giới hạn NotI 74 Hình 27 Hình ảnh tế bào Q-293A biểu protein phát huỳnh quang GFP sau 24h chuyển gen với vector HDAd-GFP/Felix-12 cắt mở vòng với enzyme giới hạn NotI 75 Hình 28 Kết điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước sau xử lý loại ADN enzyme ADNse I 75 Hình 29 Kết RT-PCR kiểm tra khả biểu gen mã hóa IL-12 GFP dịng tế bào Q-293A với RNA xử ý DNaseI 76 Hình 30 Hình ảnh ni cấy dịng tế bào 293Cre4 môi trường nuôi cấy MEMα Ảnh chụp sử dụng vật kính 20X 77 hình 27 cho thấy vector HDAd-GFP/Felix-12 chuyển thành cơng vào dịng tế bào Q-293A, mức độ biểu protein huỳnh quang GFP quan sát sau 24 giờ, hiệu suất chuyển gen chúng tơi tính tốn đạt 20% (số liệu khơng trình bày luận văn này) Hình 27: Hình ảnh tế bào Q-293A biểu protein phát huỳnh quang GFP sau 24h chuyển gen với vector HDAd-GFP/Felix-12 cắt mở vòng với enzyme giới hạn NotI Hình 28 Kết điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước sau xử lý loại ADN enzyme ADNse I Giếng M: Thang chuẩn ADN kb (Fermentas) Giếng 13: Các mẫu RNA tổng số xử lý với ADNse I Giếng 1: Q-293A: Dòng tế bào Q-293A (Đối chứng); Giếng 2: Q-293A sau 24 chuyển gen (IL-12/24h); Giếng 3: Q-293A sau 48 chuyển gen (IL-12/48h); Giếng (+): Đối chứng dương (mẫu RNA tổng số trước xử lý) 75 Kết hình 28 cho thấy giếng từ 1-3 mẫu RNA tổng số xử lý ADNseI, băng điện di không xuất chứng tỏ khơng cịn ADN mẫu RNA tổng số Đối chứng dương mẫu RNA tổng số không xử lý enzyme ADNse I Nhận thấy đối chứng dương lên băng với kích thước 496 bp, tương ứng với sản phẩm khuếch đại cặp mồi nội chuẩn GAPDH Kết chứng tỏ, trình xử lý RNA ADNse I đạt chất lượng tốt, loại bỏ hoàn toàn ADN mẫu RNA tổng số RNA sau xử lý sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cDNA Tiếp theo, sử dụng 1µl cDNA làm khn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế Felix12 dùng cho phản ứng RT-PCR cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa GFP Song song với đó, chúng tơi tiến hành khuếch đại gen GAPDH Đây gen thể tế bào, không phụ thuộc vào nguồn gốc, trạng thái hoạt động tế bào Do vậy, gen mã hóa GAPDH sử dụng gen nội chuẩn để đánh giá chất lượng sản phẩm mARN vào làm thước đo chuẩn cho nồng độ khn cho phản ứng RT-PCR khuếch đại gen mã hóa IL-12 Hình 29 Kết RT-PCR kiểm tra khả biểu gen mã hóa IL-12 GFP dòng tế bào Q-293A với RNA xử ý DNaseI Giếng Q-293A: Dòng tế bào Q-293A (Đối chứng); Giếng 2: Q-293A sau 24 chuyển gen (IL-12/24h); Giếng 3: Q293A sau 48 chuyển gen (IL-12/48h); Giếng (-): Đối chứng âm khơng có khn cDNA; Giếng (+): Đối chứng dương-Plasmid HDAd-GFP/Felix12 Kết phản ứng khuếch đại GAPDH cho thấy việc tách chiết ARN tổng số từ mẫu nghiên cứu kỹ thuật RT-PCR thành công cho kết tốt Đồng 76 thời, đánh giá khả biểu gen mã hóa IL12 người vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 dòng tế bào Q-293A mức độ mARN thời gian 24h 48h sau chuyển gen Kết PCR phiên mã ngược hình 28 khẳng định vector virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix-12 chứa hộp gen mang thiết kế biểu GFP hIL-12 biểu thành công mức độ mRNA gfp hIL-12, mức độ protein protein phát huỳnh quang GFP 3.4 Kết bƣớc đầu tạo virus tái tổ hợp HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) dịng tế bào 293Cre4 Dịng tế bào 293Cre4 ni cấy mơi trường MEMα có bổ sung 15% FBS, 1% peniciin/streptomycin 0,8% G418 Sau hai lần cấy chuyển, số lượng tế bào 293Cre4 đạt 2,0x106 tế bào/1 đĩa ni cấy (đường kính 60mm), độ bao phủ 90% Hình 29 hình ảnh tế bào 293Cre4 sau hai lần cấy chuyển tế bào từ stock Kết cho thấy, tế bào mọc tốt môi trường nuôi cấy, không nhiễm, đạt yêu cầu cho thí nghiệm Hình 30 Hình ảnh ni cấy dịng tế bào 293Cre4 mơi trường ni cấy MEMα Ảnh chụp sử dụng vật kính 20X Quy trình tiến hành sản xuất virus HDAd-GFP-Felix 12 mô tả phần phương pháp nghiên cứu Sau 48h đồng nhiễm thời điểm P0, toàn tế bào 293Cre4 bị ly giải hoàn toàn (CPE, cytopathic Effect) có hình thành virus Tại thời điểm cấy chuyển nhiễm virus P1, P2 P3 77 xảy tượng tương tự (Hình 30) Sự biểu protein phát huỳnh quang GFP sử dụng để đánh giá có hay khơng tạo thành virus tái tổ hợp Helper dependent adenovirus mang biểu gen đích, gfp Interleukin 12 người Kết hình 30 mơ tả hình ảnh ly giải tế bào bước đầu tạo virus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 pha P0 sau 48h chuyển gen đồng nhiễm với MOI virus H14 Hình 31: Hình ảnh tế bào 293Cre4 sau 48 chuyển gen với vector virus HDAdGFP-Felix 12 đồng nhiễm với virus H14 Để kiểm tra chứng minh diện virus HDAd-GFP-Felix12 thời điểm P, tiến hành thu tế bào tách chiết ADN tổng số, sau tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thiết kế IL12 (RT-Felix12 For&Rev), cặp mồi đặc hiệu cho gen GFP (GFPFor&Rev) 78 A B Hình 32 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thiết kế A) cặp mồi đặc hiệu cho gen GFP (GFPFor&Rev), B) cặp mồi đặc hiệu IL12 (RT-Felix12 For&Rev) Giếng 1-5: mẫu ADN thời điểm P0, P1, P2, P3, P4; Giếng (-): ADN dòng tế bào 293Cre4, đối chứng âm; Giếng (+): plamsid HDAd-GFP-Felix12, đối chứng dương; M: Thang chuẩn ADN 50bp (Fermentas) Kết điện di hình 31 cho thấy, với mồi GFP, mẫu thời điểm P0, P1, P2, P3, P4 khuếch đại băng đặc hiệu với kích thước 717bp trùng với kích thước mẫu đối chứng dương plasmid Trong sử dụng ADN tách chiết từ dịng tế bào 293Cre4 khơng xuất băng đặc hiệu cho gfp Như vậy, nhận thấy tất thời điểm từ P0 đến P4, đoạn gene mã hóa cho gen GFP ln tồn tại, chứng tỏ vector virus HDAd-GFP-Felix12 trì suốt q trình tạo đóng gói virus tái tổ hợp Mặt khác, với mồi RT-Felix12, mẫu thời điểm P0, P1, P2, P3, P4 cho băng đặc hiệu trùng với kích thước 300 bp đối chứng dương Như vậy, khẳng định bước đầu virus HDAd-GFPFelix12 tạo thành công sau lần cấy chuyển tế bào nhiễm virus HDAd-GFP-Felix12 79 Chƣơng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu được, đưa kết luận sau: Tách dòng thành công hộp gen mang thiết kế biểu Interleukin 12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 vào vector pENTR/D-TOPO Thiết kế thành công vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 mang hộp gen biểu IL-12 người (HDAd-GFP/Felix12) Đánh giá khả biểu mức độ mARN vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix 12 mang gen mã hóa cho IL-12 người dòng tế bào Q-293A Bước đầu tạo virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix 12 biểu gen mã hóa IL-12 người dịng tế bào 293Cre4 KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu chúng tôi: Sản xuất virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 quy mơ phịng thí nghiệm xác định hiệu giá virus Đánh giá khả nhiễm hiệu biểu IL-12 người virus tái tổ hợp dòng tế bào 293Cre4 dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá khả ức chế ung thư in vitro in vivo virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 80 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Lê Thanh Hòa (2009), “Hệ thống vector adenovirus: công cụ hữu hiệu dẫn truyền gen kháng ngun tạo vaccine hệ mới”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(3), tr 269-283 Lê Thanh Hòa cộng (2010), “ Thiết kế plasmid thoi pSHUTTLE-CMV mang hộp gen VP2 virus Gumboro để tạo vector adenovirus tái tổ hợp”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3), tr 281-289 Tiếng Anh Anderson, C.W., Young, M.E., Flint, S.J (1989), “Characterization of the adenovirus virion protein, mu”, Virology, 172, pp 506-512 Amalfitano A et al (1998), “Productioncharacterization of improved adenovirus vectors with the E1, E2b, E3 genes deleted”, TheJournal of Virology, 72, pp 926-933 Bebia Z et al (2001), “Adenovirus-directed expression of functional luteinizing hormone (LH) receptors in undifferentiated rat granulosa cells, evidence for differential signaling through follicle-stimulating hormoneLH receptors”, Endocrinology, 142, pp 2252-2259 Ben-Israel, H., and Kleinberger, T (2002), “Adenovirus and cell cycle control”, Front Biosci 7, pp 369–395 Bennett, E.M., Bennink, J.R., Yewdell, J.W., and Brodsky, F.M (1999), “Cutting edge: Adenovirus E19 has two mechanisms for affecting class I MHC expression”, J Immunol., 162, pp 5049–5052 Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, Horwitz MS, Crowell RL, Finberg RW (1997), “Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses and 5”, Science 275, pp 1320–1323 Berk, A.J et al (1986), “Adenovirus promoters and E1A transactivation”, Annu Rev Genet, 20, pp 45–79 10 Borman, A.M., Le Mercier, P., Girard, M., and Kean, K.M (1997), “Comparison of picornaviral IRES-driven internal initiation of translation in cultured cells of different origins”, Nucleic Acids Res 25, pp 925–932 81 11 Burcin M.M (1999), “Adenovirus-mediated regulable target gene expression in vivo”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, pp 355-360 12 Bruno Sangro, Guillermo Mazzolini, Juan Ruiz, Maite Herraiz, Jorge Quiroga, Ignacio Herrero, Alberto Benito, Javier Larrache, Jesus Pueyo, Jose Carlos Subtil, Cristina Olaguăe, Josu Sola, Belộn Sadaba, Carlos Lacasa, Ignacio Melero, Cheng Qian, and Jesus Prieto (2004), “Phase I Trial of Intratumoral Injection of an Adenovirus Encoding Interleukin-12 for Advanced Digestive Tumors” J Clin.Oncol 22, pp 1389–1397 13 Bruder, J.T., Jie, T., Mcvey, D.L., and Kovesdi, I (1997), “Expression of gp19Kn increases the persistence of transgene expression from an adenovirus vector in the mouse lung and liver”, Journal of Virology, 71, pp 7623–7628 14 Chan C.W (2006), “Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innateadaptive immunity”, Nature Medicine, 12, pp.207-213 15 Chattopadhyay, D., Ghosh, M.K., Mal, A., And Harter, M.L (2001), “Inactivation of p21 by E1A leads to the induction of apoptosis in DNA-damaged cells”, Journal of Virology, 75, pp 9844–9856 16 Cohen, J (1995) “IL-12 deaths: Explanation and a puzzle”, Science 270, pp 908 17 Cohen-HaguenauerO (1996), “Gene therapy in Europe”, Transfusion Science, 17, pp.185-190 18 Dai, Y., Schwarz, E.M., Gu, D., Zhang, W.W., Sarvetnick, N., and Verma, I.M (1995), “Cellular and humoral immune responses to adenoviral vectors containing factor IX gene: Tolerization of factor IX and vector antigens allows for long-term expression”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, pp 1401–1405 19 Dedieu J.F et al (1997), “Long-term gene delivery into the livers of immunocompetent mice with E1/E4-defective adenoviruses”, Journal of Virology, 71, pp 4626-4637 20 Del Vecchio M (2007), “Interleukin-12, biological propertiesclinical application”, Clinical Cancer Research, 13, pp.4677-4685 82 21 Eisenring, M., J vom Berg, et al (2010) "IL-12 initiates tumor rejection via lymphoid tissue-inducer cells bearing the natural cytotoxicity receptor NKp46." Nat Immunol, 11, pp 1030-1038 22 Ernstoff, M.S., Nair, S., Bahnson, R.R., Miketic, L.M., Banner, B., Gooding, W., Day, R., Whiteside, T., Hakala, T., and Kirkwood, J.M (1990), “A phase IA trial of sequential administration recombinant DNA-produced interferons: Combination recombinant interferon gamma and recombinant interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma”, J Clin.Oncol, 8, pp 1637–1649 23 Finnen, R.L., Biddle, J.F., And Flint, J (2001), “Truncation of the human adenovirus type L4 33-kDa protein: Evidence for an essential role of the carboxy-terminus in the viral infectious cycle”, Virology 289, pp 388–399 24 Gaggar A, Shayakhmetov DM, Lieber A.(2003), “CD46 is a cellular receptor for group B adenoviruses”, Nature Medicine, 9, pp 1408–1412 25 Gao P P., Y Yang andJ.M Wilson (1996), “Biology of adenovirus vectors with E1 and E4 deletions for liver-directed gene therapy”, Journal of Virology, 70, pp 89348943 26 Gorziglia M.I et al (1996), “Elimination of both E1 and E2 from adenovirus vectors further improves prospects for in vivo human gene therapy”, Journal of Virology, 70, pp 4173-4178 27 Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., and Nairn, R (1977), “Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5”, J Gen Virol 36, pp 59–74 28 Hearing, P., Samulski, R.J., Wishart, W.L., And Shenk, T (1987), “Identification of a repeated sequence element required for efficient encapsidation of the adenovirus type chromosome”, Journal of Virology 61, pp 2555–2558 29 Honda, T., Saitoh, H., Masuko, M., Katagiri-Abe, T.,Tominaga, K., Kozakai, I., Kobayashi, K., Kumanishi,T., Watanabe, Y.G., Odani, S., And Kuwano, R (2000), “The coxsackievirus–adenovirus receptor protein as a cell adhesion molecule in the developing mouse brain”, Brain Res Mol Brain Res 77, pp 19–28 83 30 Kelkar, S.A., Pfister, K.K., Crystal, R.G., and Leopold, P.L (2004), “Cytoplasmic dynein mediates adenovirus binding to microtubules”, Journal of Virology 78, pp 10122–10132 31 Li, E., Stupack, D., Bokoch, G M & Nemerow, G R (1998), “Adenovirus endocytosis requires actin cytoskeleton reorganization mediated by Rho family GTPases”, Journal of Virology 72, pp 8806-8812 32 Lieschke, G.J., Rao, P.K., Gately, M.K., and Mulligan, R.C (1997), “Bioactive murine and human interleukin-12 fusion proteins which retain antitumor activity in vivo”, Nat Biotechnol, 15, pp 35–40 33 Leader B., Q.J Baca andD.E Golan (2008), “Protein therapeutics, a summarypharmacological classification”, Nature Reviews Drug Discovery, 7, pp 21-39 34 Leonard, J.P., Sherman, M.L., Fisher, G.L., Buchanan, L.J., Larsen, G., Atkins, M.B., Sosman, J.A., Dutcher, J.P., Vogelzang, N.J., and Ryan, J.L (1997), “Effects of single dose interleukin-12 exposure on interleukin-12–associated toxicity and interferongamma production”, Blood, 90, pp 2541–2548 35 Leppard K.N (1997), “E4 gene function in adenovirus, adenovirus vectoradenoassociated virus infections”, TheJournal of General Virology, 78, pp 2131-2138 36 Loser, P., Jennings, G.S., Strauss, M., and Sandig, V (1998) “Reactivation of the previously silenced cytomegalovirus major immediate-early promoter in the mouse liver: Involvement of NfkappaB”, J Virol 72, pp 180–190 37 Ma X., G Trinchieri (2001), “Regulation of interleukin-12 production in antigenpresenting cells”, Advances in Immunology, 79, pp 55-92 38 Mackall C.L., T.J Fry andR E Gress (2011), “Harnessing the biology of IL-7 for therapeutic application”, Nature Reviews Immunology, 11, pp 330-342 39 Mangel, W.F., Baniecki, M.L., And Mcgrath, W.J (2003), “Specific interactions of the adenovirus proteinase with the viral DNA, an 11-amino-acid viral peptide, and the cellular protein actin”, Cell Mol Life Sci 60, pp 2347–2355 40 Matthews, D A & Russell, W C (1995), “Adenovirus protein±protein interactions: molecular parameters governing the binding of protein VI to hexon and the activation of the adenovirus 23K protease”, Journal of General Virology 76, pp 1959-1969 84 41 Marcellus R.C (1996), “Adenovirus type early region is responsible for E1Ainduced p53-independent apoptosis”, TheJournal of Virology, 70, pp 6207-6215 42 Meier, O., Boucke, K., Hammer, S.V., Keller, S., Stidwill, R.P., Hemmi, S., and Greber, U.F (2002), “Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake” , J Cell Biol 158, pp 1119–1131 43 Mette, S A., Pilewski, J., Buck, C A & Albelda, S M (1993), “Distribution of integrin cell adhesion receptors on normal bronchial epithelial cells and lung cancer cells in vitro and in vivo”, American Journal of Research in Respiratory Cell and Molecular Biology 8, pp 562-572 44 Miguel Barajas, Guillermo Mazzolini, Guillem Genove, Roberto Bilbao, Inigo Narvaiza, Volker Schmitz, Bruno Sangro, Ignacio Melero, Cheng Qian, And Jesus Prieto, (2001), “Gene therapy of Orthotopic Hepatocellular Carcinoma in Rats Using Adenovirus Coding for Interleukin 12”, Hepatology, 33, pp 52-61 45 NgP P et al (2002), “Cre levels limit packaging signal excision efficiency in the Cre/loxP helper-dependent adenoviral vector system”, Journal of Virology, 76, pp 4181-4189 46 Nomura S (2004), “Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helperdependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia”, Gene Therapy, 11, pp 1540-1548 47 Palmer D.,Ng P P (2003), “Improved system for helper-dependent adenoviral vector production”, Molecular Therapy, 8, pp 846-852 48 Rauma, T., Tuukkanen, J., Bergelson, J M., Denning, G & Hautala, T (1999), “rab5 GTPase regulates adenovirus endocytosis”, Journal of Virology 73, pp 9664-9668 49 Robbins D., H Tahara andS.C Ghivizzani (1998), “Viral vectors for gene therapy”, Trends in Biotechnology, 16, pp 35-40 50 Rodriguez-Galan, M C., D Reynolds, et al (2009) "Coexpression of IL-18 strongly attenuates IL-12-induced systemic toxicity through a rapid induction of IL-10 without affecting its antitumor capacity." J Immunol 183, pp 740-748 85 51 Rosewell A., F Vetrini and P P.Ng (2011), “Helper-Dependent Adenoviral Vectors”, Journal of Genetic Syndrome & Gene Therapy, Suppl 52 Rowe W (1953), “Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture”, Proceedings of the Society for Experimental BiologyMedicine, 84, pp 570-573 53 Sakhuja K et al (2003), “Optimization of the generationpropagation of gutless adenoviral vectors”, Human Gene Therapy, 14, pp 243-254 54 Schiedner G et al (1998), “Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results in improved in vivo gene expressiondecreased toxicity”, Nature Genetics, 18, pp 180-183 55 Schiedner G et al (2002), “Variables affecting in vivo performance of high-capacity adenovirus vectors”, Journal of Virology, 76, pp 1600-1609 56 Sig V et al (2000), “Optimization of the helper-dependent adenovirus system for productionpotency in vivo”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, pp 1002-1007 57 Shenk, T et al (1996), “Adenoviridae: The viruses and their replication in virology”, Lippincott-Raven, New York, pp 2111-2148 58 Smythe W.R (1995), “Treatment of experimental human mesothelioma using adenovirus transfer of the herpes simplex thymidine kinase gene”, Annals of Surgery, 222, pp 78-86 59 Stewart, P.L., Chiu, C.Y., Huang, S., Muir, T., Zhao, Y., Chait, B., Mathias, P., and Nemerow, G.R (1997), “Cryo-EM visualization of an exposed RGD epitope on adenovirus that escapes antibody neutralization”, EMBO J 16, pp 1189– 1198 60 Suzuki M (2010), “Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral vectors using adherent cells in cell factories”, Human Gene Therapy, 21, pp 120-126 86 61 Tollefson, A.E., Ryerse, J.S., Scaria, A., Hermiston, T.W., And Wold, W.S (1996a), “The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: Characterization of cells infected with adp mutant”, Virology 220, pp 152–162 62 Tollefson, A.E., Scaria, A., Hermiston, T.W., Ryerse, J.S., Wold, L.J., And Wold, W.S (1996b), “The adenovirus death protein (E3-11.6K) is required at very late stages of infection for efficient cell lysis and release of adenovirus from infected cells”, Journal of Virology 70, pp 2296–2306 63 Tomko RP, Xu R, Philipson L (1997), “HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94, pp 3352–3356 64 Trapnell B.C., M Gorziglia (1994), “Gene therapy using adenoviral vectors”, Current opinion in Biotechnology, 5, pp 617-625 65 Trinchieri G (2003), “Interleukin-12the regulation of innate resistanceadaptive immunity”, Nature Reviews Immunology, 3, pp 133-146 66 Wang H (2005), “A capsid-modified helper-dependent adenovirus vector containing the beta-globin locus control region displays a nonrom integration patternallows stable, erythroid-specific gene expression”, Journal of Virology, 79, pp 10999-10013 67 Weiss J.M, J J Subleski, et al (2007), “Immunotherapy of cancer by IL-12-based cytokine combinations”, Expert Opinion on Biological Therapy, 7, pp 1705-1721 68 http://www.genetherapynet.com/types-of-gene-therapy.html 69 http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_12 87 Phụ lục Kết giải trình tự hộp gen biểu IL-12 người (CMV promoter-IL-12B (p40)–Linker–IL-12A(p35)-bGH_pA) entry vector pENTR-D/TOPO CAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCT TTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCCGTTGACATTGATTA TTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGA GTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCC CGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGT GTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAG CGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT TTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAA CTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAC CCAAGCTGGCTAGCTAGGCCACCATGGGACATCAGCAGCTGGTCATCTCATGGTTTAGTC TGGTGTTTCTGGCAAGCCCCCTGGTGGCAATCTGGGAACTGAAAAAGGACGTGTACGTGGT CGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCTCCAGGAGAAATGGTGGTCCTGACTTGCGACACCCCT GAGGAAGATGGCATCACTTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGATCCGGCAAAA CACTGACTATTCAGGTCAAGGAATTCGGGGACGCAGGACAGTACACATGTCACAAGGGCGG GGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAAGAAGATGGAATCTGGTCCACT GACATTCTGAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAAACCTTCCTGAGATGCGAAGCCAAAAA TTATTCTGGGAGGTTTACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCAGTACAGATCTGACTTTTTCAGT GAAGTCTAGTAGAGGGTCATCTGATCCACAGGGAGTCACATGTGGAGCAGCTACTCTGAGC GCCGAGCGGGTGAGAGGAGATAACAAGGAGTACGAATATTCTGTCGAGTGCCAGGAAGACA GTGCCTGTCCAGCAGCCGAGGAAAGCCTGCCCATCGAAGTGATGGTCGATGCTGTGCACAA GCTGAAATACGAAAACTACACATCCTCTTTCTTTATTAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCC TAAGAACCTGCAGCTGAAACCTCTGAAGAATAGCCGCCAGGTGGAGGTCTCCTGGGAATAC CCCGACACCTGGTCTACACCTCATTCATATTTCAGCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTCCAGGG CAAGTCCAAACGAGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACTGATAAAACCTCTGCCACAGTCATCT GTCGAAAGAACGCTTCTATTAGTGTGAGGGCACAGGATCGCTACTATAGTTCAAGCTGGTCC 88 GAGTGGGCATCTGTGCCATGTAGTGGAGGCGGGGGAAGCGGCGGGGGAGGCTCCGG GGGAGGCGGGTCTAGAAATCTGCCTGTGGCAACACCTGACCCTGGAATGTTCCCATGCCT GCACCATTCACAGAACCTGCTGCGCGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCTCGACAGACC CTGGAGTTTTACCCTTGTACAAGTGAGGAAATCGACCACGAGGATATTACCAAGGATAAAAC CAGCACAGTGGAAGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACAAAGAACGAATCATGTCTGAATAGC CGGGAGACTTCCTTCATCACCAACGGCTCTTGCCTGGCTAGTAGAAAGACCAGCTTCATGAT GGCACTGTGCCTGTCCTCTATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAATTCAAAACCA TGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAACGGCAGATCTTTCTGGATCAGAATATGCTGGCA GTGATTGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAATAGCGAAACAGTCCCTCAGAAGAGTTC ACTGGAGGAACCAGACTTTTACAAGACTAAAATCAAGCTGTGCATTCTGCTGCATGCCTTTAG GATTCGCGCAGTGACTATTGATCGAGTGATGAGTTATCTGAATGCTAGTTAAGGGCCCGTTT AAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCC TCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAA TGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTG GGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGC GGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGGCCGCACTCGAGATATCTAGACCCAGCTTTCTTGTAC AAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGT CAAAATAAAATCATTATTTG Chú thích: Trình tự màu tím tương ứng với trình tự CMV promoter, trình tự màu xanh in nghiêng tương ứng trình tự gen mã hóa cho tiểu phần IL-12B(p40), trình tự Linker màu đỏ, trình tự màu cam tương ứng với trình tự gen mã hóa tiểu phần IL-12A(p35), trình tự màu xanh tương ứng với trình tự bGH_pA 89 ... chuyển gen mã hóa cho Interleukine -12 người 11 mục tiêu phải đạt thực đề tài ? ?Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người định hướng ứng dụng? ??... cập nghiên cứu Do vậy, đề tài: ? ?Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper 33 Dependent Adenovirus mang gene mã hóa Interleukin 12 người định hướng ứng dụng? ?? thực với mục tiêu: - Thiết kế vector. .. nhận mang hộp gene biểu Interleukin 12 người - Thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang hộp gene biểu Interleukin 12 người - Bước đầu đánh giá khả nhiễm hiệu biểu IL -12 người