CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.6.5. Khuếch đại cDNA bằng phản ứng PCR
Sản phẩm cDNA sau khi tổng hợp sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi của gen nội chuẩn GAPDH (For&Rev), cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa IL-12
(RT-IL12 For/Rev), cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa GFP (For/Rev). Thành phần
và chu kỳ nhiệt của phản ứng được trình bày trong Bảng 10.
Bảng 10. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá sự biểu hiện của
gen mã hóa IL-12
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 2X Mastermix Promega 12,5 2) Primer Forward (10 pM) 1,0 3) Primer Reverse (10 pM) 1,0 4) Khuôn cDNA 1,0 5) H2O cho PCR 9,5 Tổng thể tích 25,0
57
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 58oC, 30 giây; 72oC, 45 giây]; 72oC, 7 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
2.3.7. Phƣơng pháp tạo virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) trên dòng tế bào 293Cre4
2.3.7.1. Chuyển gen vào dòng tế bào 293Cre4 sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) (Invitrogen)
Vector HDAd-GFP/Felix12 để có thể chuyển vào trong dòng tế bào 293Cre4 cũng được tiến hành cắt mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn NotI (quy trình đã được trình bày ở phần 2.3.6.1).
Quy trình chuyển vector HDAd-GFP/Felix12 vào trong dịng tế bào 293Cre4 sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) được tiến hành theo quy trình đã được trình bày ở phần 2.3.6.2)
2.3.7.2. Nhiễm helper virus H14 vào trong tế bào 293Cre4 đã chuyển gen
Quy trình:
- Sau 1 ngày chuyển gen, loại bỏ hồn tồn mơi trường ni cấy.
- Bổ sung 1ml mơi trường MEM (CM, khơng chứa kháng sinh) có bổ sung virus H14 (5MOI) vào đĩa tế bào 293Cre4 đã được chuyển gen.
- Lắc nhẹ nhàng đĩa nuôi cấy, cứ 15 phút lại tiến hành lắc 1 lần. Lặp lại 4 lần. - Theo dõi, quan sát hình thái tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.
2.3.7.3. Ni cấy và tăng sinh số lượng virus HDAd-GFP-Felix12
Quy trình ni cấy tăng sinh tạo virus tái tổ hợp HDAd-GFP-Felix 12 được thực hiện đúng theo quy trình tạo và tăng sinh virus tái tổ hợp của Hãng Microbix, bao gồm các bước sau:
58
- Bước 1: Sau 2 ngày đồng nhiễm, cặn tế bảo 293Cre4 sẽ được phá hủy để ly giải ra các hạt virus HDAd-GFP-Felix12 bằng phương pháp “giã đông-làm lạnh” liên tục 4 lần. Sản phẩm thu được ở bước này được đánh dấu P0.
- Bước 2: Trộn virus HDAd-GFP-Felix12 pha P0 với 1ml mơi trường MEM-α có bổ sung virus H14 (1MOI).
- Bước 3: Chuyển hỗn dịch trên vào đĩa nuôi cấy tế bào 293Cre4 mới (độ che phủ phải đạt trên 70%). Lắc nhẹ nhàng đĩa nuôi cấy, cứ 15 phút lại tiến hành lắc 1 lần. Lặp lại 4 lần.
- Bước 4: Theo dõi kiểm tra tế bào sau 2 ngày chuyển nhiễm tiếp theo, virus thu được ở bước này được đánh dấu P1.
Lặp lại các bước 1, 2 , 3 để tăng sinh số lượng virus HDAd-GFP-Felix12.
Sơ đồ quá trình tạo và tăng sinh virus tái tổ hợp Helper - dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người được mơ tả trong Hình 13.
59
2.3.7.4. Kiểm tra đánh giá kết quả sản xuất virus HDAd-GFP-Felix12
Các mẫu tế bào thu được sau các thời điểm P được tiến hành tách chiết ADN theo quy trình như sau:
- Hịa tan cặn tế bào bằng 300µl dung dịch NaOH 50mM, ủ 95oC trong vòng 20 phút.
- Bổ sung 64µl Tris HCl pH 7 vào hỗn dịch, úp ngửa.
- Bổ sung 400µl dung dịch Cloroform vào trong hỗn dịch, ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4o
C
- Hút dịch nổi ở pha trên sang một ống eppendoff mới, bổ sung tỷ lệ 1V : 1V isopropanol (để lạnh), úp ngửa 5-6 lần. Để tủa nhiệt độ thường trong vòng 20 phút. Ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 500µl dung dịch Etanol 70% (để lạnh), ly tâm 13200 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, tránh hút phải cặn. Bước này được lặp lại 2 lần.
- Làm khô tự nhiên trong 20 phút.
- Thơi ADN bằng 100µl nước vơ trùng (nuclear free water), ủ 56oC trong 10 phút.
- Bảo quản ở -20oC.
Các mẫu ADN sau khi được tách chiết sẽ được tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa IL-12 (RT-IL12 For/Rev), cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa GFP (For/Rev). Thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng được trình bày trong Bảng 11.
60
Bảng 11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá kết quả sản xuất virus
HDAd-GFP-Felix12 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 2X Mastermix Promega 12,5 2) Primer Forward (10 pM) 1,0 3) Primer Reverse (10 pM) 1,0 4) Khuôn ADN 5,0 5) H2O cho PCR 5,5 Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 58oC, 30 giây; 72oC, 45 giây]; 72oC, 7 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
61
62
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 ngƣời, CMV promoter - IL12B(p40) – Linker - IL12A(p35) - bGH_pA từ vector promoter - IL12B(p40) – Linker - IL12A(p35) - bGH_pA từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 vào vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO
3.1.1. Kết quả khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 ngƣời từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 vector pcDNA3.1(+)/Felix12
Để khuếch đại thành công hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người có kích thước 2566bp từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12, chúng tơi sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu (H1&H2) cho thiết kế Felix12.
A B
Hình 14. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-
12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12. (A) Sản phẩm PCR khuếch đại hộp gen
mang thiết kế biểu hiện IL12 người từ các khuẩn lạc số 1, 2, 3 (giếng 1, 2, 3); giếng số 4: đối chứng âm. (B) Sản phẩm PCR khuếch đại hộp gen mang thiết kế IL12 người sau khi
63
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 14) cho thấy sản phẩm khuếch đại ở giếng số 1, 2, 3 chỉ cho một băng duy nhất. Đối chiếu với thang ADN chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR đúng với dự kiến là 2566 bp. Như vậy, có thể kết luận sơ bộ trình tự hộp gen biểu hiện IL-12 người (CMV promoter- IL12B(p40)-Linker-IL12A(p35)-bGH_pA) đã được khuếch đại thành công từ
vector pcDNA3.1(+)/Felix12. Sản phẩm này được tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific), đảm bảo chất lượng để tiến hành tách dòng vào vector pENTR/D-TOPO.
3.1.2. Kết quả tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 ngƣời vào vector entry pENTR/D-TOPO vector entry pENTR/D-TOPO
Q trình tách dịng được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR sau khi tinh sạch vào vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO để tạo “entry clone” pENTR/D- TOPO/Felix12. Thành phần và điều kiện phản ứng tách dịng đã được mơ tả trong phần ngun liệu và phương pháp. Sản phẩm PCR sau khi gắn vào vector pENTR/D-TOPO sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH-5α, sử dụng kháng sinh Kanamycin để chọn lọc khuẩn lạc. Để sàng lọc sơ bộ trong số những khuẩn lạc thu được, khuẩn lạc nào mang vector chứa đoạn chèn, khuẩn lạc nào khơng có, chúng tơi tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu
(H1&H2) của thiết kế Felix12. Sản phẩm của phản ứng Colony-PCR được kiểm tra
điện di trên gel agarose 0,8%. Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc thu được có mang vector tái tổ hợp hay không, chúng tôi tiến hành tách plasmid từ khuẩn lạc nghi ngờ, sử dụng plasmid làm khuôn với cặp mồi đặc hiệu vector M13. Kết quả ở hình 15 cho thấy plasmid tái tổ hợp tách từ các khuẩn lạc số 2, 3, 7 cho băng khuếch đại kích thước khoảng 2,96 kb đặc hiệu đúng với kích thước của các dịng pENTR/D-TOPO chứa hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người. Còn plasmid tái tổ hợp tách từ khuẩn lạc số 5 cho băng kích thước đặc hiệu bằng đúng với kích thước của dịng pENTR/D-TOPO khơng chứa hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người ở đường chạy số 5 (kích thước 309bp).
64
Hình 15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại hộp gene biểu hiện IL12
người, CMV–Felix12–bGH_PA trong entry vector pENTR/D-TOPO bằng phản ứng plasmid PCR. M, Thang ADN chuẩn; Đường chạy 1–4, sản phẩm khuếch đại hộp gene biểu hiện IL12 từ khuẩn lạc số 2, 3, 5, 7; Đường chạy 5, sản phẩm khuếch đại từ vector pENTR/D-TOPO; Đường chạy 6, chứng âm.
Song song với việc kiểm tra bằng phản ứng plasmid PCR, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra phổ của các plasmid tách được từ các khuẩn lạc nghi ngờ trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di cho thấy, các plasmid thu được từ các khuẩn lạc số 2, 3 và 7 có kích thước phổ plasmid cao hơn so với phổ plasmid của vector pENTR/D- TOPO chứng tỏ các khuẩn lạc này đã mang thiết kế biểu hiện IL12 người.
65
Hình 16. Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR/D-TOPO mang và
không mang hộp gene biểu hiện IL12 người, CMV–Felix12–bGH_PA. M, Thang ADN chuẩn 1kb (Bioneer); Đường chạy 1–4, tương ứng plasmid tái tổ hợp 2, 3, 5 và 7; Đường chạy 5, vector pENTR-D/TOPO (chứng âm).
Như vậy, có thể kết luận trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người
CMV promoter-IL12(p40)-Linker-IL12(p35)-bGH_pA đã được tách dịng thành
cơng vào vector entry pENTR/D-TOPO.
3.1.3. Kết quả giải trình tự xác nhận hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 ngƣời trong vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO ngƣời trong vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO
Để xác định chính xác trình tự của hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 trong vector thể nhận pENTR/D-TOPO, chúng tôi thiết kế sử dụng 4 cặp mồi
M13F&P2; P3&P4; P5&P6 và P5&M13R theo sơ đồ Hình 17, để tiến hành khuếch đại các đoạn gen tương ứng với các kích thước 1107bp, 1000bp, 565bp, 739bp.
66
Hình 17. Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL12 người trong vector pENTR/D-TOPO. Cặp mồi M13F&2 cho sản phẩm PCR có kích thước 1107bp. Cặp mồi P3&P4 cho sản phẩm PCR có kích thước 1000bp. Cặp mồi P5&P6 cho sản phẩm PCR có kích thước 565bp. Cặp mồi P5&M13R cho sản phẩm PCR có kích thước 739bp.
Sản phẩm PCR khuếch đại từ các cặp mồi này được tiến hành tinh sạch và giải trình tự trực tiếp trên hệ thống máy xác định trình tự tự động CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter. Kết quả giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong entry vector pENTR/D-TOPO được mô tả trong phần Phụ lục.
67
Hình 18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch của 04 đoạn gene tương
ứng với trình tự 2566 bp của hộp gene biểu hiện IL12 người. Đường chạy số 1–4, tương ứng với sản phẩm gene khuếch đại sử dụng cặp mồi M13F&P2 (kích thước 1107bp); P3&P4 (kích thước 1000bp); P5&P6 (kích thước 565bp) và P5&M13R (kích thước 767bp). M: Thang ADN chuẩn 100bp.
So sánh kết quả giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện, CMV promoter-
IL12B(p40)-Linker-IL12A(p35)-bGH_pA trong vector pENTR/D-TOPO với trình
tự gốc trong vector pcDNA3.1(+)/Felix12, chúng tôi khẳng định hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người đã được tách dịng thành cơng vào vector pENTR/D- TOPO.
3.2. Kết quả thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu hiện gen mã hóa Interleukine-12 ngƣời
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng phản ứng LR tái tổ hợp
Theo đúng nguyên tắc của kỹ thuật Gateway đã được trình bày ở phần Tổng quan tài liệu, chúng tơi thực hiện chuyển tồn bộ thiết kế hộp gen biểu hiện IL-12 từ
68
entry vector pENTR/D-TOPO sang vector HDAd-GFP-DEST để tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng phản ứng tái tổ hợp LR (LR recombination).
Sản phẩm của phản ứng tái tổ hợp LR sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli Stbl3. Vì vector HDAd-GFP-DEST có cấu trúc mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol (CmR) và gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trưởng cho tế bào E. Coli gây độc và làm chết tế bào, cịn vector tái tổ hợp HDAd- GFP/Felix12 thì khơng có do thiết kế gen biểu hiện IL-12 người được chèn vào thay thế. Do đó, các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với đĩa có trải kháng sinh chọn lọc Ampicilin (Amp) nhưng cho kết quả âm tính với đĩa có trải kháng sinh chọn lọc chloramphenicol (CmR) được chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR clony với cặp mồi đặc hiệu pC4HSU (For&Rev) của vector HDAd-GFP-DEST.
Cặp mồi pC4HSU có vị trí gắn đặc hiệu trên vector HDAd-GFP-DEST cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thước 2,6 kb hoặc 2,3 kb tương ứng với các dịng mang và khơng mang plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 (Hình 19).
Hình 19. Sơ đồ vị trí cặp mồi pC4HSU phát hiện sự có mặt của hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL-12 người, CMV promoter-IL12(p40)-Linker-IL12(p35)-bGH_pA, trong vector HDAd-GFP-DEST.
69
Hình 20. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng Clony-PCR. Giếng M: Thang chuẩn ADN 1kb (Fermentas); Giếng 1, 8: Đối chứng dương-vector HDAd-GFP-DEST; Giếng 14: Đối chứng âm không chứa khuôn ADN; Giếng 4, 9: các khuẩn lạc C43, C58 và C81 nghi ngờ chứa plasmid HDAd- GFP/Felix12; Giếng 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13: các khuẩn lạc số 26, 29, 47, 48, 55, 60, 61, 82.
Hình 21. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng Plasmid PCR. Giếng M: Thang chuẩn ADN 1 kb (Fermentas). Giếng 1: Đối chứng âm không chứa khuôn ADN. Giếng 2: Đối chứng dương-vector HDAd-GFP-DEST; Giếng 3, 4, 5: plasmid tách từ khuẩn lạc C43, C58, và C81 nghi ngờ chứa plasmid HDAd- GFP/Felix12.
70
Do vector HDAd-GFP-DEST có kích thước lớn (35kb) nên việc tái tổ hợp tương đồng qua phản ứng LR với vector pENTR/D-TOPO/Felix12 mang đoạn chèn với kích thước 2566 bp là khơng đơn giản. Thực tế cho thấy, chúng tôi đã tiến hành lặp lại thí nghiệm LR 2 lần. Ở lần thí nghiệm cuối cùng, chúng tôi sàng lọc 97 khuẩn lạc âm tính, chỉ có duy nhất 3 khuẩn lạc C43, C58 và C81 nghi ngờ chứa plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12. Tuy nhiên, sau khi tách plasmid từ 3 khuẩn lạc này và sử dụng plasmid làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi pC4HSU chúng tôi chỉ thu được duy nhất khuẩn lạc C58 có chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn. Hiệu suất của phản ứng tái tổ hợp tương đồng là rất thấp so với hiệu suất hơn 90% khi tái tổ hợp tương đồng các đoạn gen có kich thước nhỏ hơn 1kb (theo hướng dẫn của Invitrogen).
Bên cạnh đó, chúng tơi cũng song song tiến hành thí nghiệm tách dịng trình tự hộp gen biểu hiệu shARN của protein DNA-PKcs vào vector HDAd-GFP-DEST để tạo vector mang thiết kế biểu hiện HDAd-GFP-shARN-DNA-PKcs. Kết quả cho thấy việc tái tổ hợp tương đồng giữa vector HDAd-GFP-DEST với vector tiếp nhận mang thiết kế biểu hiện gen khơng q lớn (<300bp) có hiệu quả cao hơn rất nhiều, hơn 80% số khuẩn lạc âm tính với kháng sinh chọn lọc CmR khi tiến hành kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU đều cho kết quả là có mang đoạn gen thiết kế. (Số liệu khơng trình bày trong luận văn này).
3.2.2. Kết quả giải trình tự xác định vùng nối đầu 5’ và đầu 3’ của trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong vector HDAd-GFP-DEST
Để kiểm chứng kết quả hộp gen mang thiêt kế biểu hiện IL12 người đã được găn thành công vào vector virus HDAd-GFP-DEST hay chưa, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi pC4HSUFor&P2 và P5&pc4HSURev để kiểm tra giải trình tự.
71
Hình 22. Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST. Cặp mồi pC4HSUFor&P2 cho sản phẩm PCR có kích thước 1017bp. Cặp mồi P5&pc4HSURev cho sản phẩm PCR