CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 ngƣời, CMV promoter
3.1.3. Kết quả giải trình tự xác nhận hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12ngƣờ
ngƣời trong vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO
Để xác định chính xác trình tự của hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 trong vector thể nhận pENTR/D-TOPO, chúng tôi thiết kế sử dụng 4 cặp mồi
M13F&P2; P3&P4; P5&P6 và P5&M13R theo sơ đồ Hình 17, để tiến hành khuếch đại các đoạn gen tương ứng với các kích thước 1107bp, 1000bp, 565bp, 739bp.
66
Hình 17. Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL12 người trong vector pENTR/D-TOPO. Cặp mồi M13F&2 cho sản phẩm PCR có kích thước 1107bp. Cặp mồi P3&P4 cho sản phẩm PCR có kích thước 1000bp. Cặp mồi P5&P6 cho sản phẩm PCR có kích thước 565bp. Cặp mồi P5&M13R cho sản phẩm PCR có kích thước 739bp.
Sản phẩm PCR khuếch đại từ các cặp mồi này được tiến hành tinh sạch và giải trình tự trực tiếp trên hệ thống máy xác định trình tự tự động CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter. Kết quả giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong entry vector pENTR/D-TOPO được mô tả trong phần Phụ lục.
67
Hình 18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch của 04 đoạn gene tương
ứng với trình tự 2566 bp của hộp gene biểu hiện IL12 người. Đường chạy số 1–4, tương ứng với sản phẩm gene khuếch đại sử dụng cặp mồi M13F&P2 (kích thước 1107bp); P3&P4 (kích thước 1000bp); P5&P6 (kích thước 565bp) và P5&M13R (kích thước 767bp). M: Thang ADN chuẩn 100bp.
So sánh kết quả giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện, CMV promoter-
IL12B(p40)-Linker-IL12A(p35)-bGH_pA trong vector pENTR/D-TOPO với trình
tự gốc trong vector pcDNA3.1(+)/Felix12, chúng tơi khẳng định hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người đã được tách dịng thành cơng vào vector pENTR/D- TOPO.
3.2. Kết quả thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu hiện gen mã hóa Interleukine-12 ngƣời
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng phản ứng LR tái tổ hợp
Theo đúng nguyên tắc của kỹ thuật Gateway đã được trình bày ở phần Tổng quan tài liệu, chúng tơi thực hiện chuyển tồn bộ thiết kế hộp gen biểu hiện IL-12 từ
68
entry vector pENTR/D-TOPO sang vector HDAd-GFP-DEST để tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng phản ứng tái tổ hợp LR (LR recombination).
Sản phẩm của phản ứng tái tổ hợp LR sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli Stbl3. Vì vector HDAd-GFP-DEST có cấu trúc mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol (CmR) và gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trưởng cho tế bào E. Coli gây độc và làm chết tế bào, còn vector tái tổ hợp HDAd- GFP/Felix12 thì khơng có do thiết kế gen biểu hiện IL-12 người được chèn vào thay thế. Do đó, các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với đĩa có trải kháng sinh chọn lọc Ampicilin (Amp) nhưng cho kết quả âm tính với đĩa có trải kháng sinh chọn lọc chloramphenicol (CmR) được chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR clony với cặp mồi đặc hiệu pC4HSU (For&Rev) của vector HDAd-GFP-DEST.
Cặp mồi pC4HSU có vị trí gắn đặc hiệu trên vector HDAd-GFP-DEST cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thước 2,6 kb hoặc 2,3 kb tương ứng với các dòng mang và khơng mang plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 (Hình 19).
Hình 19. Sơ đồ vị trí cặp mồi pC4HSU phát hiện sự có mặt của hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL-12 người, CMV promoter-IL12(p40)-Linker-IL12(p35)-bGH_pA, trong vector HDAd-GFP-DEST.
69
Hình 20. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng Clony-PCR. Giếng M: Thang chuẩn ADN 1kb (Fermentas); Giếng 1, 8: Đối chứng dương-vector HDAd-GFP-DEST; Giếng 14: Đối chứng âm không chứa khuôn ADN; Giếng 4, 9: các khuẩn lạc C43, C58 và C81 nghi ngờ chứa plasmid HDAd- GFP/Felix12; Giếng 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13: các khuẩn lạc số 26, 29, 47, 48, 55, 60, 61, 82.
Hình 21. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng Plasmid PCR. Giếng M: Thang chuẩn ADN 1 kb (Fermentas). Giếng 1: Đối chứng âm không chứa khuôn ADN. Giếng 2: Đối chứng dương-vector HDAd-GFP-DEST; Giếng 3, 4, 5: plasmid tách từ khuẩn lạc C43, C58, và C81 nghi ngờ chứa plasmid HDAd- GFP/Felix12.
70
Do vector HDAd-GFP-DEST có kích thước lớn (35kb) nên việc tái tổ hợp tương đồng qua phản ứng LR với vector pENTR/D-TOPO/Felix12 mang đoạn chèn với kích thước 2566 bp là khơng đơn giản. Thực tế cho thấy, chúng tôi đã tiến hành lặp lại thí nghiệm LR 2 lần. Ở lần thí nghiệm cuối cùng, chúng tôi sàng lọc 97 khuẩn lạc âm tính, chỉ có duy nhất 3 khuẩn lạc C43, C58 và C81 nghi ngờ chứa plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12. Tuy nhiên, sau khi tách plasmid từ 3 khuẩn lạc này và sử dụng plasmid làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi pC4HSU chúng tôi chỉ thu được duy nhất khuẩn lạc C58 có chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn. Hiệu suất của phản ứng tái tổ hợp tương đồng là rất thấp so với hiệu suất hơn 90% khi tái tổ hợp tương đồng các đoạn gen có kich thước nhỏ hơn 1kb (theo hướng dẫn của Invitrogen).
Bên cạnh đó, chúng tơi cũng song song tiến hành thí nghiệm tách dịng trình tự hộp gen biểu hiệu shARN của protein DNA-PKcs vào vector HDAd-GFP-DEST để tạo vector mang thiết kế biểu hiện HDAd-GFP-shARN-DNA-PKcs. Kết quả cho thấy việc tái tổ hợp tương đồng giữa vector HDAd-GFP-DEST với vector tiếp nhận mang thiết kế biểu hiện gen khơng q lớn (<300bp) có hiệu quả cao hơn rất nhiều, hơn 80% số khuẩn lạc âm tính với kháng sinh chọn lọc CmR khi tiến hành kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU đều cho kết quả là có mang đoạn gen thiết kế. (Số liệu khơng trình bày trong luận văn này).
3.2.2. Kết quả giải trình tự xác định vùng nối đầu 5’ và đầu 3’ của trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong vector HDAd-GFP-DEST
Để kiểm chứng kết quả hộp gen mang thiêt kế biểu hiện IL12 người đã được găn thành công vào vector virus HDAd-GFP-DEST hay chưa, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi pC4HSUFor&P2 và P5&pc4HSURev để kiểm tra giải trình tự.
71
Hình 22. Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết
kế biểu hiện IL12 người trong vector HDAd-GFP-DEST. Cặp mồi pC4HSUFor&P2 cho sản phẩm PCR có kích thước 1017bp. Cặp mồi P5&pc4HSURev cho sản phẩm PCR có kích thước 683bp.
Sản phẩm PCR khuếch đại với 2 cặp mồi pC4HSUFor&P2 và P5&pc4HSURev sau đó được tinh sạch và xác định trình tự nucleotide. Kết quả
được trình bày trên Hình 23.
A B
Hình 23. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại và sản phẩm tinh sạch sử dụng 2 cặp mồi pC4HSUFor&P2 và P5&pc4HSURev. A- Ảnh điện đi sản phẩm PCR. B- Ảnh
điện di sau tinh sạch. Giếng 1: sản phẩm PCR của cặp mồi pC4HSUFor&P2 kích thước tương ứng 1017bp; Giếng 2: sản phẩm PCR của cặp mồi P5&pc4HSURev kích thước tương ứng 683bp; M: Thang ADN chuẩn 100bp.
72
So sánh kết quả giải trình ở hai đầu tận cùng ở vùng nối 5’ và 3’ của hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong vector virus HDAd-GFP/Felix 12 với trình tự gốc trong vector pcDNA3.1(+)/Felix 12 cho thấy trình tự đầu 5’ và 3’của sản phẩm giải trình tự trùng khớp với trình tự đầu 5’ và 3’ của hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 trong vector pcDNA3.1(+)/Felix 12 (Hình 24). Như vậy, vector tái tổ hợp HDAd-GFP mang hộp gen biểu hiện IL-12 người (HDAd-GFP/Felix 12) đã được thiết kế thành cơng.
Hình 24. Kết quả giải trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện Il12 người trong vector
HDAd-GFP-DEST.
3.3. Kết quả đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12ngƣời trên dịng tế bào Q-293A
3.3.1. Kết quả chuyển vector HDAd-GFP/Felix12/NotI vào dòng tế bào Q293A
Để tạo nguồn sinh phẩm cho các thí nghiệm sử dụng trong luận văn, dịng tế bào Q-293A được tiến hành nuôi cấy và bảo quản tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện TƯQĐ 108 theo hướng dẫn của ATCC, Mỹ. Quy trình ni cấy, làm stock tế bào được mô tả chi tiết trong phần phương pháp nghiên cứu.
73
Q293A sử dụng mơi trường DMEM low glucose có bổ sung 15% FBS và 1% penicilin/streptomycin. Sau hai lần cấy chuyển, số lượng tế bào Q-293A đạt 2,0x106 tế bào/1 đĩa ni cấy (đường kính 60mm), độ bao phủ hơn 90%. Hình 25 là hình ảnh tế bào Q-293A sau hai lần cấy chuyển tế bào từ stock. Kết quả cho thấy, tế bào mọc tốt trên môi trường nuôi cấy, không nhiễm, đạt yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 25. Hình ảnh ni cấy dịng tế bào Q-293Atrên môi trường nuôi cấy DMEM
low glucose. Ảnh chụp sử dụng vật kính 20X.
Tiếp theo, để giải phóng vector HDAd (chuyển đổi bộ gen của HDAd từ “dạng plasmid” sang “dạng virus”), chúng tôi tiến hành phản ứng cắt mở vòng vector bằng enzyme giới hạn NotI. Sản phẩm của phản ứng cắt sau đó được chuyển nạp vào dòng tế bào Q-293A để đánh giá khả năng biểu hiện của hộp gen mã hóa IL-12.
74
Hình 26. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng
enzyme giới hạn NotI. M: Thang chuẩn ADN 1kb (Fermentas). Giếng 1: HDAd- GFP/Felix12/NotIed; Giếng 2: plasmid HDAd-GFP-Felix12.
Kết quả ở hình 26 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt enzyme (giếng số 1) thu được ở dạng mạch thẳng khẳng định vector HDAd-GFP/Felix12 đã được cắt mở vịng hồn tồn (giếng số 2).
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd- GFP/Felix12 trên dòng tế bào Q-293A
Sản phẩm cắt được chuyển nạp vào dòng tế bào Q-293A sử dụng quy trình như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau đó, chúng tơi tiến hành tách ARN từ các mẫu tế bào nuôi cấy và mẫu tế bào sau 24 giờ và 48 giờ chuyển gen. Vì trong q trình tách chiết ARN có thể bị lẫn ADN, ADN nhiễm này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả của phản ứng RT-PCR. Vì vậy, chúng tôi xử lý mẫu với DNase I để loại bỏ hết ADN lẫn trong mẫu ARN tách chiết. Kết quả chuyển gen
75
hình 27 cho thấy vector HDAd-GFP/Felix-12 đã được chuyển thành cơng vào dịng tế bào Q-293A, mức độ biểu hiện của protein huỳnh quang GFP được quan sát sau 24 giờ, hiệu suất chuyển gen được chúng tơi tính tốn đạt 20% (số liệu khơng trình bày trong luận văn này).
Hình 27: Hình ảnh tế bào Q-293A biểu hiện protein phát huỳnh quang GFP sau 24h
chuyển gen với vector HDAd-GFP/Felix-12 được cắt mở vòng với enzyme giới hạn
NotI.
Hình 28. Kết quả điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại
ADN bằng enzyme ADNse I. Giếng M: Thang chuẩn ADN 1 kb (Fermentas). Giếng 1-
3: Các mẫu RNA tổng số được xử lý với ADNse I. Giếng 1: Q-293A: Dòng tế bào Q-293A (Đối chứng); Giếng 2: Q-293A sau 24 giờ chuyển gen (IL-12/24h); Giếng 3: Q-293A sau 48 giờ chuyển gen (IL-12/48h); Giếng (+): Đối chứng dương (mẫu RNA tổng số trước xử lý).
76
Kết quả hình 28 cho thấy trên giếng từ 1-3 là các mẫu RNA tổng số được xử lý bằng ADNseI, các băng điện di khơng xuất hiện chứng tỏ khơng cịn ADN trong mẫu RNA tổng số. Đối chứng dương là các mẫu RNA tổng số không được xử lý bằng enzyme ADNse I. Nhận thấy đối chứng dương lên một băng với kích thước 496 bp, tương ứng với sản phẩm khuếch đại của cặp mồi nội chuẩn GAPDH. Kết quả này chứng tỏ, quá trình xử lý RNA bằng ADNse I đạt chất lượng tốt, loại bỏ hoàn toàn ADN trong mẫu RNA tổng số. RNA sau xử lý sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cDNA.
Tiếp theo, chúng tơi sử dụng 1µl cDNA làm khn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế Felix12 dùng cho phản ứng RT-PCR và cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa GFP. Song song với đó, chúng tơi tiến hành khuếch đại gen GAPDH. Đây là gen được thể hiện trong mọi tế bào, không phụ thuộc vào nguồn gốc, trạng thái hoạt động của tế bào. Do vậy, gen mã hóa GAPDH được sử dụng như là gen
nội chuẩn để đánh giá chất lượng sản phẩm mARN và căn cứ vào đó làm thước đo chuẩn cho nồng độ khn cho phản ứng RT-PCR khuếch đại gen mã hóa IL-12.
Hình 29. Kết quả RT-PCR kiểm tra khả năng biểu hiện của gen mã hóa IL-12 và
GFP trên dịng tế bào Q-293A với RNA đã xử ý DNaseI. Giếng Q-293A: Dòng tế bào
Q-293A (Đối chứng); Giếng 2: Q-293A sau 24 giờ chuyển gen (IL-12/24h); Giếng 3: Q- 293A sau 48 giờ chuyển gen (IL-12/48h); Giếng (-): Đối chứng âm khơng có khn cDNA; Giếng (+): Đối chứng dương-Plasmid HDAd-GFP/Felix12.
Kết quả của phản ứng khuếch đại GAPDH cho thấy việc tách chiết ARN tổng số từ các mẫu nghiên cứu và kỹ thuật RT-PCR thành công cho kết quả tốt. Đồng
77
thời, chúng tôi cũng đánh giá được khả năng biểu hiện gen mã hóa IL12 người của vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 trên dòng tế bào Q-293A ở mức độ mARN trong thời gian 24h và 48h sau chuyển gen. Kết quả PCR phiên mã ngược hình 28 khẳng định vector virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix-12 chứa hộp gen mang thiết kế biểu hiện GFP và hIL-12 đã biểu hiện thành công ở mức độ mRNA đối với gfp và
hIL-12, và ở mức độ protein đối với protein phát huỳnh quang GFP.
3.4. Kết quả bƣớc đầu tạo virus tái tổ hợp HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) trên dịng tế bào 293Cre4
Dịng tế bào 293Cre4 được nuôi cấy trong môi trường MEMα có bổ sung 15% FBS, 1% peniciin/streptomycin và 0,8% G418. Sau hai lần cấy chuyển, số lượng tế bào 293Cre4 đạt 2,0x106
tế bào/1 đĩa ni cấy (đường kính 60mm), độ bao phủ hơn 90%. Hình 29 là hình ảnh tế bào 293Cre4 sau hai lần cấy chuyển tế bào từ stock. Kết quả cho thấy, tế bào mọc tốt trên môi trường nuôi cấy, không nhiễm, đạt yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 30. Hình ảnh ni cấy dịng tế bào 293Cre4 trên mơi trường nuôi cấy MEMα.
Ảnh chụp sử dụng vật kính 20X.
Quy trình tiến hành sản xuất virus HDAd-GFP-Felix 12 đã được mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau 48h đồng nhiễm đầu tiên tại thời điểm P0, toàn bộ tế bào 293Cre4 đã bị ly giải hoàn toàn (CPE, cytopathic Effect) do có sự hình thành
78
xảy ra hiện tượng tương tự (Hình 30). Sự biểu hiện của protein phát huỳnh quang GFP được sử dụng để đánh giá có hay khơng sự tạo thành của virus tái tổ hợp Helper dependent adenovirus mang và biểu hiện 2 gen đích, gfp và Interleukin 12
người. Kết quả hình 30 mơ tả hình ảnh ly giải tế bào và bước đầu tạo virus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 tại pha P0 sau 48h chuyển gen và đồng nhiễm với 5 MOI virus H14.
Hình 31: Hình ảnh tế bào 293Cre4 sau 48 giờ chuyển gen với vector virus HDAd-
GFP-Felix 12 và đồng nhiễm với virus H14.
Để kiểm tra và chứng minh sự hiện diện của virus HDAd-GFP-Felix12 tại mỗi thời điểm P, chúng tôi tiến hành thu tế bào và tách chiết ADN tổng số, sau đó tiến hành phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho thiết kế IL12 (RT-Felix12
79
A B
Hình 32. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho thiết kế A) cặp mồi đặc hiệu cho gen GFP (GFPFor&Rev), B) cặp mồi đặc hiệu IL12 (RT-Felix12 For&Rev). Giếng 1-5: các mẫu ADN tại các thời điểm P0, P1, P2, P3, P4; Giếng (-): ADN dòng tế bào 293Cre4, đối chứng âm; Giếng (+): plamsid HDAd-GFP-Felix12, đối chứng