CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4.2. Tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người vào vector thể nhận
pENTR/D-TOPO
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gắn vào vector tiếp nhận pENTR/D- TOPO (Invitrogen) để tạo vector tái tổ hợp mang hộp gen biểu hiện IL-12 mong muốn (pENTR/D-TOPO/Felix12). Phản ứng được thực hiện bằng bộ sinh phẩm pENTR™ Directional TOPO Cloning Kits (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình: Thành phần phản ứng Phản ứng 1 Phản ứng 2 1) Puri pcr Felix12 1µl 0,62µl 2) H2O vơ trùng 3µl 3,38µl 3) Salt solution 1µl 1µl Tổng thể tích 5µl 5µl
- Chuyển 2,5µl sang ống eppendoff mới.
- Bổ sung 0,5µl vector pENTR/D-TOPO và trộn đều. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Chuyển 3µl hỗn hợp phản ứng vào trong tế bào khả biến E. Coli DH5α, ủ trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt 42oC trong vịng 30 giây, sau đó nhanh chóng chuyển lên đá. - Bổ sung 250µl mơi trường SOC, lắc 37oC 200 vòng/phút trong 1 giờ.
- Trải lên đĩa thạch có sẵn kháng sinh chọn lọc Kanamycin (50µg/ml), ủ 37oC qua đêm.
Khuẩn lạc thu được sẽ được sàng lọc sơ bộ bằng phản ứng PCR-colony với các thành phần được trình bày ở Bảng 4.
46
Bảng 4. Thành phần và điều kiện phản ứng Colony-PCR sử dụng cặp mồi H1&H2 Thành phần phản ứng Thể tích (µL) 1) 2X MasterMix Promega 12,5 2) Mồi H1 (10pM) 1,0 3) Mồi H2 (10pM) 1,0 4) Colony 1,0 5) H2O cho PCR 9,5 Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 62oC, 30 giây; 72oC, 2 phút 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid tái tổ hợp sau đó được ni cấy trong mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin (nồng độ 50g/mL) từ 12 đến 16 tiếng ở 37o
C 200 vịng/phút. Sau đó, tiến hành tách plasmid sử dụng bộ sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) theo quy trình nhà sản xuất cung cấp như sau:
- Ly tâm thu cặn vi khuẩn sau khi nuôi lắc 12 đên 16 tiếng 8000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 250µl Resuspension Solution (đã bổ sung Rnase A) vào trong eppendoff có chứa cặn vi khuẩn. Trộn đều bằng pipet cho đến khi cặn tan hồn tồn.
- Bổ sung 250µl Lysis Solution, úp ngửa ống eppendoff 4 đến 6 lần hoặc đến khi dung dịch đồng nhất.
- Bổ sung 350µl Neutralization Solution, úp ngửa ống eppendoff 4-6 lần. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
- Đặt cột lên trên ống thu. Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột (tránh hút phải cặn). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
47
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Bổ sung 500µl Wash Solution vào trong cột, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước này lặp lại 2 lần.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Ly tâm khan 12000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Solution.
- Bổ sung 50µl Elution Buffer, để ủ 2 đến 3 phút ở nhiệt độ phịng sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút.
- Sản phẩm được bảo quản ở -20oC.
Sau đó, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu vector M13 (For&/Rev) để kiểm tra chính xác sự có mặt của hộp gen biểu hiện IL-12 người trong vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 5.
Bảng 5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector
M13 (For&Rev) Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 2X MastermixDreamTaq Promega 12,5 2) Mồi M13 For (10pM) 1,0 3) Mồi M13 Rev (10pM) 1,0 4) Plasmid (pENTR/D-TOPO/Felix12) (10ng/µl) 1,0 5) H2O cho PCR 9,5 Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 62oC, 30 giây; 72oC, 2 phút 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
Sau khi đã xác định được plasmid có chứa hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người, chúng tôi sử dụng 4 cặp mồi M13F&P2; P3&P4; P5&P6 và P5&M13R
48
tương ứng khuếch đại 04 đoạn gen có các kích thước lần lượt là: 1147bp; 1000 bp; 565bp và 739 bp để tiến hành phân tích trình tự khẳng định kết quả.
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích là 25,0µl gồm các thành phần được trình bày trong Bảng 6.
Bảng 6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR dùng để giải trình tự hộp gen biểu
hiện IL-12 người trong vector pENTR/D-TOPO
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 2X Mastermix Promega 12,5 2) Mồi xuôi (10pM) 1,0 3) Mồi ngược (10pM) 1,0 4) Khuôn ADN (10pg) 1,0 5) H2O vô trùng 9,5 Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 63oC, 30 giây; 72oC, 1 phút]; 72oC, 7 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
Sản phẩm PCR sau khi điện di kiểm tra được tinh sạch bằng GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) và xác định trình tự nucleotide trên hệ thống máy giải trình tự CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ.
2.3.4. Phƣơng pháp thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus chứa hộp gen mang thiết kế biểu hiện Interleukine-12 ngƣời (HDAd-GFP-Felix12)
Theo nguyên tắc của kỹ thuật Gateway, pENTR/D-TOPO/Felix12 sẽ được tái tổ hợp tương đồng với vector đích HDAd-GFP-DEST để tạo thành vector virus mang hộp gen biểu hiện IL-12 (HDAd-GFP/Felix12). Trong kỹ thuật này, vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO mang vị trí tái tổ hợp attL trong khi ở vector đích là attR. Các vị trí này giúp phản ứng tái tổ hợp lamda (Lamda reconstruction, LR) xảy ra khi có mặt đồng thời plasmid pENTR/D-TOPO/Felix12 với vector đích HDAd-GFP-DEST dưới
49
sự xúc tác của hỗn hợp enzyme LR Clonase II, từ đó tạo vector biểu hiện mang cấu trúc của gen mong muốn.
Quy trình phản ứng tái tổ hợp tương đồng LR:
Thành phần phản ứng Thể tích
1) pENTR/D-TOPO/Felix12 (150ng/µl) 0,5µl 2) HDAd-GFP-DEST (150ng/µl) 0,89µl
3) TE buffer, pH 8,0 6,61µl
Tổng thể tích 8µl
- Bổ sng 2µl LR clone II enzyme mix, trộn đều. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
- Bổ sung 1µl Protein K (2µg/µl) vào hỗn hợp phản ứng, ủ 37oC trong vòng 10 phút.
- Tiến hành biến nạp 3µl sản phẩm LR vào trong tế bào khả biến E. Coli Stbl3. - Trải lên đĩa đã có sẵn kháng sinh chọn lọc Ampicilin (100µg/ml)
- Các khuẩn lạc dương tính trên đĩa thạch có chứa Ampcilin sẽ được cấy chuyển sang đĩa thạch có chứa kháng sinh chọn lọc Ampicilin (Amp) (100µg/ml) và Chloramphenincol (CmR) (30µg/m).
Các khuẩn lạc cho kết quả âm tính trên đĩa thạch có trải hai loại kháng sinh chọn lọc Amp và CmR sẽ được nuôi cấy tăng sinh trong mơi trường LB lỏng có bổ sung Amp (100µg/ml), sau đó tiến hành tách plasmid theo bộ sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo).
Plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 thu được sẽ được phân lập và kiểm tra sự có mặt của hộp gen biểu hiện IL-12 bằng phương pháp PCR với cặp mồi vector pC4HSU For/Rev với thành phần phản ứng như trong Bảng 7.
50
Bảng 7. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector
pC4HSU (For/Rev)
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
1) 2X Mastermix Promega 12,5 2) Mồi pC4HSU For (10pM) 1
3) Mồi pC4HSU Rev (10pM) 1
4) Khn ADN (10pg/µl) 3
5) H2O vơ trùng 7,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 55oC, 30 giây; 72oC, 2 phút 30 giây]; 72oC, 7 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
2.3.5. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào.
2.3.5.1. Ni cấy dịng tế bào Q293A và 293Cre4 từ stock
Stock tế bào được bảo quản trong N2 lỏng, trước khi nuôi cấy phải giã đông bằng bể ổn nhiệt ở 37oC trong 2÷5 phút. Mơi trường ni cấy, hóa chất sử dụng trong q trình ni cấy được bảo quản ở 4oC, trước khi sử dụng phải ủ ở 37o
C trong 10÷15 phút.
Quy trình:
Bước 1: Chuẩn bị ống Falcon 15 mL, đánh dấu tên và bổ sung 8ml môi trường nuôi cấy tế bào DMEM low với dòng tế bào Q293A, MEM-α với dòng tế bào 293Cre4.
Bước 2: Chuyển stock tế bào đã giã đơng sang ống Falcon 15ml có chứa sẵn môi trường, mix nhẹ nhàng.
Bước 3: Ly tâm 1500 vịng/phút trong 5 phút, hút bỏ mơi trường để lại khoảng 200μl cặn tế bào.
51
Bước 4: Thêm 10ml mơi trường DMEM low với dịng tế bào Q293A, MEM-α với dòng tế bào 293Cre4 vào ống Falcon chứa cặn tế bào, mix nhẹ nhàng rồi chuyển vào đĩa ni cấy.
Bước 5: Kiểm tra hình thái tế bào, tế bào tốt là các tế bào mọc riêng rẽ, có hình trịn.
Bước 6: Chuyển sang tủ nuôi cấy Hera Cell (37oC, 5% CO2).
2.3.5.2. Cấy chuyển tế bào
Quy trình:
Bước 1: Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ. Bước 2: Rửa tế bào bám dính bằng 6ml PBS. Bước 3: Bổ sung 2ml Trypsin-EDTA. Ủ ở 37o
C trong 3÷5 phút.
Bước 4: Bổ sung thêm 4ml môi trường nuôi cấy DMEM low với dòng tế bào Q293A, MEM-α với dòng tế bào 293Cre4, pipet nhẹ nhàng. Lấy toàn bộ dịch ra ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, thu cặn tế bào.
Bước 5: Thêm 10ml môi trường ni cấy DMEM low với dịng tế bào Q293A, MEM-α với dòng tế bào 293Cre4vào cặn tế bào vừa thu, pipet nhẹ nhàng.
Bước 6: Lấy 10µl dịch tế bào ở bước trên và 10µl tryphan blue, trộn đều rồi lấy 10µl vào buồng đếm tế bào.
Bước 7: Chuyển toàn bộ dịch tế bào sang đĩa nuôi cấy mới. Nuôi cấy ở tủ Heracell (5% CO2; 37oC).
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) trên dịng tế bào Q-293A mang gen mã hóa IL-12 ngƣời (HDAd-GFP/Felix12) trên dòng tế bào Q-293A
2.3.6.1. Cắt mở vòng vector HDAd-GFP/Felix12
Để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP- Felix12 được nuôi và tách plasmid với số lượng lớn sử dụng PureLinkHiPure
52
Plasmid DNA Purification Kits (Maxiprep) của Invitrogen theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
- Nuôi lắc vi khuẩn trong 100ml môi trường LB lỏng 12-16 tiếng tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Bổ sung 30ml Equilibration Buffer (EQ1) lên trên cột HiPure maxi. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Tiến hành thu cặn tế bào sau khi đã nuôi lắc 12-16 tiếng bằng cách ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn.
- Bổ sung 10ml Resuspension Buffer (R3) đã bổ sung Rnase A vào cặn tế bào. Hòa tan cặn cho đến khi dung dịch đồng nhất.
- Bổ sung 10ml Lysis Buffer (L7). Trộn đều bằng cách úp ngửa 5-6 lần. Để ủ ở nhiệt độ thường trong vòng 5 phút.
- Bổ sung 10ml Precipitation Buffer (N3). Trộn đều bằng cách úp ngửa nhẹ nhàng cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ly tâm 12000vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ thường.
- Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột HiPure Maxi. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Bổ sung 60ml Wash Buffer (W8) lên trên cột. Loại bỏ dịch thu được dưới ống thu.
- Đặt ống thu sạch dưới chân cột HiPure Maxi (ống Falcol 50ml). Bổ sung 15ml Elution Buffer (E4) lên trên cột. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Bổ sung 10,5ml Isopropanol vào trong dịch thu được. Trộn đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. Bổ sung 5ml Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi.
- Làm khô cặn thu được trong 10 phút. Hòa tan cặn thu được trong 1ml TE buffer (TE). Bảo quản ở -20oC.
53
Để chuyển thiết kế biểu hiện IL-12 vào dịng tế bào Q293A, chúng tơi tiến hành phản ứng cắt mở vòng vector bằng enzyme giới hạn NotI với thành phần và điều kiện của phản ứng được mô tả trong Bảng 8.
Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt vector bằng enzyme giới hạn NotI Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 10X Buffer O 5,0 2) NotI (5U/µl) 1,0 3) Vector HDAd-GFP/Felix12 (10µg) 22,0 4) H2O vơ trùng 22,0 Tổng thể tích 50,0
- Ủ phản ứng ở 37oC qua đêm, biến tính enzyme ở 80o
C trong 20 phút. - Điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8%,
2.3.6.2. Chuyển gen vào dòng tế bào Q293A sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) (Invitrogen)
Tế bào Q293A được nuôi cấy trên đĩa nuôi cấy 60mm trong môi trường DMEM low glucose đầy đủ đạt độ che phủ 80%. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn đã được kiểm tra điện di, đảm bảo chất lượng tốt cho các thí nghiệm trong luận văn.
Quy trình
- Bước 1: Chuẩn bị 2 ống ly tâm 1,5ml ghi nhãn LIPO và ADN.
Ống LIPO : Lắc nhẹ lọ Lipofectamin 2000 trước khi sử dụng, lấy 20μl nhỏ từ từ lên bề mặt 480µl Opti-MEM đã chuẩn bị trước.
Ống ADN: hút 50µl HDAd-GFP/Felix12 đã cắt bởi NotI (HDAd- GFP/Felix12/NotI) (tương ứng với 10µg) vào 450 µl mơi trường Opti-MEM.
Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bước 2: Hút dung dịch từ ống ADN nhỏ từ từ sang ống LIPO. Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng.
54
- Bước 3: Trong thời gian ủ phức, ta tiến hành thay môi trường cho đĩa nuôi cấy tế bào sẽ chuyển gen, loại bỏ hồn tồn mơi trường cũ, rửa 1 lần bằng PBS, bổ sung 1,5ml môi trường Opti-MEM mới.
- Bước 4: Sau 20 phút ủ phức, bổ sung từ từ phức vào đĩa nuôi cấy tế bào, láng nhẹ nhàng đĩa để phân bố đều dịch. Quan sát tế bào sau khi chuyển nhiễm, sau 24h và 48h chuyển gen tiến hành thu tế bào để tiến hành kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào nhiễm sau 24-48 giờ bằng các kĩ thuật sinh học phân tử.
2.3.6.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN
Các mẫu tế bào thu được sau 0h, 24h, 48h chuyển gen được tiến hành tách chiết ARN theo quy trình như sau:
- Hịa tan cặn tế bào bằng 20µl dung dịch Trizol (Invitrogen).
- Bổ sung 400µl dung dịch Cloroform vào trong hỗn dịch, ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC
- Hút dịch nổi ở pha trên sang một ống eppendoff mới, bổ sung tỷ lệ 1V : 1V isopropanol (để lạnh), úp ngửa 5-6 lần. Ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 500µl dung dịch Etanol 70% (để lạnh), ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, tránh hút phải cặn. Bước này được lặp lại 2 lần.
- Làm khô bằng máy speedvac trong 10 phút.
- Thơi ARN bằng 100µl nước vơ trùng (nuclear free water), ủ 65oC trong 10 phút.
- Bảo quản ở -20oC.
ARN sau khi được tách chiết sẽ được xử lý loại bỏ ADN tránh ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo bằng cách sử dụng DNase I (Thermo). Quy trình xử lý theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
55
- Bổ sung vào 1 ống eppendoff sạch lần lượt
ARN 5μg
10X buffer 1μl DNase I, RNase-free 5U
DEPC-treated Water tới thể tích 50 μl - Ủ 37°C trong 30 phút
- Bổ sung 5μl 50 mM EDTA và ủ 65°C trong10 phút.
ARN sau khi xử lý loại bỏ ADN và ARN không tiến hành xử lý sẽ được tổng hợp cDNA ngay phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.6.4. Kĩ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR)
RT-PCR là một phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ khn RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là q trình phiên mã ngược (RT) từ khn mẫu ARN tổng số hoặc mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Phản ứng RT có thể thực hiện với primer ngẫu nhiên, oligo (dT) hoặc primer đặc hiệu sử dụng enzyme reverse transcriptase. Sản phẩm của phản ứng RT sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại cDNA (PCR).
Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện phản ứng phiên mã ngược RT-PCR sử dụng enzyme M-MLUV Reverse Transcriptase trong bộ sinh phẩm RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo).
Quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất được trình bày trong Bảng 9.
Bảng 9. Thành phần và điều kiện cho phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần phản ứng
Thể tích (µl)
1) 5X Buffer Reaction 4,0
56
3) Enzyme M-MuLV (200 u/µl) 0,5
4) Recombinant RNase ribonuclease inhibitor