CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.7.4. Kiểm tra đánh giá kết quả sản xuất virus HDAd-GFP-Felix12
Các mẫu tế bào thu được sau các thời điểm P được tiến hành tách chiết ADN theo quy trình như sau:
- Hịa tan cặn tế bào bằng 300µl dung dịch NaOH 50mM, ủ 95oC trong vòng 20 phút.
- Bổ sung 64µl Tris HCl pH 7 vào hỗn dịch, úp ngửa.
- Bổ sung 400µl dung dịch Cloroform vào trong hỗn dịch, ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4o
C
- Hút dịch nổi ở pha trên sang một ống eppendoff mới, bổ sung tỷ lệ 1V : 1V isopropanol (để lạnh), úp ngửa 5-6 lần. Để tủa nhiệt độ thường trong vòng 20 phút. Ly tâm 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 500µl dung dịch Etanol 70% (để lạnh), ly tâm 13200 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, tránh hút phải cặn. Bước này được lặp lại 2 lần.
- Làm khô tự nhiên trong 20 phút.
- Thôi ADN bằng 100µl nước vơ trùng (nuclear free water), ủ 56oC trong 10 phút.
- Bảo quản ở -20oC.
Các mẫu ADN sau khi được tách chiết sẽ được tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa IL-12 (RT-IL12 For/Rev), cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa GFP (For/Rev). Thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng được trình bày trong Bảng 11.
60
Bảng 11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá kết quả sản xuất virus
HDAd-GFP-Felix12 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 2X Mastermix Promega 12,5 2) Primer Forward (10 pM) 1,0 3) Primer Reverse (10 pM) 1,0 4) Khuôn ADN 5,0 5) H2O cho PCR 5,5 Tổng thể tích 25,0
94oC, 5 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 58oC, 30 giây; 72oC, 45 giây]; 72oC, 7 phút; giữ nhiệt ở 4oC.
61
62