CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.6.1. Cắt mở vòng vector HDAd-GFP/Felix12
Để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, plasmid tái tổ hợp HDAd-GFP- Felix12 được nuôi và tách plasmid với số lượng lớn sử dụng PureLinkHiPure
52
Plasmid DNA Purification Kits (Maxiprep) của Invitrogen theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
- Nuôi lắc vi khuẩn trong 100ml môi trường LB lỏng 12-16 tiếng tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Bổ sung 30ml Equilibration Buffer (EQ1) lên trên cột HiPure maxi. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Tiến hành thu cặn tế bào sau khi đã nuôi lắc 12-16 tiếng bằng cách ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn.
- Bổ sung 10ml Resuspension Buffer (R3) đã bổ sung Rnase A vào cặn tế bào. Hòa tan cặn cho đến khi dung dịch đồng nhất.
- Bổ sung 10ml Lysis Buffer (L7). Trộn đều bằng cách úp ngửa 5-6 lần. Để ủ ở nhiệt độ thường trong vòng 5 phút.
- Bổ sung 10ml Precipitation Buffer (N3). Trộn đều bằng cách úp ngửa nhẹ nhàng cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ly tâm 12000vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ thường.
- Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột HiPure Maxi. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Bổ sung 60ml Wash Buffer (W8) lên trên cột. Loại bỏ dịch thu được dưới ống thu.
- Đặt ống thu sạch dưới chân cột HiPure Maxi (ống Falcol 50ml). Bổ sung 15ml Elution Buffer (E4) lên trên cột. Dung dịch sẽ tự chảy theo áp lực trọng trường.
- Bổ sung 10,5ml Isopropanol vào trong dịch thu được. Trộn đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. Bổ sung 5ml Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi.
- Làm khô cặn thu được trong 10 phút. Hòa tan cặn thu được trong 1ml TE buffer (TE). Bảo quản ở -20oC.
53
Để chuyển thiết kế biểu hiện IL-12 vào dịng tế bào Q293A, chúng tơi tiến hành phản ứng cắt mở vòng vector bằng enzyme giới hạn NotI với thành phần và điều kiện của phản ứng được mô tả trong Bảng 8.
Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt vector bằng enzyme giới hạn NotI Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1) 10X Buffer O 5,0 2) NotI (5U/µl) 1,0 3) Vector HDAd-GFP/Felix12 (10µg) 22,0 4) H2O vơ trùng 22,0 Tổng thể tích 50,0
- Ủ phản ứng ở 37oC qua đêm, biến tính enzyme ở 80o
C trong 20 phút. - Điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8%,