Luận văn thạc sĩ này đƣợc thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Cơ sở Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên, với tên đề tài là: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa nhân
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––––––– VANHSY SYSOUPHANH NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN GmDREB7A VÀO GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT12 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––––––– VANHSY SYSOUPHANH NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN GmDREB7A VÀO GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT12 Ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu, Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và đƣợc sự đồng ý của cán bộ hƣớng dẫn và nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn trong luận đều ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022 Tác giả luận văn Vanhsy SYSOUPHANH i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, ngƣời thầy đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Thị Hải Yến, ThS Trần Thị Hồng và các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học Tôi xin cảm ơn lĩnh đạo Trƣờng Cao đẳng Sƣ phạm Ban Keun, Viêng Chăn, Lào đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học tại Việt Nam Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khuyến khích, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn Luận văn thạc sĩ này đƣợc thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Cơ sở Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên, với tên đề tài là: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB7A và tạo cây đậu tương chuyển gen” do TS Từ Quang Tân làm chủ nhiệm Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022 Tác giả luận văn Vanhsy SYSOUPHANH ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Nội dung nghiên cứu 2 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 4 1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 10 1.2.1 Phân họ gen DREB ở đậu tƣơng 10 1.2.2 Đặc điểm của gene GmDREB7A trong hệ gen đậu tƣơng 11 1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 14 1.3.1 Chuyển gen ở cây đậu tƣơng nhờ A tumefaciens 14 1.3.2 Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở đậu tƣơng 16 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 19 2.1.1 Giống đậu tƣơng ĐT12 19 2.1.2 Các chủng vi khu n và các loại vector 19 2.1.3 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 19 2.1.4 Hóa chất và thiết bị 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 iii 2.2.1 Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB7A 22 2.2.2 Phƣơng pháp biến nạp gen GmDREB7A và tái sinh cây chuyển gen .24 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen 28 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN VĂN 28 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 THIẾT KẾ VECTOR pZY_GmDREB7A 29 3.1.1 Tạo vector chuyển gen pZY_GmDREB7A .29 3.2 CHUYỂN GEN GmDREB7A VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG .33 3.2.1 Kết quả xác định, khử trùng hạt và tạo nguyên liệu biến nạp 33 3.2.2 Nhiễm khu n và tạo cây đậu tƣơng biến nạp gen 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 1 Kết luận 39 2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 iv DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ/chữ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng Việt AP2/ERF APETALA2/Ethylene Responsive Factor Cặp base AS Acetosyringone Môi trƣờng đồng nuôi cấy BAP 6-Benzyl Amino Purin Cộng sự bp Base pair Đối chứng CCM Cocultivation medium Môi trƣờng nảy mầm cs DNA Deoxyribonucleic acid Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ ĐC bản nuôi cấy vi khu n GM Germination medium Phản ứng chuỗi polymerase GA3 Gibberellic acid GmDREB7A Glycine max Dehydration Môi trƣờng ra rễ responsive element binding Môi trƣờng kéo dài chồi IAA protein 7A Môi trƣờng tạo chồi IBA Indoleacetic acid Cây không biến nạp kb Indole-3-butyric acid Cao chiết nấm men kDa Kilo base Kilo Dalton LB Luria Bertani MS PCR Murashige - Skoog (1962) Polymerase chain reaction PPT (Phản ứng chuỗi polymerase) RM Phosphinothricin SEM Rooting medium SIM Shoot elongation medium WT Shoot induction medium YEP Wild type Yeast extract peptone iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kết quả biến nạp một số gen DREB ở một số loài thực vật 17 Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các mồi PCR sử dụng trong nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt vector pBI121_GmDREB7A và pZY102 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối cấu trúc mang gen GmDREB7A vào vector pZY102 23 Bảng 2.4 Thành phần colony-PCR khuếch đại gen GmDREB7A từ khu n lạc 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng kiểm tra vector pBI121-GmDREB7A 24 Bảng 2.6 Môi trƣờng nuôi khu n 25 Bảng 2.7 Môi trƣờng tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 27 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm nạp gen GmDREB7A vào giống cây đậu tƣơng ĐT12 37 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB7A (LOC100101894) 11 Hình 1.2 Trình tự gen GmDREB7 trên GenBank 12 Hình1.3 Trình tự mino acid của protein DREB7, miền AP2 (A) và những vị trí liên kết giữa amino acid với DNA (B) [26] 13 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thực hiện đề tài luận văn 21 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector pZY_GmDREB7A 22 Hình 3.1 Điện di đồ kết quả cắt cấu trúc pBI121_GmDREB7A và pZY102 29 Hình 3.2 Vector chuyển gen pZY_GmDREB7A 30 Hình 3.3 Điện di đồ kết quả phân tích colony-PCR từ các dòng khu n lạc E.coli M: marker DNA 1 kb; 1-8: sản ph m colony-PCR 30 Hình 3.4 Điện di đồ sản ph m cắt vector pZY-GmDREB7A bằng Hind III 31 Hình 3.5 Vector pZY_GmDREB7A đƣợc kiểm tra bằng giải trình tự nucleotide 32 Hình 3.6 Điện di đồ kiểm tra sản ph m colony-PCR từ các dòng khu n lạc A.tumefaciens M: thang DNA 1 kb; (+): Đối chứng dƣơng là plassmid pZY_GmDREB7A; 1-4: sản ph m colony-PCR gen GmDREB7A từ 4 dòng khu n lạc; (-): Đối chứng âm là A.tumefaciens không biến nạp 32 Hình 3.7 Hình ảnh ở giai đoạn chu n bị mẫu biến nạp: 33 Hình 3.8 Hình ảnh ở giai đoạn nuôi khu n 34 Hình 3.9 Hình ảnh quá trình chu n bị mẫu biến nạp, lây nhiễm và đồng nuôi cấy 35 Hình 3.10 Hình ảnh tái sinh in vitro của cây đậu tƣơng ĐT12 biến nạp gen 36 vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merill] là cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Hạt đậu tƣơng có thể đƣợc dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con ngƣời và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp Đậu tƣơng là loại cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế và là loại cây trồng cải tạo đất Đậu tƣơng rất nhạy cảm với các yếu tố bất lợi và thuộc nhóm cây chống chịu kém Đặc tính chống chịu các yếu tố phi sinh học của cây đậu tƣơng do nhiều gen quy định và sản ph m của mỗi gen có thể liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây hoặc có vai trò điều hòa các gen chức năng Một số gen của đậu tƣơng đã đƣợc mô tả là có phản ứng với các stress phi sinh học ở mức phiên mã, trong đó có nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB (Dehydration responsive element binding protein) Các nhân tố phiên mã DREB thuộc họ AP2/ ERF (APETALA2 / Ethylene-Responsive) của thực vật, có khả năng kích hoạt quá trình phiên mã của các gen phản ứng stress phi sinh học nhƣ hạn, muối, lạnh, nóng…khi có tín hiệu từ môi trƣờng Các protein DREB chứa miền AP2 phổ biến có khoảng 58-59 amino acid và gồm một số amino acid liên quan đến yếu tố phản ứng khử nƣớc DRE (dehydration responsive element) hoặc hộp GCC Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng các stress phi sinh học Nhân tố phiên mã DREB- yếu tố có tác động trans liên kết với trình tự cis của promoter và kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress DREB là nhân tố phiên mã hứa hẹn nhiều ứng dụng trong việc cải thiện tính kháng phi sinh học của thực vật Đến nay, một số gen GmDREB (Glycine max DREB) đã đƣợc xác định có trong hệ gen đậu tƣơng, nhƣ GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, 1