Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dreb7a và tạo cây đậu tương chuyển gen

Luận văn thạc sĩ này đƣợc thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Cơ sở Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên, với tên đề tài là: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa nhân

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––––

VANHSY SYSOUPHANH

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN GmDREB7A

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––––

VANHSY SYSOUPHANH

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN GmDREB7A

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12

Ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu, Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn trong luận đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022

Tác giả luận văn

Vanhsy SYSOUPHANH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Thị Hải Yến, ThS Trần Thị Hồng và các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học

Tôi xin cảm ơn lĩnh đạo Trường Cao đẳng Sư phạm Ban Keun, Viêng Chăn, Lào đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học tại Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khuyến khích, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Luận văn thạc sĩ này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Cơ sở

Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên, với tên đề tài là: “Nghiên cứu

thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB7A và tạo cây đậu tương chuyển gen” do TS Từ Quang Tân làm chủ nhiệm

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2022

Tác giả luận văn

Vanhsy SYSOUPHANH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG 4

1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 10

1.2.1 Phân họ gen DREB ở đậu tương 10

1.2.2 Đặc điểm của gene GmDREB7A trong hệ gen đậu tương 11

1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 14

1.3.1 Chuyển gen ở cây đậu tương nhờ A tumefaciens 14

1.3.2 Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 19

2.1.1 Giống đậu tương ĐT12 19

2.1.2 Các chủng vi khu n và các loại vector 19

2.1.3 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 19

2.1.4 Hóa chất và thiết bị 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa

nhân tố phiên mã GmDREB7A 22

2.2.2 Phương pháp biến nạp gen GmDREB7A và tái sinh cây chuyển gen 24

2.2.3 Phương pháp phân tích cây chuyển gen 28

2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN VĂN 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 THIẾT KẾ VECTOR pZY_GmDREB7A 29

3.1.1 Tạo vector chuyển gen pZY_GmDREB7A 29

3.2 CHUYỂN GEN GmDREB7A VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 33

3.2.1 Kết quả xác định, khử trùng hạt và tạo nguyên liệu biến nạp 33

3.2.2 Nhiễm khu n và tạo cây đậu tương biến nạp gen 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

1 Kết luận 39

2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

BAP 6-Benzyl Amino Purin

CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy

responsive element binding protein 7A

IAA Indoleacetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

bản nuôi cấy vi khu n

SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường tạo chồi

YEP Yeast extract peptone Cao chiết nấm men

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả biến nạp một số gen DREB ở một số loài thực vật 17 Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các mồi PCR sử dụng trong nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt vector pBI121_GmDREB7A và pZY102 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối cấu trúc mang gen GmDREB7A vào

vector pZY102 23

Bảng 2.4 Thành phần colony-PCR khuếch đại gen GmDREB7A từ khu n lạc 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng kiểm tra vector pBI121-GmDREB7A 24 Bảng 2.6 Môi trường nuôi khu n 25 Bảng 2.7 Môi trường tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tương ĐT12 27 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm nạp gen GmDREB7A vào giống cây đậu

tương ĐT12 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB7A (LOC100101894) 11 Hình 1.2 Trình tự gen GmDREB7 trên GenBank 12 Hình1.3 Trình tự mino acid của protein DREB7, miền AP2 (A) và

những vị trí liên kết giữa amino acid với DNA (B) [26] 13 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thực hiện đề tài luận văn 21 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector pZY_GmDREB7A 22 Hình 3.1 Điện di đồ kết quả cắt cấu trúc pBI121_GmDREB7A và

pZY102 29 Hình 3.2 Vector chuyển gen pZY_GmDREB7A 30 Hình 3.3 Điện di đồ kết quả phân tích colony-PCR từ các dòng khu n

lạc E.coli M: marker DNA 1 kb; 1-8: sản ph m colony-PCR 30 Hình 3.4 Điện di đồ sản ph m cắt vector pZY-GmDREB7A bằng Hind III 31 Hình 3.5 Vector pZY_GmDREB7A được kiểm tra bằng giải trình tự

nucleotide 32 Hình 3.6 Điện di đồ kiểm tra sản ph m colony-PCR từ các dòng khu n

lạc A.tumefaciens M: thang DNA 1 kb; (+): Đối chứng dương

là plassmid pZY_GmDREB7A; 1-4: sản ph m colony-PCR gen GmDREB7A từ 4 dòng khu n lạc; (-): Đối chứng âm là A.tumefaciens không biến nạp 32 Hình 3.7 Hình ảnh ở giai đoạn chu n bị mẫu biến nạp: 33 Hình 3.8 Hình ảnh ở giai đoạn nuôi khu n 34 Hình 3.9 Hình ảnh quá trình chu n bị mẫu biến nạp, lây nhiễm và đồng

nuôi cấy 35 Hình 3.10 Hình ảnh tái sinh in vitro của cây đậu tương ĐT12 biến nạp gen 36

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương [Glycine max (L.) Merill] là cây trồng quan trọng trong cơ

cấu cây nông nghiệp ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Hạt đậu tương

có thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp Đậu tương là loại cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế và là loại cây trồng cải tạo đất

Đậu tương rất nhạy cảm với các yếu tố bất lợi và thuộc nhóm cây chống chịu kém Đặc tính chống chịu các yếu tố phi sinh học của cây đậu tương do nhiều gen quy định và sản ph m của mỗi gen có thể liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây hoặc có vai trò điều hòa các gen chức năng Một số gen của đậu tương đã được mô tả là có phản ứng với các stress phi sinh học ở mức phiên mã, trong đó có nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB (Dehydration responsive element binding protein) Các nhân tố phiên mã DREB thuộc họ AP2/ ERF (APETALA2 / Ethylene-Responsive) của thực vật,

có khả năng kích hoạt quá trình phiên mã của các gen phản ứng stress phi sinh học như hạn, muối, lạnh, nóng…khi có tín hiệu từ môi trường Các protein DREB chứa miền AP2 phổ biến có khoảng 58-59 amino acid và gồm một số amino acid liên quan đến yếu tố phản ứng khử nước DRE (dehydration

responsive element) hoặc hộp GCC Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò

quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng các stress phi sinh học Nhân tố

phiên mã DREB- yếu tố có tác động trans liên kết với trình tự cis của promoter

và kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress DREB là nhân tố phiên mã hứa hẹn nhiều ứng dụng trong việc cải thiện tính kháng phi sinh học của thực vật

Đến nay, một số gen GmDREB (Glycine max DREB) đã được xác định

có trong hệ gen đậu tương, như GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3,

GmDREB5, GmDREB6 Một số gen GmDREB đã được tách dòng phân tử,

phân tích biểu hiện và các sản ph m dịch mã của các gen GmDREB này được

khẳng định có chức năng chịu hạn và chịu mặn, trong khi đó chức năng một số

gen GmDREB khác còn chưa được đề cập đến Vì vậy, lựa chọn gen

GmDREB7A và cách tiếp cận làm sáng tỏ chức năng của nó đối với tính kháng

các stress phi sinh học là vấn đề đặt ra cho nghiên cứu này

Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu được ứng dụng ngày càng rộng và nhiều gen mới trong hệ gen của cây đậu tương đã được giải mã chức năng Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu biến nạp gen GmDREB7A vào giống đậu tương ĐT12”

Nghiên cứu này nhằm tạo nguyên liệu cho phân tích di truyền phân tử phục

vụ phát hiện chức năng của gen GmDREB7A của cây đậu tương và tạo các

dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chống chịu các stress phi sinh học được cải thiện

2 Mục tiêu nghiên cứu

Biến nạp và tạo được cây đậu tương chuyển gen GmDREB7A ở giai đoạn chọn lọc in vitro và ở thế hệ T0 trong điều kiện nhà lưới

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa nhân tố

phiên mã GmDREB7A

3.2 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB7A vào đậu tương qua nách lá mầm nhờ Agrobacterium Chọn lọc in vitro và tạo các cây đậu tương

chuyển gen T0

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu biến nạp gen GmDREB7A vào giống đậu tương

ĐT12 có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu chức năng gen

và nâng cao khả năng chống chịu các stress của cây đậu tương bằng kỹ thuật

chuyển gen Dựa trên những thông tin về gen DREB7 (RNA) giả định trên GenBank, gen GmDREB7A đã được thiết kế và tổng hợp phục vụ thiết kế vector biểu hiện gen Vector biểu hiện gen pZY-GmDREB7A được biến nạp vào

mô lá mầm đậu tương, tái sinh tạo cây đậu tương in vitro trong môi trường

chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ basta

Về thực tiễn, cấu trúc vector chuyển gen pZY-GmDREB7A đã được thiết

kế thành công và có thể sử dụng biến nạp di truyền vào đậu tương trong mục đích tăng cường khả năng chịu hạn của cây chuyển gen Đồng thời, những kết

quả bước đầu tạo các cây chuyển gen GmDREB7A T0 phục vụ cho nghiên cứu

chức năng gen và tạo dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chống chịu các stress phi sinh học

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

Đặc điểm sinh học, giá trị kinh tế và dinh dưỡng của cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học Glycine max (L.) Merrill (2n= 40) thuộc họ Đậu (Fabaceae), chi Glycine [2], [9] Đậu tương thuộc loại cây hai lá mầm,

thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt, bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương thuộc loại rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ bên, xung quanh có nhiều nốt sần dài khoảng 1cm, đường kính 5-6 mm và chứa vi khu n

Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm từ nitơ của không khí Thân

cây tròn, mang từ 8 - 14 đốt, trên thân có nhiều lông nhỏ, có 1 - 2 cành hoặc không có cành, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Cây đậu tương có 3 loại lá chính: Lá mầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét Đậu tương là loại cây tự thụ phấn, hoa được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa lưỡng tính và có màu tím hay trắng Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tùy 3 thuộc vào giống và thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sang và nhiệt độ Hoa đậu tương nhỏ, mọc thành từng chùm, mỗi chùm thường có 3 – 5 hoa Quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt; vỏ hạt thường nhẵn và đa dạng về màu sắc khi chín như vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen [2]

Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt và thuộc nhóm cây hàng năm Dựa vào thời sinh trưởng của đậu tương có thể chia làm 3 nhóm: nhóm ngắn ngày thời gian sinh trưởng từ 75-80 ngày, nhóm trung ngày thời gian sinh trưởng 85-95 ngày, nhóm dài ngày thời gian sinh trưởng từ 100 -120 ngày

Nhu cầu nước của cây đậu tương không đồng đều qua các giai đoạn, độ

m của đất trung bình là 50- 60 %, giai đoạn ra hoa, hình thành quả khoảng 70

% - 80 % Vì vậy, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu cao về

nước và trong các loài cây họ đậu, đậu tương được xem là cây trồng chịu hạn nhạy cảm nhất [9] Tổng sản ph m quang hợp của cây sẽ giảm nếu bị thiếu nước Thiếu nước trầm trọng sẽ ảnh hưởng tới sự hình thành diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử trong quang phosphoryl hoá, ảnh hưởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào quá trình đồng hoá carbon Từ đó dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ chất khô của cây Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng thiếu nước Theo Manavalan

và cs (2009), năng suất của đậu tương giảm từ 32 – 44 % nếu gặp hạn ở giai đoạn kết hạt Do vậy, thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã được chứng minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất Theo Huang và cs (1975), hoạt động cố định đạm giảm khi thế nước giảm và ngừng lại khi trọng lượng nốt sần giảm dưới 80 % so với khi đủ nước Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuếch tán O2 Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy urea ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần

Các nhân tố sinh thái cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Đất trồng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, tơi xốp, sẫm màu, thoáng, thoát nước, pH từ 6,5 -7,2 Thời kỳ mọc nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 22 , phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho thời kỳ mọc là

10 và 40 Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng cành lá là 20 - 23 , thấp nhất là 15 , cao nhất là 37 Nhiệt độ dưới 10 ngăn cản sự phân hoá hoa, dưới 18 đã có khả năng làm cho quả không đậu Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ ra hoa là 22 - 25 Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ hình thành quả và hạt là 21 - 23 , thấp nhất là 16 cao nhất là 35 Thời kỳ chín nhiệt

độ thích hợp nhất là 19 - 20 Nhiệt độ 25 - 27 hoạt động của vi khu n nốt sần tốt nhất [9]

Về giá trị kinh tế, sản ph m đậu tương được lưu hành trên thế giới chủ

yếu dưới 3 dạng: hạt, dầu và bột Đậu tương là loại cây lấy dầu giữ vai trò quan trọng hàng đầu trên thế giới Dầu đậu tương được sử dụng làm thực ph m như dầu rán, salat Trong công nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo…Bên cạnh dầu đậu tương thì bột đậu tương cũng là sản ph m tham gia trong nhiều mặt hàng hóa khác nhau Bột đậu tương là thành phần quan trọng trong kh u phần thức ăn Hạt đậu tương có thể chế biến thành nhiều loại thực ph m khác nhau như các loại thức ăn như đậu phụ, tương và sữa đậu nành [2]

Về giá trị dinh dưỡng, đậu tương là cây thực ph m có hiệu quả kinh tế

lại dễ trồng Đây là loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cai tạo đất Đậu tương giàu hàm lượng chất đạm protein được trồng để làm thức

ăn cho người và gia súc Trong hạt đậu tương có các thành phần dinh dưỡng cao như protein (30-40 %), lipid (12-25 %), glucid (10-15 %): có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose Protein đậu tương có đủ các acid amin cơ bản, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoài ra, đậu tương còn là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể người [2]

Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể Đậu tương được trồng ở cả 7 vùng sinh thái, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước, trong đó 70 % ở miền Bắc và

30 % ở miền Nam Cây đậu tương ở nước ta được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng 65 %) và 35 % được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng Sông Hồng [6]

Tác động của các yếu tố bất lợi và tính chống chịu của đậu tương

Các tác động bất lợi từ ngoại cảnh hay những stress có thể là nhân tố sinh học hoặc phi sinh học Các stress phi sinh học thường xuyên tác động đến thực vật nói chung, cây đậu tương nói riêng Những yếu tố phi sinh học gây ra stress là úng nước, hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, đất mặn, thiếu chất dinh dưỡng trong đất; ánh sáng, gió, kim loại nặng và tổn thương cơ học Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với stress phụ thuộc vào đặc tính của loài, kiểu gen và khác nhau giữa các giai đoạn phát triển của thực vật Những phản ứng của thực vật đối với các tác động của các stress thể hiện ở sự thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi tỉ lệ sinh trưởng và năng suất Thời gian, mức độ khốc liệt của stress ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của cây trồng Tính chống chịu là khả năng của thực vật ngăn ngừa, kháng lại

và chịu đựng được các tác động bất lợi từ ngoại cảnh Có ba dạng chống chịu các stress phi sinh học, đó là khả năng tránh stress (stress avoidance), khả năng kháng stress (stress tolerance) và khả năng chịu đựng được các stress [4], [9]

Trong các nhân tố phi sinh học, hạn và mặn là hai nhân tố ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất đậu tương Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật Hạn cũng như những yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tùy theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại khô hạn gây ra khác nhau: một số bị chết, một số bị tổn thường, một số khác bị ảnh hưởng, còn số khác có thể không bị ảnh hưởng Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây Trong giai đoạn hình thành hạt, tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm tác động lên cây theo hai hướng chính: làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa

là sản ph m khởi đầu vừa là sản ph m trung gian và cuối cùng các quá trình

chuyển hóa sinh học Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra,

do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng là mục tiêu tạo giống chống chịu thường xuyên được quan tâm Nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ

cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào của cây tròng cũng tác động đến các yếu tố năng suất của cây trồng trong điều kiện các phản ứng sinh hóa khác nhau, tích lũy nhều loại chất dễ hòa tan, như amino acid, polyamine và glycine betaine Cơ sở phân tử của đặc tính chịu hạn ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng cũng dần được sáng tỏ [4], [6], [9]

Nồng độ các muối trong đất trồng ảnh hưởng rất lớn đến trao đổi nước của thực vật Thực vật sống trên đất nhiễm mặn chịu hai tác động sinh lý, đó là hiện tượng hạn sinh lý, nước sẽ th m thấu từ tế bào ra ngoài môi trưởng; và tác dụng gây độc tế bào của các ion trong đất nhiễm mặn [1] Hàm lượng muối cao trong đất có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng vì chúng làm thay đổi hệ vi sinh hoạt động trong đất và chúng trực tiếp làm suy giảm sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Muối NaCl tác động đến thực vật ở hai phương diện, th m thấu và ino gây hại trao đổi chất Về phương diện th m thấu, NaCl làm tăng áp suất th m thấu ở môi trường ngoài, nên cản trở sử hút nước của cây; đồng thời làm mất nước của tế bào rẽ cây và tế bào khí khổng gây đóng khí khổng Về mặt gây hại cho trao đổi chất, Na+

cạnh tranh K+ ở vị trí liên kết với các enzyme, trong khi K+

kính hoạt hơn 50 enxyme trong tế bào, điều mà in on Na+

không có chức năng này Bên cạnh đó, khi Na+ vào tế bào lại đòi hỏi tổng nhiều chất tan tương thích ở chất nguyên sinh tiêu tốn nhiều ATP

và gây hại quá trình trao đổi chất Sự cân bằng nội môi của các ion rất quan trọng bởi vì nồng độ ion rất cao hoặc rất thấp có thể ức chế hoạt động của enzyme trong tế bào Hầu hết các enzyme có thể bị ức chế bởi nồng độ Na+

bắt

đầu ở 100 mM Các lá già đi cùng với sự giảm hàm lượng diệp lục và khả năng quang hợp [84] Khi bị nhiễm mặn thực vật hạn chế khả năng th m thấu nước của màng tế bào [108] Sự tích lũy và duy trì nồng độ cao các chất tan trong tế bào làm tang áp suất th m thấu chống lại hiện tượng hạn sinh lý [1], [10]

Cây trồng có thể tránh được những tác động tiêu cực của điều kiện mặn

là hạn chế sự xâm nhập của các ion Đồng thời thực vật có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với tác động của muối trong môi trường đất và nước Tuy nhiên, mức độ chống chịu mặn còn phụ thuộc vào kiểu gen của thực vật Các cơ chế sinh lý và sinh hóa khác nhau trong tế bào đã giúp thực vật tồn tại, sinh trưởng và phát triển trong môi trường có nồng độ muối cao Các cơ chế bao gồm (1) cân bằng nội môi và ngăn ngừa ion, (2) vận chuyển và hấp thu ion (3) sinh tổng hợp các chất bảo vệ th m thấu và các chất hòa tan tương thích, (4) kích hoạt enzyme chống oxy hóa và tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa, (5) tổng hợp polyamine, (6) tạo oxit nitric (NO), và (7) điều chế hormon [10]

Các gen của thực vật phản ứng với stress phi sinh học có thể chia thành 2 nhóm chính: Nhóm gen chức năng mà sản ph m của chúng tham gia trực tiếp vào các phản ứng stress hạn như gen điều hòa áp suất th m thấu, gen mã hóa các protein chống oxy hóa, gen mã hóa protein LEA (Late embryogenesis abundant), gen mã hóa protein vận chuyển LTP (Lipid trasfer protein), aquaporin; nhóm gen điều khiển cho ra các sản ph m bao gồm các nhân tố phiên mã và các protein kinase truyền tín hiệu Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả năng chống chịu các nhân tố phi sinh học đang được quan tâm nghiên cứu bao gồm DREB, WRKY, bZIP, MYB, NAC và AP2/ERF Như vậy các nhân tố phiên mã trong phân họ DREB đối tượng hấp dẫn cho nghiên cứu đặc tính chống chịu hạn và cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương [9]

1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.2.1 Phân họ gen DREB ở đậu tương

Trước đây từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nghiên cứu về DREB điều khẳng định rằng đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tiến hành giải trình tự gen DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình chống chịu và so sánh trình tự gen này ở các loài thực vật khác nhau như:

họ các (Asteraceae), hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum

aestivum L.) [8]

Các thành viên trong phân họ gen DREB đã được phân lập, mô tả và các nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến sự phản ứng và các nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách quy định biểu hiện gen thông qua các trình tự thuộc họ AP2/ERF Nguyễn Thị Ngọc Lan và cs đã khai thác từ cơ sở dữ liệu và xác định được 41 gen DREB của đậu tương, phân

tích mở rộng những bản copy gen DREB và những trình tự gen GmDREB đã

phân lập từ một số giống đậu tương Việt Nam đã xác định 69 trình tự gen

GmDREB khác nhau trên GenBank Từ các trình tự DREB nghiên cứu đã được

xác định thuộc về 18 gen GmDREB Các gen GmDREB có từ 1 đến 8 bản copy, phân bố trên 17 nhiễm sắc thể, trong đó GmDREB3 có 8 copy, còn lại các gen

GmDREB khác có 1 - 4 copy Miền AP2 của protein DREB phổ biến là motif

PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPEL, chứa 11 điểm liên kết với promoter của các gen chức năng, với 4 dạng và phổ biến là RGRRWKERRWT (có ở 13/18 protein DREB) [8] Miền AP2 ở protein DREB suy diễn từ 18 gen

GmDREB của đậu tương có sự sai khác về thành phần và số lượng amino acid

Miền AP2 trong các protein thuộc phân họ nhân tố phiên mã DREB phổ biến từ 59-60 amino acid, tuy nhiên một số protein DREB chứa miền AP2 có tới 62 amino acid (DREB5), có 63 (DREBA), có 53 amino acid (DREB3-like), hoặc chỉ có 43 amino acid (DREB2C-like) Motif PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPELcủa miền AP2 có ở tất cả các protein DREB của đậu tương Miền AP2 của các thành viên trong phân họ protein DREB có các điểm liên kết với promoter của gen chức năng mà nhân tố phiên mã DREB kích hoạt phiên mã Kết quả so

sánh cho thấy trong miền AP2 của 18 protein DREB ở đậu tương đều có 11 amino acid liên kết với sợi DNA ở vùng promoter (DNA binding site) với 4 dạng và phổ biến là RGRRWKERRWT, tìm thấy ở 13/18 protein DREB Ngoài ra còn hai dạng KGRRNKERRWT và KGRRWKERRWT (có ở 2/18 protein DREB) và dạng RGRRTKERRWT chỉ có ở một loại protein DREB [10]

Một số thành viên của phân họ DREB chứa miền AP2 được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc,

GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [8],

[9] Với trình tự và độ dài khác nhau nhưng mỗi gen trong phân họ DREB đều

có những biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các điều kiện stress hạn, mặn, sốc nhiệt Trong khi nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh thì nhóm

DREB2 lại có vai trò chủ yếu trong điều khiển tính chịu hạn, chịu nóng,…

Trong số các gen GmDREB trong hệ gen của cây đậu tương, một số gen đã được làm rõ chức năng, như GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3,

GmDREB5 GmDREB3 làm tăng cường khả năng chịu lạnh, hạn và mặn ở cây Arabidopsis biến đổi gen GmDREB5 liên quan đến khả năng chịu mặn Tuy

nhiên, ở phân họ gen này, thông tin về chức năng của một vài gen GmDREB còn chưa đầy đủ, ví dụ như gen GmDREB6, GmDREB7

1.2.2 Đặc điểm của gene GmDREB7A trong hệ gen đậu tương

Trình tự gen mang mã số NM_001248108 trên GenBank là trình tự tham

chiếu phân lập từ mRNA của đậu tương và được gán nhãn GmDREB7A

Gen GmDREB7 có ID là 100101894 nằm trên nhiễm sắc thể số 20 của

đậu tương (Hình 1.1)

Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB7A (LOC100101894)

trên nhiễm sắc thể số 20 [24]

Trình tự GmDREB7A trên GenBank có hai phiên bản NM_001248108.1

và NM_001248108.2 Trình tự gen GmDREB7A mang mã số NM_001248108.2 (cập nhật ngày 29/4/2021) có kích thước 879 bp, vùng mã hóa có 624 kb (Hình 1.2)

Hình 1.2 Trình tự gen GmDREB7 trên GenBank [25]

Protein suy diễn từ gen GmDREB7 trên NCBI có 207 amino acid, miền AP2 có

59 amino acid (Hình 1.3A) và có 11 vị trí amino acid liên kết với promoter (DNA binding site) (Hình 1.3B)

Hình1.3 Trình tự mino acid của protein DREB7, miền AP2 (A) và những vị trí

liên kết giữa amino acid với DNA (B) [26]

A

B

1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1 Chuyển gen ở cây đậu tương nhờ A tumefaciens

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết

kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, .) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen Gen chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản ph m biểu hiện của gen phải thể hiện được chức nặng sinh học

Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm vi khu n, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào Trong các hệ thống trên, thực vật có nhiều lợi thế trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón , công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào, cho nên giá thành thấp

Chuyển gen ở đậu tương đã được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1988, [14], [17] tuy nhiên, sau hơn hai thập kỷ qua, việc chuyển gen ở đậu tương có thể vẫn chưa được coi là ổn định, bởi vì nó phụ thuộc vào khả năng kết hợp của các phương pháp chuyển gen và tái sinh cây chuyển gen có hiệu quả Hai phương pháp được sử dụng với mức độ thành công tương đối lớn để tạo cây trồng biến đổi gen là sử dụng súng bắn gen và hệ thống chuyển gen thông qua

A.tumefaciens Cả hai hệ thống này đều quan trọng đối với nghiên cứu cơ bản

và ứng dụng trong nông nghiệp

Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua A.tumefaciens là một vi khu n

gram âm được sử dụng rộng và phổ biến trong đất và gây bệnh khối u ở thực

vật A.tumefaciens có khả năng lây nhiễm tự nhiên giữa của các loại thực vật

A.tumefaciens có thể lây nhiễm thông qua Ti plasmid của một phân tử DNA

kích thước khoảng 150-200kb Chỉ có một giai đoạn DNA nhờ T-DNA, 2-3 kb Các gen tạo khối u trên T-DNA khi xâm nhập hệ gen tế bào chủ tham gia vào quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin Xuất phát từ nguyên lý xâm nhập của Ti-plasmid và hoạt động của T-DNA, nhà khoa học đã cải biến Ti-plasmid làm vector chuyển gen ở thực vật, Ti-plasmid được cắt bỏ các đoạn gen gây phát triển khối u để lại đoạn gen vir và T-DNA tối tiểu mang điểm có thể chép

gen ngoại lại Sự biến nạp bằng vi khu n Agrobacterium là lựa chọn tốt nhất để

chuyển đổi thực vật do hoạt động đơn giản, số lượng bản sao thấp và chi phí thí nghiệm tiếp [9], [18]

Liên quan đến các hệ thống chuyển gen được sử dụng, quá trình tạo cây đậu tương chuyển gen thường đòi hỏi phải có một hệ thống chọn lọc hiệu quả

để xác định và lựa chọn các dòng mô biến đổi gen Việc sử dụng chất kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ đã cho phép chọn được vật liệu biến đổi gen Chất kháng sinh hygromycin đã được sử dụng thành công như là một trung gian lựa chọn và trở thành tiêu chu n cho việc chọn lọc các dòng mô chuyển gen ở đậu tương, đặc biệt là các mô phôi [18] Sử dụng kanamycin bổ sung vào môi trường chọn lọc chồi, cây chuyển gen tái sinh từ nách lá mầm [7] Một số nghiên cứu đã báo cáo việc sử dụng thuốc diệt cỏ để chọn lọc các dòng mô chuyển gen ở cây đậu tương Rao và cs (2009) đã phát triển thành công một

hệ thống chọn lọc phôi soma sử dụng gen E.coli dapA kháng glufosinate,

glyphosate, S-2 aminoethyl-L-cysteine và imidazolinones [20] Hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương đã được tối ưu hóa nhờ sử dụng các mức tối ưu

của glufosinate trong việc chọn lọc chồi chuyển gen phục hồi từ các nách lá mầm [22]

Chuyển gen thông qua A tumefaciens sủ dụng các nách lá mầm của hạt

đậu tương cấy để thu được cây đậu tương chuyển gen bằng phương pháp biến

nạp vi khu n A tumefaciens Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn một số hạn

chế cần được khắc phục như thao tác tạo tổn thương cần có độ chính xác cao Chuyển gen ở đậu tương qua nách lá mầm là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất và mang lại hiệu quả cao Các kết quả biến nạp di truyền qua nách lá mầm

và phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương ở một số giống đậu tương Việt Nam đã được công bố [3], [4], [7] Nhận xét của Nguyễn Thị Thúy Hường cho rằng giống đậu tương DT84 là đối tượng phù hợp để tiến hành các

thí nghiệm chuyển gen GmP5CSm và tạo được một số dòng đậu tương mang

gen đột biến loại bỏ ức chế phản hồi, làm tăng cường khả năng tổng hợp prolin khi cây đậu tương bị hạn [6] Các nghiên cứu tiếp theo đều được thực hiện qua

nách lá mầm nhờ A tumefaciens [5], [10], [11], [12], [13]

1.3.2 Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương

Các stress phi sinh học (hạn, mặn, lạnh, …) là các yếu tố ngoại cảnh làm giảm năng suất, sản lượng cây trồng Hướng tiếp cận chủ yếu hiện nay trong việc cải thiện tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh thông qua việc chuyển gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chống chịu và chuyển gen

mã hóa protein nhân tố kích hoạt quá trình từ giống cây trồng chống chịu tốt sang giống cây trồng chống chịu kém Ở Việt Nam, một số nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trong mục đích tạo dòng đậu tương nâng cao khả năng chống chịu các nhân tố bất lợi từ ngoại cảnh Điển hình là các tác giả Trần Thị Cúc Hòa (2007) [4], Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) [6], Lò Thị Mai Thu (2014) [13], Lò Thanh Sơn (2015) [11], Đào Xuân Tân (2017) [12], Phtthakone Vaciava (2021) [10], Ngô Mạnh Dũng (2021) [5]

Đối với nhóm gen DREB, một số kết quả chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chống chịu đã thành công ở một số loại cây trồng (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Kết quả biến nạp một số gen DREB ở một số loài thực vật [9]

Gen DREB Loài Kiểu hình phản ứng với chịu stress

DREB2A Arabidopsis Hạn và nhiệt độ cao

DREB2B Arabidopsis Khô hạn và khả năng chịu nhiệt đô cao

Quá trình phiên mã của các gen chức năng có khả năng đáp ứng hạn và mặn là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong sự phát triển của cây trồng Nhân

tố phiên mã DREB kích hoạt làm tăng mức độ phiên mã của các gen chức năng

và tăng tính kháng các stress phi sinh học, đặc biệt là hạn, mặn và lạnh Cho

đến nay, một số gen DREB ở đậu tương như DREB1, DREB2, DREB5,

DREB6, DREB7 đã được phân lập và phân tích đặc điểm Một số báo cáo phân