Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất Vaccine thực vật Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(0[.]
Nguyễn Thu Hiền Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Nguyễn Thu Hiền1, Chu Hoàng Mậu1*, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Hà2 Đại học Thái Ngun; Viện cơng nghệ sinh học,VAST TĨM TẮT H5N1 phân nhóm cúm A, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiếp xúc trực tiếp với gia cầm nhiễm bệnh Để ngăn chặn lây nhiễm virus, phương pháp phổ biến tiêm phịng Hiện nay, có nhiều loại vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 bán sẵn thị trường Tuy nhiên, vaccine đường miệng mục tiêu nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới, vaccine ăn được, dễ quản lý có khả kích thích thể sản xuất kháng thể có hiệu so với loại vaccine tiêm Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu tạo đậu tương biến đổi gen giống đậu tương DT12 trồng phổ biến Việt Nam, cách lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp vào nách mầm Kiểm tra chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết có dương tính với PCR Các kết sở cho việc tạo giống đậu tương biến đổi gen sản xuất kháng ngun phịng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 Việt Nam Từ khoá: Biểu hiện, kháng nguyên, thực vật chuyển gen, H5N1, vaccine thực vật MỞ ĐẦU* Cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm, nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả lan truyền từ động vật sang người Theo Tổ chức y tế giới (WHO) tính từ 2003 đến tồn giới ghi nhận 562 trường hợp mắc cúm A/H5N1 15 quốc gia có 329 trường hợp tử vong cịn Việt Nam có 119 trường hợp mắc 59 trường hợp tử vong (WHO 2011) Đối với dịch cúm người, nghiên cứu phát triển vaccine ngăn ngừa làm giảm bệnh gia cầm, mà khống chế nguồn truyền lây loại virus nguy hiểm sang người.Vaccine ăn thực vật vaccine tiểu phần protein sản xuất dựa hệ thống thực vật để thu protein làm miễn dịch thể dịch miễn dịch tế bào Vaccine bền vững dịch tiêu hóa, qua đường tiêu hóa mà khơng bị phân hủy [5] Với phát triển cơng nghệ sinh học, diện tích trồng biến đổi gen giới ngày tăng đậu tương biến đổi gen chiếm diện tích lớn tổng diện tích trồng biến đổi gen.Một * Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com biện pháp chuyển gen mang lại hiệu cao áp dụng rộng rãi phương pháp chuyển gen thông qua A.tumfaciens [6] Trong báo sử dụng giống đậu tương DT12 làm đối tượng để chuyển gen mã hố hemaglutinin(HA1) virus H5N1 thơng qua phương pháp nách mầm nhờ vi khuẩn A.tumfaciens nhằm sở cho việc sản xuất vaccine ăn cho gia cầm phòng chống bệnh A/H5N1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Giống đậu tương ĐT12 Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ, Viện lương thực thực phẩm cung cấp Chủng vi khuẩn A.tumefaciens EHA105 chứa vector pBeta-Phaso-HA Viện công nghệ sinh học cung cấp Phương pháp nghiên cứu Tạo nguyên liệu chuyển gen Hạt đậu tương chín sau khử trùng, nảy mầm hạt, tách thu phần mầm (tương tự tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro quy trình tái sinh cây) gây tổn thương mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào nách mầm Lá mầm làm tổn thương dùng cho bước nhiễm khuẩn 123 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thu Hiền Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 Bảng Thành phần môi trường tái sinh đậu tương Môi trường Nảy mầm hạt (GM) Môi trường đồng nuôi cấy (CCM) Môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) Môi trường kéo dài chồi (SEM) Môi trường tạo rễ (RM) Thành phần 3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 mg/l vitamin B5 0,3052 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,4 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP+ 0,2 mM acetosyringon + 400 mg/l Lcystein + 158 mg/l sodium thiosulfate + 154 mg/l DTT + 0,25 mg/l GA3 3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,6 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP + 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,6 mg/l vitamin B5 + 50 mg/l L-asparagine + 100 mg/l L-pyron glutamic acid + 0,1 0,5 mg/l IAA + 0,5 -1,5 mg/l GA3+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin 1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,6 0,1 mg/l IBA + mg/l vitamin B5+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải A tumefaciens EHA 105 mang vector chuyển gen giữ chủng glycerol lên đĩa mơi trường YEP đặc, có bổ sung kháng sinh là: 50 g/l rifamycin 100 mg/l spectinomycin Đĩa khuẩn đặt tủ 280C điều kiện tối ngày Nuôi lỏng vi khuẩn: dùng que cấy chọn khuẩn lạc đĩa khuẩn cho vào 50 ml YEP lỏngcó bổ sung 50 g/l rifamycin 100 mg/l spectinomycin Ni lắc 200 vịng/phút 280C 16h Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu từ q trình ni lỏng ly tâm 5000v/p 10 phút 40C Loại bỏ phần dịch hịa tan cặn khuẩn mơi trường CCM lỏng có bổ sung acetosyringone 200 mg/l pha lỗng dịch khuẩn có OD660nm đạt 0,8-1 Dịch huyền phù dùng cho biến nạp Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy Môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc có bổ sung acetosyringone 200 mg/l, thành phần môi trường bảng 1.CCM đổ đĩa petri, khô đặt giấy thấm khử trùng lên bề mặt môi trường Mẫu ngâm dịch huyền phù vi khuẩn thời gian 30 phút Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu chuyển sang mơi trường đồng ni cấy CCM đặc Q trình đồng nuôi cấy diễn tối, 250C thời gian ngày Diệt khuẩn tạo đa chồi Mẫu sau thời gian đồng nuôi cấy lắc mơi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim thời gian 10 phút Sau đó, đặt mẫu lên giấy thấm khử trùng, thấm khô mẫu Dùng panh dao cắt bỏ chồi xuất mảnh mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi SIM đặc, có bổ sung 500 mg/l cefotaxim Sau thời gian tuần, mẫu chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ dung 500 mg/l cefotaxim, tuần Tái sinh hoàn chỉnh Các cụm chồi sống môi trường chọn lọc chuyển sang mơi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung kháng sinh 500 mg/l cefotaxim 50mg/l kanamycine Khi chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5 cm chuyển sang mơi trường rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxim 25mg/l kanamycine Cây To tái sinh hồn chỉnh chuyển trồng đất chăm sóc nhà lưới Kiểm tra chuyển gen phản ứng PCR DNA tách chiết theo phưong pháp Edwards(1991) [7].Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen HA1 theo chu kì nhiệt: 940C/5 phút 30 chu kì 124 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thu Hiền Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ (940CC/30 giây, 540C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây 720C/7 phút 40C/30 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá khả tạo chồi Hiệu chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn vật liệu ban đầu, môi trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn, vector chuyển gen, Trong nghiên cứu này, mầm – ngày tuổi sử dụng làm vật liệu chuyển gen giai đoạn này, việc tách đôi hai mầm thực dễ dàng, đồng thời chồi chồi bên phát loại bỏ nhằm tránh tượng ưu ảnh hưởng đến phát triển mô phân sinh phụ nằm vùng nách 89(01/2): 123 - 127 mầm.Việc sử dụng dao gây tổn thương nách mầm giúp cho mẫu vật sản sinh hợp chất phenolic có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả xâm nhiễm vi khuẩn Ngoài ra, tổ hợp hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol sodium thiosulfate) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy CCM giúp làm tăng khả gắn T-DNA vào gen thực vật tăng hiệu chuyển gen (Olhoft et al., 2001) Tiến hành thí nghiệm với tổng số 650 mẫu cho chuyển gen HA, có 65 chồi kéo dài mơi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, 45 chồi có khả rễ thu nhận 32 T0 phát triển giá thể (bảng2) Bảng Khả tái sinh thông qua nách mầm giống đậu tương ĐT12 Lơ thí nghiệm Số mẫu biến nạp Tổng 250 220 180 650 Hạt đậu tương Ra cát/trấu Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài 80 70 55 205 Hạt sau khử trùng ngày Ra rễ RM/4 tuần Số chồi rễ 30 25 20 65 16 25 14 45 Số sống giá thể 12 10 10 32 Gây nhiễm 40’ Cảm ứng tạo chồi SIM-Km50/5d Kéo dài chồi SEM-Km50/ -8 tuần Chọn lọc SIMKm75/4 tuần Hình Quy trình chuyển gen đậu tương 125 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thu Hiền Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ Kết kiểm tra chuyển gen HA phản ứng PCR Sử dụng 3µl sản phẩm DNA tách chiết, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy thu nhận dương tính với phản ứng PCR nhân gen HA, chiếm tỷ lệ 1,2 % tổng mẫu biến nạp (Hình2) Các dịng tiếp tục trồng để thu hạt đánh giá biểu gen chuyển hệ sau( hình 3) Hình Phân tích đậu tương T0 chuyển gen HA M: Thang DNA chuẩn 1kb; -: Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển gen; – 8: Các dịng T0 phân tích; +: Đối chứng dương (plasmid) KẾT LUẬN Hình Các đậu tương chuyển gen hệ T0 trồng nhà lưới 89(01/2): 123 - 127 Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua nách mầm nhờ vi khuẩn A.tumefacien, bước đầu thu dòng T0 mang gen HA Đây tiền đề quan cho việc tạo dòng đậu tương mang gen mã hoá cho kháng nguyên virus H5N1 làm vacine ăn đựơc cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bardiya N and Bae JH (2005) Influenza vaccines: recent advances in production technologies Appl Microbiol Biotechno 67: 299 – 305 [2] Biemelt S, Sonnewald U, Galmbacher P, Willmitzer L, Mueller M (2003) Production of Human Papillomavirus Type 16 Virus-Like Particles in Transgenic Plants J Virol 77: 9211-9220 [3] Binh LT and Trang CH (2005) Research and development of plant edible vaccines J Biotech 3: 133-143 [4] Bolivar FM, Wright R, Funk V, Sentz D, Barrroso L, Wilkins TD, Petri W, Cramer CL (2003) A non – toxic lectin for antigen delivery of plant – based mucosal vaccine Vaccine 21: 997-1005 [5] Dinh DK, Le TH, Nong VH, Phan VC, Nguyen BN, Nguyen DT and Le TB (2004) Molecular analysis of the avian influenza virus H5N1 isolated inpoultry in Vietnam GenBank Acc Number AY574192 [6] Donaldson PA, Simmonds DH (2000) Susceptibility of A.tumefaciens andcotyledonary node transformation in shor-season soybean Plant Cell Rep 19: 478-484 [7] Edwards K, Johnstone C and Thompson C (1991) A simple and rapid method for thepreparation of genomic plant DNA for PCR analysis Nucleic Acids Res 19: 1349 [8] Fischer R, Stoger E, Schillberg S, ChristouP and Twyman RM (2004) Plant-based production of biopharmaceuticals CurrOpinion in Plant Biol 7: 152-158 126 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thu Hiền Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 SUMMARY THE STUDY CREATED TRANSGENIC SOYBEAN CULTIVARS BEARING STRUCTURE EXPRESSED GENES ENCODING SURFACE ANTIGEN OF THE H5N1 VIRUS FOR PRODUCTION OF PLANT VACCINE Nguyễn Thu Hien1, Chu Hoang Mau1*, Le Van Son2, Chu Hoang Ha2 Thai Nguyen University, 2Institute of Biotechnology H5N1 is a subtype of influenza A, it affects human health by direct contact with infected poultry To prevent the virus infection, the most common method today is vaccination Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market To prevent the viral infection, the most common method is vaccination Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market However, the oral vaccine is the research targeted of scientists in the world, because this vaccine can eat, easy to manage and able to stimulate the body to produce antibodies and have more effectively than the other injected vaccine In this paper, we present the results of research to create genetically modified soybean cultivars from DT12 soybean in Vietnam, by infecting in cotyledonary-node by bacteria A.tumefaciens carrying recombinant vector Testing these genetically modified soybean plant by PCR with specific primers, results show there were positive cultivars with PCR These results are base for creating transgenic soybean cultivars with can produce antigen poultry flu A/H5N1 disease for in Vietnam These results are the basis for creating the genetically modified soybean, can produce antigen A/H5N1 bird flu in Vietnam Keywords: Antigen, gene expression, H5N1, transgenic plant, plant vaccine * Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com 127 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... bước đầu thu dòng T0 mang gen HA Đây tiền đề quan cho việc tạo dịng đậu tương mang gen mã hố cho kháng nguyên virus H5N1 làm vacine ăn đựơc cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 Việt Nam TÀI LIỆU... WT: Cây không chuyển gen; – 8: Các dịng T0 phân tích; +: Đối chứng dương (plasmid) KẾT LUẬN Hình Các đậu tương chuyển gen hệ T0 trồng nhà lưới 89(01/2): 123 - 127 Sử dụng phương pháp chuyển gen. .. khả tạo chồi Hiệu chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn vật liệu ban đầu, môi trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn, vector chuyển gen, Trong nghiên cứu này, mầm – ngày tuổi sử dụng làm vật