Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protein azurin trong escherichia coli bl21

Trong một nghiên cứu khác thì azurin đã được chứng minh là cho phép thoái triển các khối u UISO-Mel-2 ở người được cấy ghép trên chuột và có thể được sử dụng trong điều trị ung thư Yasee

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HỒNG NGHI

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TRONG

ESCHERICHIA COLI BL21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HỒNG NGHI

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TRONG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các Thầy Cô, bạn bè và người thân Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo – QLKH&HTQT, Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong qua trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Khá, người Thầy đã tận tình chỉ bảo và cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu về phương pháp nghiên cứu cũng như kiến thức chuyên ngành

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ Giáo dục và Đào tạo

“Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli sản xuất protein Azurin có hoạt tính

ức chế tế bào ung thư vú”, mã số B2019-TNA-16

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên để tôi hoàn thành khóa học này

Thái nguyên, tháng 6 năm 2021

Học viên

Phạm Thị Hồng Nghi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về protein azurin 3

1.1.1 Sơ lược về protein azurin 3

1.1.2 Cấu trúc của gen azurin 4

1.1.3 Khả năng chống ung thư 6

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin 10

1.3 Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam 12

1.4 Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Azurin 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 16

2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid 16

2.1.2 Thiết bị dụng cụ và hóa chất 16

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp sinh học phân tử 18

2.3.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp 20

2.3.3 Phương pháp điện di 20

2.3.4 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với các dòng tế bào ung thư 21 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Thiết kế vector biểu hiện 24

3.2 Biểu hiện gen azurin 26

3.3 Tinh sạch azurin tái tổ hợp 27

3.4 Khả năng ức chế tế bào ung thư vú của Azurin tái tổ hợp 28

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

5 HIV Human Immunodeficiency Virus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 16 Bảng 2.2 Các dung dịch và đệm sử dụng 18 Bảng 3.1 Trình tự khung đọc mở của azu_VTCC-B-657 trong pET22b+ 25 Bảng 3.2 Khả năng ức chế tế bào MCF7 của Azurin tái tổ hợp ở các nồng độ khác nhau 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc của protein azurin 5 Hình 1.2 Cơ chế azurin gây ra quá trình apoptosis và ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư ở người 6 Hình 2.1 Cấu trúc vector biểu hiện pET-22b(+) 19

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm thôi gel azu_VTCC-B-657 (1) và pET22b(+) (2) sau khi cắt với BamHI và XhoI 24

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET22b(+)_azu_VTCC-B-657 với BamHI và XhoI 25

Hình 3.3 Cấu trúc biểu hiện pET22b(+)-azu 26 Hình 3.4 SDS-PAGE protein tổng số của tế bào E.Coli BL21 tái tổ hợp biểu

hiện 26 Hình 3.5 SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch mẫu Azurin tái tổ hợp 27 Hình 3.6 Thử hoạt tính azurin ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào MCF7 29

MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề

Azurin là một protein được sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa có hoạt tính ức chế tế bào ung thư thông qua ổn định protein p53

Trong nhân, azurin tăng cường mức độ p53 nội bào, kích thích sản xuất cytochrome c vào bào tương Quá trình này kích hoạt các caspase khác (bao

gồm cả caspase-7 và caspase-9) bắt đầu quá trình apoptosis (Punj et al ,2004)

Apoptosis là một quá trình thiết yếu trong tế bào phát triển và duy trì cân bằng nội môi của tế bào Azurin có tác dụng hiệu quả hơn nhiều khi thâm nhập vào tế bào khối u so với tế bào bình thường Quá trình này do vùng domain Azu 50-70

(p28) thực hiện ( Bernardes et al , 2013) p28 ưu tiên tác động vào các dòng tế

bào ung thư vú ở người MCF-7, ZR-75-1, và T47D thông qua con đường trung gian caveolin p28 và peptide tương tự làm giảm sự suy thoái của p53 (Yamada

et al , 2009) Vasu và cộng sự nghiên cứu cho thấy azurin hoạt động mạnh gây

độc tế bào, đối với các bệnh ung thư vú dòng tế bào MCF-7, làm tăng cường độ quá trình apoptosis hơn 50% Ngoài tác dụng ức chế tế bào ung thư vú, protein azurin còn có khả năng ức chế tế bào ung thư biểu mô vẩy, tế bào lưới sarcoma

Theo GLOBOCAN năm 2020, Ung thư vú (UTV) là ung thư ở nữ đã vượt qua ung thư phổi là bệnh phổ biến nhất được chẩn đoán ung thư, với ước tính khoảng 2,3 triệu ca mới trên toàn thế giới (11,7%) Ung thư vú là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng thứ năm sau ung thư phổi, đại trực tràng, gan, dạ dày với tỷ lệ 6,9% Tại Việt Nam, theo nghiên cứu gánh nặng bệnh ung thư và chiến lược phòng chống ung thư quốc gia đến năm 2020 cho thấy UTV là bệnh có tỷ lệ mới mắc cao nhất trong các ung thư ở nữ giới Tỷ lệ mới mắc chuẩn theo tuổi năm 2010 ước tính là 28,1/100.000 phụ nữ

Mặc dù tỷ lệ mắc UTV có xu hướng tăng trong những năm gần đây nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh vẫn từng bước được cải thiện nhờ các thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện bệnh sớm, chẩn đoán và điều trị Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền

giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người Công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người

Trong các biện pháp điều trị thì phẫu thuật và xạ trị hiện nay gây nhiều đau đớn và để lại nhiều phản ứng phụ cho người bệnh, hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ đối với các tế bào bình thường và dẫn tới hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư Chính vì vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã protein Azurin

trong Escherichia coli BL21 tiến tới sản xuất protein Azurin tái tổ hợp có hoạt

tính ức chế tế bào ung thư phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa

học và thực tiễn cao Xuất phát từ các lý do trên, đề tài: “Thiết kế vector biểu

hiện và biểu hiện gen mã hóa protein Azurin trong Escherichia coli BL21”

được thực hiện

2 Mục tiêu nghiên cứu

Biểu hiện gen mã hóa protein Azurin trong Escherichia coli BL21 nhằm

tiến tới sản xuất protein tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược

3 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa protein Azurin

- Biểu hiện gen protein Azurin trong E coli BL21

- Tinh sạch và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư vú của Azurin tái tổ hợp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về protein azurin

1.1.1 Sơ lược về protein azurin

Protein oxy hóa khử azurin của vi khuẩn (viết tắt là azurin, hoặc Az) azurin là một phân tử protein có trọng lượng phân tử thấp (14 kDa, 128 axit amin), màu xanh lam, chứa đồng Azurin ngoại chất cần thiết để bảo vệ vi khuẩn khỏi stress oxy hóa (chất cho điện tử thành nitrat reductase) và độc tính của đồng, hoạt động trong chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp ở một số vi khuẩn là một loại đồng chứa protein đơn miền với một cấu trúc β- barrel cứng nhắc Azurin là protein chứa đồng được gọi là protein cupredoxin Cupredoxin là các protein ở dạng hoà tan có chứa đồng, chúng tham gia vào vận chuyển điện tử của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn Những khả năng này là do azurin có thể tương tác với một số protein liên quan đến các bệnh lý này bằng ái lực cao Khả năng này cùng với cấu trúc, đặc tính hóa lý làm cho azurin như một protein giá đỡ tự nhiên mang đặc trưng bám dính giống kháng thể (immunoglobulin) Có thể được sử dụng cho các mục đích khác nhau như chống ký sinh trùng và tác nhân chống HIV, và là một trong những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu được sử dụng

trong điều trị các khối u Azurin chứa một điểm kỵ nước (Carvalho E et al 2011; Hajar M et al 2019; Karpiński M et al 2013; Keyhanian K et al., 2010; Mohamed M S et al., 2010)

Khả năng của azurin để tiêu diệt các tế bào khối u xuất hiện dựa vào sự ổn định của protein p53 ức chế sự phát triển của bệnh ung thư Chất ức chế khối u p53 bị phân hủy bởi hệ thống ubiquitin-proteasome p53 được polyubiquiti hóa với sự hiện diện của E1, UbcH5 như E2 và MDM2 oncoprotein Một phân tử ubiquitin liên kết MDM2 thông qua liên kết sulfhydroxy, đặc trưng của liên kết ubiquitin ligase (E3) - ubiquitin Dư lượng cysteine trong ga cuối carboxyl của MDM2 là cần thiết cho hoạt động Những dữ liệu này cho thấy rằng protein MDM2, được tạo ra bởi p53, có chức năng như một ligase ubiquitin Trong hạt nhân azurin tăng cường mức độ nội bào của p53 và Bax, những gì gây nên sự

giải phóng của ti thể cytochrome c vào cytosol Quá trình này kích hoạt thác caspase (bao gồm caspase-7 và caspase-9) khởi xướng quá trình chết theo chương trình Amino acid từ 50 đến 77 (P28) hoạt động như một miền tải nạp protein (PTD), bao gồm 28 axit amin, có trọng lượng phân tử 2,8 kDa P28 có khả năng xâm nhập ưu tiên vào các tế bào ung thư và ngăn chặn sự tăng sinh của

chúng trong ống nghiệm và in vivo P28 và các peptide tương tự làm giảm sự

suy thoái của p53 có thể cung cấp một loạt của các tác nhân hóa học trị liệu cytostatic và độc tế bào PTD azurin đã được tinh chế từ axit amin 50 đến 67, các peptide kỵ nước P18 trong các axit amin 68 đến 77, hydrophilic peptide P10, là những thành phần chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng sinh của p28 (Rita

B A et al., 2011; Carvalho E et al., 2011)

Azurin có tác dụng chống ký sinh trùng và kháng virus chống lại bệnh sốt

rét Plasmodium falciparum và virus HIV-1 Nó liên kết với ICAMs, hoạt động như các thụ thể cho các mầm bệnh khác nhau bao gồm Plasmodium falciparum,

HIV-1 và cũng liên kết với một số protein bề mặt của ký sinh trùng hay virus, nó

can thiệp vào việc xâm nhập của các tác nhân gây nhiễm vào các tế bào chủ Trong một nghiên cứu khác thì azurin đã được chứng minh là cho phép thoái triển các khối u UISO-Mel-2 ở người được cấy ghép trên chuột và có thể được sử dụng trong điều trị ung thư (Yaseen Nahi Yousif &Edan Dawood Salim,

2014; Chaudhari A et al., 2007)

1.1.2 Cấu trúc của gen azurin

Azurin là thành viên của họ cupredoxin chứng minh tính năng cấu trúc tương tự đến các miền biến immunoglobulin (Arsenio M.F et al., 2007) Các cupredoxin có một cấu trúc sandwich bất biến, cấu trúc thông thường được hình thành bởi hai mặt phẳng β hình thành bởi bảy hoặc tám sợi song song và phản song song, một vùng R - helix biến đổi nằm bên ngoài thân, và một vị trí liên kết đồng hạt nhân bảo tồn (Carvalho E., 2011)

Sự tương đồng của azurin với domain protein miễn dịch glubolin chứng minh kháng thể giống cấu trúc đơn của nó Cấu trúc giống như kháng thể này

bao gồm 8 sợi phản song song được ổn định thông qua cầu disunfua hình thành một cấu trúc nhỏ gọn và cứng nhắc với lõi β-sandwich Mặc dù azurin và glubolin miễn dịch đều có bản chất trình tự thấp Cấu trúc thứ cấp của nó có thể được liên kết bằng sự chồng chất các cấu trúc, điều này chứng tỏ chúng có cùng một tổ tiên Trong phần giữa có vị trí P28, các P28 là một PTD xoắn α dài mang tính đặc hiệu cho lối vào của azurin trong tế bào ung thư Azurin có 4 vòng lặp được cho là liên quan đến việc rằng buộc với các protein khác Những vòng lặp tiếp xúc này tương tự như trong tự nhiên ở các kháng thể, thực thi việc sở hữu protein của nó (Carvalho E., 2011)

Hình 1 1 Cấu trúc của protein azurin

Cấu trúc azurin được biểu diễn dưới dạng sơ đồ cấu trúc liên kết với các sợi β được đánh số tuần tự, được mô tả là sợi kết nối disulfua 1 và vòng lặp giữa sợi 2b và 3 và các phối tử đồng; Cys112, His117 và Met121 trong vòng kết nối sợi 7 đến 8 và His46 và Gly45 trong vòng kết nối sợi 3 đến 4 Góc tyrosine, trong vòng nối các sợi 7 và 8 và một chuỗi α ngoại vi cũng được mô tả Các đường đứt nét biểu thị kiểu liên kết

1.1.3 Khả năng chống ung thư

Azurin như một nhân tố đa mục tiêu chống ung thư có tác dụng thông qua ba con đường: ức chế sự phát triển của chu kỳ tế bào qua ràng buộc để Eph tyrosine kinase ngoại bào khởi phát cảm ứng apoptosis thông qua ổn định trong tế bào của p53 và ngăn ngừa sự hình thành mạch Từ những con đường độc lập thì sẽ dẫn đến sự ức chế tế bào ung thư (Carvalho E., 2011) Cho đến nay, một số cơ chế khác nhau đã được đề xuất để giải thích cho hoạt động chống ung thư của azurin: (i) azurin gây ra quá trình tự chết hoặc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách tạo phức với protein ức chế khối u p53; (ii) azurin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách can thiệp vào quá trình truyền tín hiệu qua trung gian thụ thể tyrosine kinase EphB2; (iii) hơn nữa, azurin ức chế sự phát triển của khối u bằng cách ngăn chặn sự hình thành mạch thông qua việc giảm hoạt động tyrosine kinase của VEGFR ‐ 2; (vi) bên cạnh đó, azurin can thiệp vào biểu hiện protein P-cadherin và ức chế sự phát triển của tế bào ung

thư vú (Gao M et al., 2017)

Hình 1.2 Cơ chế azurin gây ra quá trình apoptosis và ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư ở người

Azurin xâm nhập vào tế bào ung thư và tạo phức với p53, ức chế sự phân hủy p53 qua trung gian ubiquitin và làm tăng mức độ của nó P53 đã ổn định sẽ di chuyển trở lại nhân và phiên mã tạo ra các gen proapoptotic như Bax và Noxa hoặc các chất ức chế chu kỳ tế bào như p21 và p27 Azurin cũng liên kết với các thụ thể trên bề mặt tế bào, bao gồm VEGFR-2, Integrarin β-1 , P-cadherin và EphB2, can thiệp vào con đường dẫn truyền tín hiệu hội tụ thành NRTK của

chúng (Gao M et al., 2017)

1.1.3.1 Ức chế sự tiến triển chu kỳ tế bào

Ephrins là một gia đình của các thụ thể tyrosine kinase liên kết với ligand ephrin tạo ra các tín hiệu tại các điểm tiếp xúc của tế bào-tế bào kiểm soát hình thái tế bào, độ bám dính, di chuyển và xâm nhập Trong nhiều khối u Eph và Ephrin được biểu hiện quá mức thúc đẩy sự tăng trưởng khối u và anginogeneis Ephrin có thể được chia làm 2 loại: loại A, chúng được gọi là loại tế bào màng liên kết; loại B, có lĩnh vực bảo tồn nội bào cao và tiềm tàng

Azurin có cấu trúc tương tự với ephrinB2, EphB2 ligand, và liên kết mạnh mẽ để EphB2, can thiệp với hệ thống tín hiệu ephrin/Eph Can thiệp này góp phần vào sự cảm ứng của tế bào ung thư chết và suy thoái khối u (Carvalho E., 2011)

1.1.3.2 Cảm ứng apotosis

Yamada và cộng sự đã chứng minh rằng azurin và cụ thể hơn là P28 có thể thâm nhập dễ dàng vào các tế bào ung thư và gây ra apoptosis trong chuột J774 Ung thư vú ở người, u ác tính, và u xương ác tính nhưng không có trong tế bào gan hoặc có trong tế bào u xương ác tính âm p53 Sau khi xâm nhập, azurin tương tác mạnh mẽ với p53 tạo nên một phức hệ ổn định của 4 azurin rằng buộc cho một monomer p53 (Carvalho E., 2011) Tương tác giữa azurin và p53 chủ yếu là kỵ nước và nhiều giả thiết cho rằng cho rằng azurin liên kết với vùng

C-terminal của p53 và tương tác được thực hiện bởi axit nucleic (Edi G et al.,

2011) Khu phức hệ này sẽ ổn định sẽ khiến cho p53 giảm khả năng sinh enzyme giống như ubiquitin ligases Chúng sẽ phân huỷ bằng cách kích hoạt

p53 tự chết trong thời gian sớm nhất làm cho các tế bào này không có khả năng di căn dẫn đến làm tăng mức độ nội bào của nó Quy định về việc biểu hiện p53 chủ yếu thực hiện thông qua con đường trung gian ubiquitin proteosomal Bởi vì một số ubiquitin ligase sẽ được biểu hiện quá mức trong một số bệnh ung thư, như ung thư vú và ung thư buồng trứng Mức p53 thấp và cảm ứng apoptosis của nó sẽ làm giảm hoạt động (Carvalho E., 2011)

Nghiên cứu khác đã chỉ ra việc sử dụng một protein oxy hóa khử của vi khuẩn đã được tinh chế, azurin xâm nhập vào các tế bào ung thư ở người (u ác tính UISO-Mel-2) và gây ra quá trình chết rụng Quá trình cảm ứng apoptosis xảy ra dễ dàng ở các tế bào u ác tính có chứa protein ức chế khối u chức năng p53, nhưng kém hiệu quả hơn nhiều ở các tế bào u ác tính đột biến p53-null (UISO-Mel-6), ít gây độc tế bào hơn cho các tế bào UISO-Mel-2 so với protein kiểu hoang dã Azurin đã được chứng minh là liên kết với nhau trong các tế bào UISO-Mel-2 và khu trú chủ yếu trong tế bào và trong phần nhân Trong các tế bào UISO-Mel-6 p53-null, azurin chỉ được phân hóa trong bào tương Do đó, sự vận chuyển nội bào của azurin đến hạt nhân phụ thuộc vào p53 Azurin tạo thành một phức hợp với p53, do đó ổn định nó và nâng cao mức độ nội bào của nó trong các phân đoạn tế bào, ti thể và nhân Tương ứng với mức tăng của p53, một chất cảm ứng của quá trình apoptosis, mức độ Bax cũng tăng lên trong ty thể, cho phép giải phóng đáng kể cytochrome c của ty thể vào tế bào, do đó bắt đầu sự khởi đầu của quá trình apoptosis Dạng đột biến M44K MM64E của azurin, có khả năng gây độc tế bào, cũng thiếu khả năng hình thành phức hợp với p53 và kém hiệu quả trong việc ổn định p53 hơn azurin dạng hoang dã Azurin đã được chứng minh là cho phép thoái triển các khối u UISO-Mel-2 ở người được cấy ghép trên chuột và có thể được sử dụng trong điều trị ung thư

(Yamada T et al., 2002)

1.1.3.3 Ức chế hình thành mạch

Gần đây Mehta và cộng sự đã cho thấy rằng, P28 ưu tiên nhập vào các tế bào nội mô, ức chế hình thành mạch và khối u tăng trưởng VEGFA là một yếu

tố hình thành mạch kích hoạt ECM (mạng lưới ngoại bào), protein làm cho các tế bào nội mô hoạt động để cấu tạo nên hệ thống mạch dạng ống Hiệu quả VEGFA tạo mạch là một chất trung gian bởi những thụ thể của nó, VEGFR-2 Điều này bắt buộc kích hoạt một số loại protein như FAK (tiêu cự đính Kinase) có liên quan đến quá trình tế bào nhu động P28 định khu Với caveolin-1 và VEGFR-2 và ức chế VEGFR-2 hoạt động (Carvalho E., 2011)

P28 mang những đặc tính chống hình thành mạch bằng cách can thiệp theo những hướng khác nhau VEGFR-2 và VEGFA với những protein mục tiêu và các con đường giống F-actin, một sự căng thẳng liên quan đến khả năng vận động, khả năng di cư của các tế bào, FAK một phi thụ quan protein tyzocin kinase kết hợp với các siêu phân tử bám dính là rất quan trọng trong việc di động cũng như vận động trong tế bào và PCAM-1 (tiểu cầu/ màng tế bào kết dính phân tử-1) chịu trách nhiệm trong việc liên hệ với các tế bào nội mô Những quan sát khác nhau cho thấy rằng P28 gây giảm khả năng vận động tế bào thông qua việc tăng độ cứng của tế bào và cuối cùng là sự di chuyển, không hình thành các ống mao mạch do ức chế sự hình thành mạch (Carvalho E., 2011)

1.1.3.4 Azurin như một protein “giá đỡ”

Azurin hoạt động như một protein của “giá đỡ” vì nó làm trung gian tương tác ái lực cao khác nhau với một số protein Phân tích tương tác protein khác nhau cho thấy azurin có khả năng hình thành các phức hợp ổn định với các protein khác nhau được biết trước đây: p53, EphB2, ICAM-3, DC-SIGN, gp120, MSP-1 và SAG1 (Carvalho E., 2011)

Azurin có nguồn gốc peptide của khu vực 88-113 tham gia vào sự tương tác của azurin với EphB2 và với DC-SIGN Peptide này bao gồm F-G Loop, đó là vùng chịu trách nhiệm cho sự hình thành phức tạp với EphB2 Khu vực tương tác azurin với p53 đã được xác định là vùng kỵ nước của nó, trong đó bao gồm các axit amino Met-44 và Met-64 De Grandis và cộng sự cho rằng vùng kị nước trong cấu trúc azurin được kết dính với miền DNA của p53 liên quan tới các vòng lặp L1 và s7-s8 Các khu vực khác nhau trong azurin liên quan đến sự ràng buộc

mạnh mẽ giữa EphB2 và p53 cho thấy rằng các vùng khác nhau chuyên tương tác với các protein khác nhau tức là mang tính đặc hiệu (Carvalho E., 2011)

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin

Việc sử dụng một số peptit tổng hợp được thiết kế để tối ưu hóa các đặc tính kháng sinh và chống khối u cũng như cải thiện khả năng điều trị, chúng có ưu điểm độc đáo của peptit, chẳng hạn như trọng lượng phân tử thấp, khả năng nhắm mục tiêu cụ thể vào tế bào khối u và độc tính thấp trong các mô bình thường Tuy nhiên, các peptit trị liệu có một số nhược điểm đáng kể liên quan

đến tính ổn định và thời gian bán hủy ngắn của chúng (Leuschner et al 2004; Susan M et al 2017; Xiao Y F et al 2014)

Azurin, một protein oxy hóa khử chống ung thư mạnh được tiết ra bởi các

loài P aeruginosa đã được báo cáo là có hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung

thư vú Azurin là một protein trọng lượng phân tử thấp, là một trong những sản phẩm vi khuẩn có tiềm năng được sử dụng trong điều trị khối u, điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp mới để tăng cường sản xuất

protein này Trong một nghiên cứu năm 2010, P aeruginosa đã được phân lập

từ phổi của bệnh nhân xơ nang ở Ai Cập và được xác định bằng trình tự gen

16S-rRNA Gen azurin được khuếch đại bằng chương trình PCR thích hợp Gen

được nhân bản thành vectơ dễ dàng pGEM-T và được giải trình tự Sau đó được nhân dòng vào vectơ biểu hiện quá mức pET-28a (+) bằng cách sử dụng vi

khuẩn E coli BL21 làm vi khuẩn biểu hiện Protein tái tổ hợp được tinh chế

bằng cách tinh chế một bước sử dụng nhựa Ni++ Kết quả cho thấy azurin ức chế mạnh sự tăng sinh của cả dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết và dòng tế bào ung thư vú Đồng thời, azurin không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào đến tế bào

hắc tố bình thường của con người (Mohamed M S et al 2010; Ramachandran S et al 2011)

Một nghiên cứu khác, tại Bệnh viện Đại học Mansoura đã phân lập 95

chủng P aeruginosa từ bệnh nhân nội trú và bệnh nhân ngoại trú đã tham dự các

phòng khám tại Bệnh viện Đại học Mansoura Kết quả nghiên cứu cho thấy

azurin từ các phân lập địa phương khác nhau của P aeruginosa đã phát huy tác

dụng gây độc tế bào có thể nhìn thấy trên dòng tế bào MCF-7 của ung thư vú (Yehia A O et al 2013) Năm 2011, thì một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các

protein azurin từ các loài Pseudomonas khác nhau được phân tích để phân tích

cấu trúc sinh lý sơ cấp, thứ cấp và mối quan hệ phát sinh loài của chúng Nghiên cứu này chỉ ra rằng thành phần amino axid, trọng lượng phân tử khác nhau giữa protein azurin Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng protein azurin của các loài

Pseudomonas khác nhau có tổ tiên chung, có quan hệ họ hàng chặt chẽ với nhau

và các trình tự được bảo tồn cao (Kamalakannan T et al 2011)

Trong một nghiên cứu khác cũng vào năm 2011, một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các phương pháp tùy chỉnh để tập trung vào việc tổng hợp azurin từ

các chủng P aeruginosa khác nhau với sự đồng nhất rõ ràng Họ đã sàng lọc sự phát triển của các chủng P aeruginosa khác nhau (1934, 741, 2453 và 1942) để

tổng hợp azurin và tăng cường sản xuất azurin Và cho thấy các đặc tính của azurin bằng cách sử dụng giải hấp thụ / ion hóa laser được hỗ trợ bởi ma trận, natri dodecyl sulfat điện di trên gel polyacrylamide và quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Kết quả cho thấy 2453 là chủng tiết ra nhiều azurin nhất và cho thấy sự chết rụng đáng kể ở các tế bào ung thư biểu mô vú như T-47D và ZR-75-1 Nghiên cứu này chứng minh các phương pháp tùy chỉnh để tổng hợp

azurin từ các chủng P aeruginosa khác nhau với tính đồng nhất rõ ràng và tác

động tự chết của chúng trên các tế bào ung thư biểu mô vú với các cơ chế phân

tử có thể có và các loại oxy phản ứng (Ramachandran S et al 2011)

Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Ý, đã báo cáo về hoạt động chống khối u của p28 (một đoạn peptid của azurin) phát sinh từ sự ổn định sau dịch mã của chất ức chế khối u p53 thường được điều chỉnh giảm bởi sự liên kết của một số ligase ubiquitin Điều này đòi hỏi p28 phải liên kết đặc biệt với p53 để ức chế các ligase cụ thể bắt đầu phân hủy qua trung gian proteosome Trong nghiên cứu này, quang phổ lực nguyên tử, một phương pháp tiếp cận công nghệ nano, được sử dụng để khảo sát tương tác của p28 với p53 có chiều dài đầy

đủ và các miền cô lập của nó ở cấp độ phân tử đơn lẻ Phân tích các lực không liên kết và hằng số tốc độ phân ly cho thấy rằng p28 tạo thành một phức bền vững với vùng liên kết DNA của p53, ức chế sự liên kết của các ligase ubiquitin khác

với Mdm2 để giảm sự phân hủy protein của p53 (Rita B A et al 2011)

Nghiên cứu khác tại Bồ Đào Nha đã báo cáo rằng, azurin nhắm mục tiêu P-cadherin biểu hiện quá mức của bệnh ung thư vú, chống lại tác dụng xâm lấn của nó P-cadherin biểu hiện quá mức xảy ra ở khoảng 30% của ung thư biểu mô tuyến vú đại diện cho một trong những loại ung thư vú nguy hiểm nhất (Arsenio

M S et al 2016)

Năm 2015, tại Đại học Calicut Ấn Độ đã thực hiện phân lập gen azurin sản xuất các chủng P aeruginosa bản địa và xác nhận sự hiện diện của nó bằng

kỹ thuật phân tử Trong số 10 mẫu được chọn cho nghiên cứu này, 8 mẫu cho

thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ

thể trong PCR gradient, khuếch đại một đoạn DNA 545 bp đơn đặc trưng của

gen azurin Tổng số protein tế bào chiết xuất được phân tích bằng điện di trên

gel SDS-Polyacrylamide, có nhiều dải băng bao gồm một dải tương ứng với trọng lượng phân tử 14 KD trong tất cả 8 mẫu được chọn từ PCR (Sereena M C

et al 2015) Gần đây nhất vào năm 2018, Sarwar và Fahim tại Đại học BRAC

đã tiến hành với 25 chủng phân lập trong môi trường (đất) mục đích là phân lập

azurin sản xuất Pseudomonas spp bản địa cùng với việc xác nhận sự hiện diện

của azurin bằng kỹ thuật phân tử Họ sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể (AZU-F và AZU-R) trong PCR gradient Kết quả là trong số 25 chủng phân lập,

10 chủng cho thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách khuếch đại một đoạn

DNA 545 bp duy nhất trong PCR Việc phát hiện ra các chủng vi sinh vật sản xuất azurin có năng suất cao có thể dẫn chúng ta đến việc phát triển các loại thuốc chống ung thư (Sarwar &Fahim, 2018)

1.3 Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam

Nghiên cứu đầu tiên là của nhóm nghiên cứu vật lý lý thuyết, Đại học Tôn Đức Thắng thành phố Hồ Chí Minh đã đưa ra giả thuyết rằng vi khuẩn gây

bệnh và vi khuẩn đồng loại cư trú lâu dài trong cơ thể người có thể tạo ra protein giống azurin như một vũ khí chống lại sự xâm nhập của bệnh ung thư Trong nghiên cứu trước đây của họ, các vi khuẩn giả định đã được sàng lọc từ các bộ gen hoàn chỉnh của 66 loài vi khuẩn ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người và sau đó được đặc trưng bằng cách coi chúng như các thuật toán chú thích chức năng với azurin làm đối chứng Họ đã dự đoán định tính 14 loại vi khuẩn giả định sở hữu các đặc tính chức năng rất giống với azurin Trong công việc này, họ thực hiện một số phân tích định lượng và dựa trên cấu trúc bao gồm tính toán tỷ lệ phần trăm kỵ nước, mô hình cấu trúc, và nghiên cứu gắn kết phân tử về vi khuẩn quan tâm chống lại protein p53, một mục tiêu ung thư Cuối cùng, họ đã xác định được 8 vi khuẩn giả định liên kết p53 theo cách tương tự như p28-azurin và azurin, trong đó 3 peptit (p1seq16, p2seq20 và p3seq24) được chỉ ra từ nghiên cứu trước đây của họ và 5 peptit mới (p1seq09, p2seq05, p2seq08, p3seq02 và p3seq17) được phát hiện lần đầu tiên (Nguyen C &Nguyen V D, 2016) Sau đó vào tháng 12 năm 2019, tác giả Nguyễn Duy cùng một nhóm nhà khoa học khác đã thực hiện một nghiên cứu khác với mục đích cải thiện quy trình sàng lọc và đánh giá tính đa dạng di

truyền của gen azurin ở P aeruginosa và gen giống azurin trong hệ vi sinh vật

đường ruột của một quần thể cụ thể ở Việt Nam và quần thể toàn cầu Kết quả là, nghiên cứu này đã tối ưu hóa thành công nhiệt độ ủ để khuếch đại DNA nhằm

sàng lọc các gen azurin và áp dụng cho các gen giống azurin từ hệ vi sinh vật đường ruột của con người; là nghiên cứu đầu tiên phân loại gen azurin thành 5

kiểu gen khác nhau ở quy mô toàn cầu và xác nhận hoạt động chống ung thư tiềm năng của 3 protein tổng hợp giống azurin (Cnazu1, Dlazu11 và Ruazu12) Các kết quả đóng góp cho sự phát triển thủ tục được áp dụng để sàng lọc các protein chống ung thư từ microbiome của con người và sự hiểu biết toàn diện về đáp ứng

trị liệu của chúng ở cấp độ di truyền (Nguyen V D et al 2019)

Các nghiên cứu tại Việt Nam chỉ dừng lại ở việc phân lập sàng lọc và phân loại Ngoài ra, đến thời điểm hiện nay chưa có công bố nào về nhân dòng và biểu

hiện gen azurin và sử dụng azurin như một phương pháp điều trị ung thư

1.4 Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Azurin

Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về nhân dòng và biểu hiện

gen mã hóa Azurin từ P aeruginosa và một số vi khuẩn khác Năm 1987,

Arvidsson và cộng sự đã nhân bản và giải trình tự gen cấu trúc Pseudomonas aeruginosa azurin và các vùng bên sườn của nó Trình tự DNA dự đoán một tiền protein với một peptit tín hiệu của 19 axit amin, tiếp theo là protein azurin trưởng thành 128 axit amin Năm 1990, Karlsson và cộng sự đã phân lập và biểu

hiện gen mã hóa Azurin từ P aeruginosa Năng suất biểu hiện cao nhất thu

được khi gen có vị trí liên kết ribosome của nó được đặt ở phía dưới của promoter lac trong plasmid pUC18 Protein được xuất sang vùng quanh chất ở

Escherichia coli và số lượng tương ứng với 27% tổng hàm lượng protein trong

vùng quanh chất

Năm 2018, Aslam và cộng sự đã khuếch đại đoạn gen 447 bp của Azurin

từ Pseudomonas aeruginosa và được nhân bản trong vectơ nhân bản pTG19-T

Trình tự DNA mã hóa một loại tiền protein có tín hiệu peptit của 19 axit amin tiếp theo là protein azurin trưởng thành 128-aminoacid Gen azurin được nhân

bản trong pET22b vectơ Vectơ RpET22b (+)-azu tái tổ hợp được nhân bản

trong các tế bào BL21-Codon Plus (DE3) Tối ưu hóa, biểu hiện cao của gen azurin thu được IPTG nồng độ 0,5 mM sau 6 giờ ở 37°C Sắp xếp theo trình tự cho thấy 99,8% trình tự tương đồng với trình tự azurin được báo cáo Một đột biến CCA thành CCG được phát hiện ở amin thứ 17 axit Tuy nhiên, axit amin thu được (proline) vẫn giữ nguyên

Năm 2020, Sereena và cộng sự đã khuếch đại gen azurin (azu) từ chủng Pseudomonas aeruginosa SSj bằng cách sử dụng PCR với các đoạn mồi cụ thể Gen azurin (418 bp) đã được giải trình tự và gửi trong Ngân hàng gen Sản phẩm PCR được xử lý với Bam HI và HindIII và được chèn vào vectơ biểu hiện pET-22b(+) Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở Escherichia coli

BL21 (DE3) sau khi cảm ứng với IPTG Tinh chế protein được thực hiện bằng cách sử dụng Ni NTA agarose Phân tích SDS-PAGE của các mẫu tinh khiết với

thuốc nhuộm Coomassie cho thấy một dải có trọng lượng phân tử biểu kiến khoảng 14 kDa Đặc điểm cấu trúc của protein tinh khiết được thực hiện bằng phân tích FTIR, MALDI-TOF và LC – MS/MS

Như vậy, trên thế giới đã có những nghiên cứu về nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Azurin Ở Việt Nam năm 2018, Nguyễn Văn Duy và cộng sự đã tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc phân tử các bacteriocin có tiềm năng kháng

ung thư từ khu hệ vi sinh vật người bằng cách tiếp cận tin sinh học và sinh học phân tử” Đề tài góp phần chứng minh thành công giả thuyết khoa học đã đặt ra:

Các vi khuẩn trong khu hệ vi sinh vật người, nhất là các vi khuẩn gây bệnh và hội sinh, cư trú lâu dài trong cơ thể người có thể sản sinh các bacteriocin tương tự Azurin như một vũ khí bảo vệ chúng trong môi trường sống chống lại các tế bào ung thư Giả thuyết này góp phần phát triển hướng nghiên cứu về tương tác giữa vi sinh vật với vật chủ, trong đó thậm chí các vi sinh vật gây bệnh không phải lúc nào cũng ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe vật chủ mà trong một số điều kiện nhất định còn có thể sản sinh những chất như bacteriocin để bảo vệ sức khỏe vật chủ Đây là nghiên cứu đầu tiên sàng lọc các bacteriocin kháng ung thư từ hệ vi sinh đường ruột người bằng cách tiếp cận phối hợp sử dụng công cụ tin sinh học và các kỹ thuật phân tử độc lập và phụ thuộc nuôi cấy và cũng là nghiên cứu đầu tiên sàng lọc các bacteriocin kháng ung thư ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid

 Chủng Escherichia coli DH5α được dùng để nhân dòng và Escherichia

coli BL21(DE3) dùng để biểu hiện do hãng Invitrogen cung cấp

 Vector pET22b(+) do hãng Invitrogen cung cấp

 Vector tái tổ hợp pTZ57R/T_azu mang gen mã hóa protein Azurin phân lập từ chủng P aeruginosa VTCC-B-657 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 được cung cấp từ phòng công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học được sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt tính sinh học của Azurin

2.1.2 Thiết bị dụng cụ và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.1 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

1 Cân kĩ thuật Satorius - Đức; Shimadzu - Philipin 2 Box cấy vô trùng Nuaire - Mĩ

4 Nồi khử trùng ướt Hyrayama – Nhật

8 Máy đo quang phổ Thermo Electron - Đức