Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong e coli sử dụng vectorpET 32a(+)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC _ *** _ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Đề tài;“ Thiết kế vecrtor biểu biểu gen xylan-beta-xylanase E coli sử dụng vectorpET 32a(+)” Giáo viên hướng dẫn:TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Hưig Lóp: CNSH- 11-02 Hà Nội, 2015 Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội LỜI CẢM ON Trước hết, tơi xin bày tó lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Thị Huyền, Phịng Kĩ Thuật di truyền - Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình hướng dan, dìu dắt tơi suốt q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cám ơn tháy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Viện Đại học Mớ Hà Nội giáng dạy, giúp đỡ suất q trình học tập thực luận văn Tơi xin gừi lời cám ơn tới toàn thê anh, chị làm việc học tập Phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ chi bào tơi tận tình suốt thời gian thực luận văn Cuối xin gửi tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp lịng biết ơn sâu sắc quan tâm, động viên yồ SỵP\ý troi\g suọt qứá trình học tập hồn thành luận ván Sinh viên thực Hoàng Thị Hưong Hồng Thị Hương Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội MỤC LỤC MỤC LỤC NHỬNG TỪ VIẾT TÁT DANH MỤC HÌNH VÈ MỚ ĐÀU PHÁN I TỎNG QUAN TÀI LIỆU I Đại cương xylanase I 1.1.1 Phân loại xy lanase 1.1.2 Cấu (rúc xylanase , ,_ Thu yien Yien Đại học Mớ Hà Nội 1.1.3 Cơ chê xúc tác xylanase 1.1.4 Đặc tính xylanase 1.1.5 Nguồn xylanase 1.1.6 ứng dụng xylanase 10 1.2 Biếu gen 13 1.2.1 Hệ biểu E coli 13 1.2.2 Chủng biểu E coli BL21 15 1.2.3 Vector biểu pET 32a(+) 16 PHÀN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 18 2.1 Vật liệu 18 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 2.1.1 Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid 18 2.1.2 Hóa chất enzyme 18 2.1.3 Máy móc thiết bị 18 2.1.4 Các môi trường dung dịch 18 2.2 Phươngphápnghiêncứu .19 2.2.1 Khuếch đại in vitro DNA bàng phán ứng trùng hợp polymerase (PCR) 19 2.2.2 Phàn ứng gen ngoại lai vào plasmid 19 2.2.3 Phương pháp xừ lý DNA plasmid enzyme cắt hạn chế 19 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 19 2.2.5 Tinh chế DNA QIAGEN thực theo hướng dẫn nhà sản xuât TlYu"việnViện"Đạí"hực"M'ờ'Hầ"NỘỈ 20 2.2.6 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bắng phương pháp sốc nhiệt 20 2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 20 2.2.8 Phương pháp điện di gel polyacrymide - SDS 20 2.2.9 Cảm ứng, biểu protein ngoại lai 21 PHẦN III KÉT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THAO LUẬN 22 3.1 Thiết ke vector bieu pET32a(+) mang gen xbx 23 3.1.1 Khuếch đại gen xbx kĩ thuật PCR 23 3.1.2 Cắt sán phẩm PCR gen xbxvằ pET32a(+)bằng Ncoỉ+Xhoỉ 24 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu pET 32a(+) 25 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội 3.1.4 3.2 Khoa Công nghệ sinh học Cắt kiểm tra pET.32-.rfer bàng Xhoĩ+Xbaỉ 27 Biếu gcn xbx E coli BL21 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 37 Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Hồng Thị Hưong Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội NHỮNG từ viét tẳt Amp Ampicicillin Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coll EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl P-D-1 -thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Thư KÌậrDlítbận Đại học Mớ Hà Nội LB Luria - Bertani medium M Mol/L PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris acetate EDTA Tyr Tyrosinase XBX Xylan-beta-xylanase Hồng Thị Hương Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội DANH MỤCHÌNH VẼ Hình Cấu trúc hóa học xylan Hình Cấu trúc bậc xylanase GH10 từ s lividans Hình Cấu trúc bậc xylanase GH11 từ s paucimobilis Hình Cơ chế phán ứng thủy phân xylan xylanasecủa Bacillus circulans Hình Các enzyme cần thiết phân cắt hồn tồn xylan Hình Bân đồ vector pET32a(+) 17 Hình Sơ đồ thí nghiệm 23 Hình Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bang kĩ thuật PCR 24 Hình Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bàng kĩ thuật PCR gel agarose 0.8% 25 , Thự viên Viện Đại học Mợ Hà Noi, Hình 11 Kêt quâ điện di tách chiêt dòng màng vector pET32-xèx 26 Hình 12 Sơ đồ vị trí cắt enzyme giới hạn Xhoỉ Xbaỉ 27 Hình 13 Ành điện di sản phẩm cắt pET32-xbx dòng bang enzyme giới hạn Xhoỉ Xbaỉ gel agarose 0,8% 28 Hình 14 Kết quà điện di kiếm tra protein tống số biếu dòng tế bào mang pET32-xfec 29 Hình 15 Điện di dịch tế bào sau siêu ầm đế kiếm tra biểu pha tan cùa protein xbx dòng tế bào DE3-pET32a-xftx khác 30 Hoàng Thị Hương Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội MỎ DÀU Xylanase enzyme nhiều nhà khoa học quan tâm Enzyme có khả thúy phân hiệu xylan - thành phần chu yếu cùa hemicellulose thành tế bào thực vật Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chu yếu tiến hành đối tượng nấm sợi Tuy nhiên, gần với phát mẽ khoa học công nghệ, ngày nhiều chúng vi sinh vật có khả sinh xylanase phát nghiên cứu sâu Đong thời, lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase ứng dụng loại enzyme vi khuẩn nhà khoa học ngày quan tâm Do nhu cầu sứ dụng xylanase nhiều lĩnh vực ngày tăng, đặc biệt nhu cầu enzyme có hoạt tính mạnh, phân cát nhanh đẻ đưa vào ứng dụng công nghiệp thiếu Với mục đích tìm loại xylanase có đặc tính tốt hơn, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu biếu biếu gen xbxs mã hóa viện?VienJpai hod. xylan-beta-xylanase E coll su dụng vector pE r-32a(+) nhăm thu xylanase tái tố hợp có tính tốt đẻ ứng dụng thực tiễn Đe tài dược thực Phòng Kĩ thuật di truyền Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam MỤC TIÊU - Thiết kế thành công vector pET 32a(+) mang gen xbxs - Biểu thành cơng xylanase trongE.co/í' BL21 Hồng Thị Hương Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội PHÀN I TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xylanase Xylanse có tên gọi khác là:p-xylanase; endo-l,4-p-xylanase; cndo-l,4-P-D- xylanase;P-D-xylanase;endo-p-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; 1,4-P-xylan xylanohydrolase; P-l,4-xylan xylannohydrolase Tên hệ thống: 4- p-D-xylan xylannohydrolase Xylanase enzyme quan trọng tham gia thũy phân xylan[8 20] Xylanase thúy phân xylan cách cắt dứt liên kết p-1,4-glycoside a-rOMoOcLA Hình Cấu trúc hóa học xylan Xylan thành phan cấu tạo nên hemicellulose cùa thành tế bào thực vật số hợp chất polysaccharide quan trọng tự nhiên [24, 31].Xylanchủ yếu tìm thấy cấu trúc thứ cấp thành tế bào thực vật tạo thành pha lignin hợp chat polysaccharide khác[41].Xylan polysaccharide biến lồi thực vật thơng thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô sinh khối thực vật nhiệt đới Với gồ mềm vùng ôn dới, xylan phổ biến chiếm khoáng 8% tống trọng lượng khơi 14], Hồng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Sự phân hủy sinh học khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chù yếu vào hai lớp enzyme: endo-l,4-P-xylanase(EC 2.1.8) lớp enzyme thủy phân liên kết 1,4-P-glucoside nối với xylose p-xylosidase (1,4-p-D-xylan xylaohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme thủy phân xylobise xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động enzyme endo-xylanasc Các enzyme loại mạch nhánh hạn a- glucoronidase a-L-arabinifuranosidase esterase chẳng hạn acetylxylan esterase ferulyl p-coumaroyl esterase loại bó mạch nhánh acetyl mạch nhánh phenol [14] Ớ gỗ rắn xylan có cơng thức O-acetyl-4-Omethylglucuron-oxylan Arabino-4-O-methylglucuroxylan tìm thấy gỗ mềm arabinoxylan rat điển hình cỏ thực vật bình thường khác [ 141 1.1.1 Phân loại xylanase Sự đa dạng cùa xylan dần đến đa dạng cùa enzyme xylanase[20] Dựa vào đặc điểm hóa lý, xylanase phân thành nhóm: nhóm có phân tứ lượng thấp (30 kDa) pl jnir Viện Viện Đại hỗcMợ riaTNoi , ; base.Mặc dù nhiêu xylanase phù hợp nhóm sô lượng xylanase mô tá trước gia tăng nhiều nhiều xylanase có dặc tính trung gian nhận biết khơng phù hựp với nhóm phân loại Từ 30 họ xác định vào năm 1991, phân loại cập nhật thường xuyên với enzyme phù hợp tạicó trơn 100 họ (GHI tới GH 106)113| Hau hết họ bao gồm enzyme với đặc tính chất giống nhau.Tuy nhiên, nhiều họ lại có nhiều đặc điềm khác nhau, enzyme hoạt động carbonhydrate khác Việc tìm kiểm cấu trúc liên quan họ khác dẫn đến kết việc giới thiệu mức độ thứ bậc phân loại dược biết đến siêu họ quần hợp nhỏ Dựa tương đồng amino acid cấu trúc không gian xylanase thường phân vào họ 10 (trước F) 11 (trước G)| 12| Hai họ bao gồm xylanase cùa nhóm phân tứ lượng cao, pl thấp phân tứ lượng thấp, pl cao đe cập trước đây; mồi họ bao gồm nhiều xylanase Hoàng Thị Hương Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHÁO Tiếng Việt Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mần (2007), Nghiên cứu hoạt độ enzym ngoại bào cùa số chúng Bacillus phân lập ứng dụng chúng xừ lý nước thãi, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 25 (2009), tr 101-106 Nguyền Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009) “Nhân dịng phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A.niger DSM1957",Z?ứơ cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc Nhà xuất bàn Đại học Thái Nguyên, tr 701 - 704 Trần Đinh Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đồ Trung Sỹ, Hồng Thị Bích, Nguyễn Thị Hà Giang (2008), Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ actinomycetes đế xứ lý phế thái nơng nghiêp, Hóa sinh sinh học phân tứ phục vụ nông, sinh, ỵ học công nghệ thực phàm Nhà xuất bàn Khoa học ,,, , Kỹ thuậU-Hà Nội,,tr 9Q1-9Q3 Thu viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Tiếng Anh Annie Deborah Harris and c Ramalingam Xylanases and its application in food industry: A Review 2010, (7): 01-11 Bajpai p Bhardwai NK Bajpai PK, Jauhari MB The impact of xylanascs on bleaching of eucalyptus kraft pulp, 1994, 38(1): 1-6 Beg QK, M Kapoor L Mahajan, G.S.Hoondal Microbial xylanascs and their industrial applications: a review Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 56 (3-4): 326 - 338 Begg M, Baydoun A, Parsons ME, Molleman A Signal transduction of cannabinoid CB1 receptors in a smooth muscle cell line, 2001, 531(1): 95104 Chantasingh D„ Pootanakit K., Champreda V., Kanokratana p., Eurwilaichitr L (2005)“Cloning, expression and characterization of a Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học xylanase 10 from Aspergillus tereus (BCC129)in Pichia pastoris”, Protein Experession and Purification, 46: 143 - 149 Christov I, Kaptcyn H, Murnanc M “Quasi-phase matching of highharmonics and attosecond pulses in modulated waveguides”, 2000 7(11): 362-367 10 Clarke, A J., Bray, M R and Strating, H.(1993) P-Glycanases and xylanases Their mechanism of action In: ACS Symposium Series No: 533: 27-41 American Chemical Society USA l.Cleemput, G., Hessing, M., van Oort, M., Deconynck, M and Delcour, J A (1997) Purification and characterization of p-D-xylosidase and an endo- xylanase from wheat flour Plant Physiol 113(2): 377-386 12 Collins T, Gcrday c, Feller G Xylanascs, xylanase families and extremophilic xylanases FEMS Microbiol Rev 2005 Jan 29(1):3-23 13 Coutinho PM, Hcnrissat B (1999b) J Mol Microbiol Biotechnol, 1:307-308 14 Degefu Yq^2^3)fèC/ quy định tính đặc hiệu Lặp lại 30 lần từ bước đến Bước 5: 72”c phút : tạo sợi DNA hoàn chinh Bước 6: 4°c 10 : bảo quàn Quy trình nối gen ngoại lai vào plasmid Hồng Thị Hương Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Thành phần Thế tích (p 1) H20 Buffer T4 DNA ligase 10X (Fermentas) Gen 3,5 Vector pET 32a(+) 1,5 T4 DNA ligase Tồng 10 ***'iậ®WflírtịNỊB Mơ Hà Nội Quy trình xử lý DNA plasmide bang enzyme cắt hạn che Một phàn ứng cắt cùa enzyme cắt hạn chế thường tiến hành tồng thể tích 10 pl gồm thành phần sau: - Nước khứ ion vô trùng : 5,5 pl - DNA plasmide - Đệm lOXcũaenzyme : pl - Enzyme căt hạn chê 5pl + Xhoỉ +A7wI Hoàng Thị Hương : : 0,25 pl 0.25 pl Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Hỗn hợp phàn ứng trộn đều, ú nhiệt độ 37°c 70phút Sán phẩm phân ứng cắt kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% Quy trình điện di DNA gel agarose * Chuẩn bị gel agarose: - Cân agarose hòa tan vào đệm TAE IX cho nồng độ 0,8% - Đun sôi tan hết, đề dịch agarose nguội đến khống 50°C đổ gel vào khn có cài sần lược - Chờ gel đơng ổn định hồn tồn vịng 30 phút - Rút lược khói khn, đặt gel vào bê diện di, dô đệm TAE IX vào tới ngập mặt gel * Tra mẫu DNA vào giếng: - Tùy thuộc vào mục đích diện di khác mà ta sư dụng nồng dộ DNA cao thấp - Tra mẫu sau đo đệm TAE IX vào khuôn điện di cho ngập gel Mầu trộn với loading dye 6X có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng cùa acid nucleic, kéo phân từ acid nucleic lăng xuống đáy giếng - Chạy điện di dòng điện 100V khoảng 30 phút từ cực âm sang cực dương - Trong trình chạy, cần quan sát dịch chuyển cúa vạch màu bromophenol đế biết lúc cần dừng điện di * Nhuộm DNA bàng EtBr: Sauk hi diện di xong ta lấy nhẹ bán gel khói khn ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 Ặtg/ml khoáng 15 phút lại bang nước Hoàng Thị Hương 42 Viện Đại học Mỏ' Hà Nội * Khoa Công nghệ sinh học Quan sát chụp ảnh: Bán gel sau nhuộm EtBr quan sát ánh sang từ ngoại 1=302 nm Ta dùng hệ thống phân tích lưu trữ hình ánh DNA đế chụp ánh gcl với ánh sang tứ ngoại Quy trình thơi gel tinh DNA từ gel agarose: - Cat gel cho vào tube eppendorf cân Cho vào tube lần tích buffer - ủ 50“C 5-7 phút, làm tan mix lên - Chuyến hỗn hợp gel sang cột QIA quick column đặt vào ống thu mẫu - Ly tâm 6000 vòng /30 giây, loại bỏ dịch ống - Thêm 500 pl wash buffer (PE chứa 70% ethanol), ly tâm ln 6000 vịng/30 giây đe loại bị dịch Ly tầm tiếp 6000 vòng/phút cho hết cồn - Chuền sang eppericiorf'mốiVàSiiơ sung 4Õ'ịil ¥Ỉ)õ, đởi 5-ỊÌhút Ly tâm 13000 vịng/phút thu DNA tinh Quy trình sốc nhiệt để biến nạp DNA plasmide vào tế bào E coli * Tạo tế bào biến: - Cấy chuyến khuấn lạc E.coli DH 10b vào ml môi trường LB lóng, lắc 200 vịng/phút - Chuyến 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục cấy lắc 200 vòng/phút 37°c OD«X> đạt 0,4- 0,6 Sau đó, lấy mẫu đặt lên đá khoảng Ih Từ bước này, tất thao tác tiến hành 4°c - Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút Hòa te bào thu 50 ml CaCL 100 mM (vô trùng), ú mẫu 15 phút ly tâm thu tế bào 3500 vịng/phút 10 phút Hồng Thị Hưong 43 Khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mỏ' Hà Nội - Hòa tủa 25 ml CaCL 100 mM , ủ mẫu 60 phút đá - Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút 4°c - Hòa tế bào 0,5 ml CaCL 100 mM, bổ sung 15% glyxerol - Hút 0,1 ml dịch tế bào vào ống EP bão quàn -75°c * Biến nạp: - Te bào biến lấy từ tú -80°C làm tan đá khoáng 30 phút - Lấy pl mẫu (DNA+T4 ligase+vector), đảo nhẹ nhàng đễ DNA phân bố dịch tế bào khà biến Sau đó, đế mẫu đá khoảng 30 phút - Sốc nhiệt cách đưa mầu chuyến sang bể ồn nhiệt với nhiệt độ 42°c ú phút 30 giây học Mo ỉa Nọi - Lấy mầu đặt trềin đấặtòn^ - Cho khoảng 500- 600 |4 LB lõng, lắc 37°c 45- 50 phút - Hút 100 pl dịch tế bào cấy trãi đìa mơi trường LB đặc có bổ sung Ampcilline 100 pl/ml, có thêm mM IPTG 40 pg/ml X-Gal, ủ đĩa 37°c qua đêm - Quy trình tách chiết DNA plasmide từ tế bào E.coli Cay chuyến khuân lạc cúa tế bào E coli vào ống nghiệm chứa ml mơi trường LB có bố sung pl Amp (100 pg/ml), ni lắc qua đêm 37°c, 200 vịng/phút - Rót 1,5 ml dịch ni cấy vào ống eppendorf (EP) 1,5 ml, ly tâm 6000 vòng/phút phút Thu tủa tế bào - Bo sung lOOpl Sol 1, vortex sau đặt nhiệt độ phịng 10 phút Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Bổ sung 200 pl Sol II mix nhẹ (không vortex) đặt đá 10 phút - Tiếp tục cho vào tube EP 600 pl hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol (24:1) - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Thu 400 pl dịch nồi cho vào tube EP có chứa lOOOpl cồn 100% (hoặc cho 2,5 lần thể tích dịch) đế dung dịch kết túa 20 phút -20°C - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Phần kết tủa với cồn 70% thu lại cách ly tâm 13000 vòng/phút - Làm khô kết tủa bàng máy speed- vac 10 phút - Hòa tan DNA plasmid vào 30- 40 pl dung dịch TE nước cất - DNA plasmid tách kiếm tra bang cách chạy điện di gel agarose 0,8% - Quy trình điện di protein gel polyacrylamid - SDS: ntt vien vicnTJai noc 1V1O Ila 1NỌ1 Xử lý mẫu protein: sau nuôi cấy điều kiện cảm ứng IPTG.các tế bào thu lại nhờ ly tâm phá đệm xừ lý mẫu sample buffer 6X ú 100°C 10 phút để phá tế bào, tích điện âm cho protein - Lắp bán gel, tra mẫu vào giếng chạy với cường độ dòng cố định từ 20-30 mA khoảng 45 phút - - Gỡ bàn gel đem nhuộm Cosmasie brilliant blue Quy trình cảm ứng biểu protein ngoại lai: Cay lac qua đêm khuẩn lạc 3ml LB lỏng có bồ sung Amp đến nong độ cuối 100 pg/ml (LBA) Lắc 37°c, 200 vịng/phút - Cấy chuyến,sang 10 mL mơi trường LBA đế biếu protein Lắc tiếp 1-2 37°c đến đạt OD6(X)~ 0,8 lấy tiến hành cám ứng IPTG với nong độ cuối ImM Hoàng Thị Hưong 45 Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Tiếp tục cấy lắc mầu cám ứng nhiệt độ thời gian tùy chọn - Thu mầu vào EP ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút đế thu cặn tế bào - Hòa cặn tế bào nước deion để ODeooCÚa mẫu 10 Vortex giữ - 20”C - Lấy mầu đế nhiệt độ phòng cho tan hết Phá tế bào bang siêu âm nhanh đến dịch tế bào không nhớt - Bo sung Sample buffer 6X, biến tính protein 100°C 10 phút - Điện di gel polyacrylamide, nhuộm bàn gel bang coomassie blue rửa lại dung dịch rửa cho đên qua sát băng điện di protein Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Hoàng Thị Hưong 46 ... cương xylanase Xylanse có tên gọi khác là:p -xylanase; endo-l,4-p -xylanase; cndo-l,4-P-D- xylanase; P-D -xylanase; endo-p-1,4 -xylan 4-xylanohydrolase; 1,4-P -xylan xylanohydrolase; P-l,4 -xylan xylannohydrolase... này[6.38] .Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase [42].Nhóm họ 10 bao gồm enzyme thủy phân cellobiose (dần xuất cellulose) (exocellulase) endo-p-l,3 -xylanase so với xylanase (endo-[3-l,4 -xylanase) ... -ChủngE coli DH Ob đượcsửdụnglàmchúngtáchdòng gen - ChúngE coli BL 21 đượcs? ?dụng làmchúngbiêuhiện gen * Plasmid - Plasmid pET -32a(+) đượcsừdụnglàm vector biếuhiện gen 2.1.2 Hóachấtvàenzyme * Hóachất