Nghiên cứu biểu hiện gen xbx mã hóa xylanase trong e coli sử dụng vector biểu hiện pet 22b(+)

gp Iffi VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC L3 - KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GIXV/ÍVVIÃ HĨA XYLANASE TRONG E COLI sử DỤNG VECTOR BIÉU HIỆN PET-22B(+) Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực : Chu Thị Khánh Ly Lóp :11-02 Hà Nội- 2015 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn vô sâu sac tới GS TS Trương Nam Hải, Viện trường Viện công nghệ sinh học TS Đỗ Thị Huyền, Trường phòng Kỹ thuật di truyền dã tận tình hướng dan, chi hảo truyền đạt cho em nhũng kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Trong trình làm việc, thầy, van thường xun trao đơi, góp ỷ, đem đến cho em nhũng lời khuyên, nhận xét, khích lệ q báu để giúp em hồn thành cơng việc Với tình cảm chân thành, em xin câm ơn hướng dan giúp dỡ cùa toàn thê cán phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ sinh học, đặc biệt NCS Nguyễn Thị Thào, NCS Phan Thị Thanh Huyền người hướng dan, ho trợ chi bào nhiệt tình chun mơn kỹ suốt q trình em hồn thành khỏa luận Em xin bày tỏ biết ơn đôi với thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiên thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt bon năm học tập trường Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, người thân gia đình, bạn bè thân thiết giúp đỡ, ủng hộ em suốt thời gian học tập làm việc vừa qua Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Chu Thị Khánh Ly SVTH: Chu Thị Khánh Ly KỈ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHÀN I: TÔNG QUAN 1.1 Xylan 1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan 1.3 Tổng quan enzyme xylanase 1.3.1 Khái niệm phân loại xylansac 1.3.1.1 Khái niệm 1.1.1.1 Phân loại xylanase 1.3.2 Cấu trúc xylanasc 1.3.3 Cơ chế xúc tác xylanase 1.3.4 Nguồn xylanase ỉ.3.4.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuân 1.3.4.2 Sinh tông họp xylanase từ nấm mốc 1.3.5 1.4 ứng dụng xylanase 1.3.5.1 Trong công nghiệp sán xuất thức ăn chăn nuôi 10 1.3.5.2 Trong sản xuất bánh 10 1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang 11 1.3.5.4 Trong sàn xuất cồn nhiên liệu .11 1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt 11 1.3.5.6 Trong tay trang giày bột giấy 12 Tách dòng biểu gen 12 1.4.1 Vector biếu pET-22b(+) 12 1.4.2 Chủng biểu E coll BL21 13 1.4.3 Các nghiên cứu công bố biếu xylanase 14 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 2.1 cứu 15 Vật liệu 15 2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 15 2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy 15 SVTH: Chu Thị Khánh Ly ii KỈ8.CNSH 11-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2.1.3 Hóa chất dung dịch sừdụng 15 2.1.2 ỉ Hóa chất 15 2.1.2.2 Enzyme 16 2.1.2.3 Dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế hào E coli 16 2.1.2.4 Các dung dịch dùng điện di DNA gel agarose 16 2.1.2.5 Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide- SDS 17 2.1.3 Máy móc thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp PCR 17 2.2.2 Biển nạp DNA plasmid vào tế báo E coli phương pháp sốc nhiệt 18 2.2.3 Tách chiết DNA lasmid từ tế bào E coli 19 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 21 2.2.5 Xử lý DNA enzyme hạn chế 22 2.2.6 Biếu gen 23 2.2.7 Điện di protein gel polyacrylamid - SDS 23 2.2.8 Phá tế bào siêu âm tách pha protein tan không tan 24 PHẦN III: KẾT QUÀ THÁO LUẬN 25 3.1 Thiết kế vector biểu pET22xbx 26 3.1.1 Nhân dịng gen xbx mã hóa enzyme xylanase bang kỹ thuật PCR 26 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR vector pET22b(+) Ncoỉ+Xhoỉ 27 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu pET-22b(+) 27 3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E coli DH10B 29 3.1.5 Kiểm tra gen xhx vector pET-22xbx enzyme hạn chế 30 3.2 Biếu gen xbx chủng E coll BL21 .31 3.3 Lựa chọn điều kiện biểu 33 3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy chủng mơi trường có chất cảm úng 33 3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG 34 KÉT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHÁO 39 SVTH: Chu Thị Khánh Ly iii KỈ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẢT DNA Acid deoxyribonucleic Bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra acid acetic EtBt Ethidium bromide Kb Kilobasc OD Optical density PBS Phosphate buffered saline RNAse Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate TAE T ris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA dH2O Nước de ion SDS-PAGE SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis Amp Ampicillin E coli Escherichia coll IPTG Isopropyl p-D-1 -thiogalactopyranosidc SVTH: Chu Thị Khánh Ly iv KỈ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng Thành phần phân ứng cắt 22 Bàng Thành phần chất phản ứng nối ghép gen 22 Bảng Bàng giá trị OD600 thu mẫu 34 SVTH: Chu Thị Khánh Ly KỈ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc cùa arabinoxylan cỏ Graminiae Hình Vị trí cơng cùa enzym vào xylan cở [2] Hình Cấu trúc không gian chiều cúa Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans Hình Cấu trúc khơng gian chiều xylanase họ 11 Hình Sơ đồ vector pET-22b(+) .13 Hình Sơ đồ thí nghiệm thiết kc vector biểu mang gcn xbx 25 Hình Phân tích sản phấm nhân gen xbx kỹ thuật PCR gel agarose 0,8% 26 Hình Kết tinh sản phẩm PCR vector pET-22b(+) 27 Hình Đĩa biến nạp pET22-xbx vào tế bào E coli DH10B 28 Hình 10 Phân tích sản phấm tách DNA plasmid pET22-xbx 29 Hình 11 Ket điện di sán phẩm cắt kiểm tra gen xbx plasmid pET-22b(+) bang enzyme hạn chế 30 Hình 12 Ket biếu protein XBX hr dòng E coli BL2I tái tố hợp 31 Hình 13 Kết quà kiểm tra khả tan protein XBX 32 Hình 14 Phân tích sàn phẩm biếu protein E coli BL21 manggcn xbx nhiệt độ khác 33 Hình 15 Phân tích protein tống số biếu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác .35 Hình 16 Phân tích protein pha tan biếu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 35 SVTH: Chu Thị Khánh Ly vi KỈ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU Hiện trái đất, mồi nãm thực vật sản sinh lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tý tan Tất hoạt động cùa người loài động vật cần đen thực vật Chúng nguồn lương thực để nuôi sống người động vật đồng thời nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho ngành công nghiệp Ngày nay, phế phụ phẩm cúa ngành nơng, lâm nghiệp cịn tận dụng đe chuyến hóa nhiều chất có giá trị, điền hình nhiên liệu sinh học đề thay nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày cạn kiệt Thành tế bào thực vật có cấu tạo vững bời cellulose, hemicellulose lignin đế phá hủy phần tồn chúng người ta thường sử dụng hóa chất mạnh axit mạnh hay kiềm mạnh đế loại bở lignin, giải phóng cellulose, hemicellulose Bước tiếp theo, nguồn cellulose, hemicelluloses can chuyển hóa thành đường phức hệ enzyme cellulase Đường tạo thành dùng để lên men tạo sản phấm cồn sinh học chất khác Do enzyme cellulase, hemicellulase chưa đáp ứng yêu cầu công nghiệp hoạt tính tốc độ thủy phân, nhiều nghiên cứu giới tìm enzyme có hoạt tính sinh học tốt đế làm giảm giá thành sản phấm cuối Một loại enzym nhiều nhà khoa học quan tâm xylanase Enzym có khả thủy phân hiệu quà xylan - thành phần chủ yếu cùa hemicellulose thành tế bào thực vật Xylanasc có nhiều ứng dụng công nghệ che biến giấy bột giấy, công nghệ thực phấm, công nghiệp sàn xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng sàn xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol sinh học) từ phế thải nông nghiệp Xuất phát từ vấn đề tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu biếu gen xhxs mã hóa xỵlanase E coli sử dụng vector biếu pET-22b(+)” Đồ tài thực Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học PHẦN I: TĨNG QUAN 1.1 Xylan Xylan, thành phần bán cùa hemicellulose tìm thấy thành tế bào thực vật, polysaccharide bán thứ hai sau cellulose [1], Trong thực tế, thành tế bào thực vật vật liệu phức tạp cellulose (3550%), hemicellulose (20-30%) - nhóm cacbonhydrat dạng xylan loại chù yếu - lignin (20-30%) liên kết chặt chẽ với Xylan polysaccharide hồn tạp có chứa nhóm phụ gốc acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl a-arabinofuranosyl liên kết với khung tạo gốc xylopyranose Bộ khung liên kết với theo kiếu p-l,4-glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan liên kết este bàng gốc cùa axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2], [3], Hình Cấu trúc cúa arabinoxylan cúa cở Graminiae Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu cúa thành tế bào cùa thực vật sống lâu năm, từ 15-30% gồ cứng 7-10% gồ mềm Với gỗ mềm, nhóm phụ xylan chủ yếu axit 4-O-methyl glucuronic arabinose Chúng liên kết với khung xylan bang liên kết a-1,3- glycozit Hiếm thấy nhóm acetyl xylan gỗ mềm Tỷ lệ arabinose so với xylose thường 0,6 [4], SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hemicellulose gỗ cứng có nhóm phụ axit 4- O-methyl glucuronic, axit acetic axit uronic Bộ khung cùa xylan gỗ cứng gồm gốc 0-1,4-Dxylopyranose, trung bình 10-20 gốc xylose có axit 4- O-methyl glucuronic liên kết với theo kiểu a-l,2-glycozit xấp xi 60-70% đơn vị xylose este hóa với axit acetic nhóm hydroxyl carbon thứ thứ trung binh mười đơn vị xylose có nhóm axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu a-1,2-glycozit [2], [4], [5] 1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan Phân huý sinh học xylan kết hợp hoạt động cùa nhiều loại enzym endo-p-1,4-xylanase (p-l,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực nhiệm vụ phân cắt mạch xylan việc thùy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo oligosaccharide Sau exo-P-l,4-D-xylosidase (P-l,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân oligosaccharide thành monomer Các nhóm bên có mặt xylan giải phóng bời a-L-arabinofuranosidase, a-Dglucuronidase, galactosidase acetyl xylan esterase Exo-P-1,4-D-xylosidasc (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân p-l,4-D-xylo- oligosaccharide cách loại bỏ xylose từ đầu khơng khử Có nhiều cơng bố Bacillus sp [6] số nam [7] sinh tổng hợp p-xylosidase nội bào Enzym a-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối không khứ a-L-arabinofuranosyl arabinan, arabinoxylan arabinogalactan Một lượng lớn vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn lồi vi khuấn cơng bố có khả sinh tống hợp rx-arabinosidase Rhodothermus marinus lồi chịu nhiệt có sinh enzym lớn với hoạt độ 6,6 u/ml [8] Enzym a-D-glucuronidasc (EC 3.2.1.1) thúy phân liên kết a-l,2-glycosidic xylose D-glucuronic axit liên kết ete với 4-O-methyI Sự thủy phân liên kết a-1,2 bền vừng đóng vai trị quan trọng thủy phân xylan Tương tự liên kết cacbonhydrat lignin, dạng liên kết 4-O-mcthyl-glucuronidase với xylose hàng rào phá hủy gỗ Có nhiều vi sinh vật có khả sinh tổng hợp a-glucuronidase [9] SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1 Thiết kế vector biếu pET22xbx 3.1.1 Nhân dịng gen xbx mã hóa enzyme xylanase bang kỹ thuật PCR PCR phân ứng tiến hành nhiệt độ cao nên việc sử dụng enzyme để tổng hợp chuồi vấn đề cần quan tâm lưu ý Ớ sử dụng enzyme Taq polymerase vốn loại DNA polymerase chịu nhiệt, có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus Nhờ đó, q trình tồng hợp DNA trở nên dề dàng PCR kỹ thuật dựa sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp Đoạn gen xbx mã hóa cho enzyme E coli theo lý thuyết có chiều dài khoảng 1410 bp Do đó, sử dụng kỹ thuật để nhân đoạn gen xhx lên gấp nhiều lần nhằm dề dàng tiến hành cho thí nghiệm Các bước tiến hành PCR mô tả phần phương pháp Sau kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm xbx kiểm tra điên di gel agarose 0,8% Kết q thể hình Hình Phân tích sàn phẩm nhân gen xbx kỹ thuật PCR gel agarose 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR gen xbx Đường chạy 2: DNA chuẩn Ikb ( Fermentas) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 26 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Trên điện di đồ cho thấy: sản phẩm PCR có băng sáng, sắc nét, có kích thước khoảng 1,5 kb tương đương với kích thước theo tính tồn lý thuyết cùa đoạn gen xbx cần khuếch đại 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR vector pET-22b(+) Ncoỉ+Xhoỉ Sau kiếm tra vector tái tổ hợp pBlue-xốx theo tính tốn lý thuyết, chúng tơi tiến hành tủa sán phẩm PCR bàng ethanol để loại bó đệm PCR sau cắt sản phẩm PCR cặp enzyme hạn chế Xhoỉ + Nco\ Đồng thời cắt vector pET-22b(+) bang cặp enzyme để tạo đầu dính bổ sung Sàn phẩm cắt tinh bang Kit Qiagen trinh bày phần vật liệu phương pháp điện di kiếm tra gel agarose 0,8% xbx M PET22 Hình Kct tinh sản phẩm PCR vector pET-22b(+) sau cắt bàng cặp enzyme hạn chế Ncoỉ+Xhoỉ Hình cho thấy rang gen xbx vector pET-22b(+) tinh thành cơng sẵn sàng cho thí nghiệm 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biếu pET-22b(+) Vector pET-22b(+) lựa chọn đế biểu gen Như trinh bày đoạn gcn xbx vector pET-22b(+) có đầu dính bồ sung Khi nằm hỗn hợp phán ứng lai ghép đầu dính bồ sung bát cặp với nối lại với xúc tác cùa enzyme T4 DNA ligase Đây enzyme có nguồn gốc từ tế bào E coli bị nhiễm thực khuẩn the T4, sứ dụng phổ biến phản ứng nối ghép gen có khả hình thành liên kết phospho diester nucleotide SVTH: Chu Thị Khánh Ly 27 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học đứng cạnh Nó khơng chi hiệu việc ghép nối đoạn DNA đầu dính mà cịn có the nối DNA đầu Tỷ lệ phàn úng nối ghép gen 3:1 gen vector pET-22b(+) số mol Đế thuận tiện, đặt tên cho plasmid tái tổ hợp thu pET22-xAx Sản phấm phản ứng nối ghép sau biến nạp vào tế bào E coli DH10B đế tiến hành chọn dịng Hình Đĩa biến nạp pET22-,vóx vào tế bào E coli DHIOB Ampicillin chất kháng sinh chứa vịng p - lactam có khả liên kết với enzyme transpeptidaza Enzyme tham gia xúc tác cho hình thành liên kết ngang peptidoglycan vi khuấn, làm cho thành tế bào vi khuẩn yếu q trình phân bào, chí làm tế bào bị thủy phân vi khuẩn bị chết Do đó, mơi trường chọn lọc có chứa ampicillin, chi tế bào vi khuấn E coli mang dòng plasmid chứa gen kháng kháng sinh sống sót sinh trướng mơi trường đĩa thạch LBA Như vậy, khuấn lạc quan sát thay đĩa thạch có the dịng tế bào mang plasmid Tuy nhiên, te bào E coli DH10B ngồi chứa plasmid mang gen ( pET22-,róx) thi cịn chứa cà vector pET-22b(+) khơng mang gen ngoại lai mang gen kháng kháng sinh nên có sinh trưởng đĩa thạch Để loại trừ dịng plasmid khơng mong muốn lựa chọn dòng tái tố SVTH: Chu Thị Khánh Ly 28 KÌ8.CNSH 11-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp hợp, tiến hành tách DNA plasmid từ thể biến nạp, sau cắt kiểm tra kích thước gen ngoại lai bang cặp enzyme hạn chế Xhoỉ Ncoỉ 3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E coll DH10B Việc tách chiết DNA plasmid bước nhận biết có mặt cùa gen xbx vector pET-22b(+) Trong thí nghiệm này, lựa chọn ngầu nhiên khuẩn lạc từ đĩa biến nạp nuôi lắc qua đèm 37°c mơi trường LBAmp lỏng Sau đó, chúng tơi tiến hành tách DNA plasmid cùa dòng E coli DH10B theo quy trình mơ tà phần phương pháp vật liệu Ket điện di DNA plasmid tử dịng biến nạp hiên hình 10 Hình io Phân tích sản phấm tách DNA plasmid pET22-x/zr Dường chạy 1-5: Các dòng biến nạp pET22-.rAr Đưòng chạy 6: Vector pET-22b(+) Theo lý thuyết, plasmid pET-22b(+) mang gen xhx có kích thước lớn so với vector pET-22b(+) khơng có gen ngoại lai chèn vào Quan sát điện di đồ (hình 10) chúng tơi thấy mẫu tách chiết có kích thước tương đối đong Khi so sánh với mẫu đối chứng vector pET-22b(+) không mang gen, dòng DNA plasmid xuất băng DNA có kích thước cao hơn, chứng tỏ khã lớn chúng có mang gen Tuy nhiên, đế kết luận xác plasmid có chứa gcn xbx hay khơng, tiến hành cắt plasmid pET22-x&c hai enzyme hạn chế Xho\ Ncoỉ đồng thời giái trình tự SVTH: Chu Thị Khánh Ly 29 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1.5 Kiểm tra gen xbx vector pET-22xbx enzyme hạn chế Plasmid tái tô hợp pET22-xốx cắt kiềm tra cặp enzyme cắt hạn chế Xhoỉ Nco\ Trinh tự nhận biết cùa hai enzyme đưa vào hai mồi dùng để khuếch đại gen nên gen hạn chế bới cặp enzyme Nco\, Xho\ hai đầu 5’, 3’ tương ứng Vì vậy, cắt bang cặp enzyme hạn chế này, plasmid pET22-xốx cắt thành đoạn DNA Một đoạn có kích thước 1,4 kb tương ứng với kích thước gen xbx, đoạn cịn lại vector Sản phẩm từ phản ứng cắt điện di gel agarose 0,8%, kết quà băng DNA thể hình 11 Quan sát kết quà điện di đồ ( hỉnh 11) thấy, sàn phẩm cắt plasmid pET22-xòx dòng số 1,2, 3, 4, xuất băng: băng thứ có kích thước khống 1,4 kb tương đương với kích thước gen xbx; băng thứ hai có kích thước khống 5,5 kb tương ứng với kích thước vector pET-22b(+) cắt bời cặp enzyme Xhoỉ Ncoỉ Như vậy, đưa gen xhx vào vector pET22b(+) đế tạo thành vector pET22-xốx M 10000 6000 5000 3000 1500 1000 500 Hình 11 Kết điện di sản phấm cắt kiềm tra gen xbx plasmid pET22b(+) bang enzyme hạn chế M: DNA kb chuẩn Đường chạy số 1-5: DNA plasmid xử lý với A7?ol Ncoỉ SVTH: Chu Thị Khánh Ly 30 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 3.2 Biếu gen xbx chủng E coli BL21 Trong vector biêu pET 22b(+), hoạt động gen xbx điều khiển bời operon lac với chế kiếm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG Sau biến nạp lựa chọn ngẫu nhiên khuấn lạc E coli BL21 mang gcn xbx nuôi cấy qua đêm 37°c mơi trường LBA lịng Sau đó, tế bào chuyến sang binh ni cấy khác chứa môi trường LBA cho OD600 ban đầu 0,1 nuôi lắc điều kiện 37°c để OD600 đạt từ 0,6 - 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM cảm ứng điều kiện lắc 30°C, tốc độ 200 vòng/phút để tổng hợp protein XBX Dòng đối chứng chứa vector pET-22b(+) không mang gen (đối chứng âm) nuôi cấy điều kiện Sau ly tâm thu sinh khối tế bào, đưa mầu giá trị OD6()0 = 10 Tiếp theo mẫu protein biến tính đệm biến tính điện di kiêm tra gel SDS-PAGE 12,6% Kết điện di quan sát sau nhuộm với thuốc nhuộm coomassic (Hình 12) (-) M Hình 12 Kết quã biểu protein XBX từ dòng E coli BL21 tái tổ hợp Đối chứng (-) : Protein chúng E coỉi mang pET-22b(+) Đưòng chạy M : Protein chuấn (Fermentas) Đường chạy số 1-4 : Protein chúng E coli mang pET22-x/>.v Kết điện di trình bày hình 12 cho thấy, đường chạy mang protein chủng E coli mẫu từ dòng biển nạp mang gen xbx xuất băng protein có SVTH: Chu Thị Khánh Ly 31 KÌ8.CNSH 11-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp kích thước khoảng 51,7 kDa tưong ứng với kích thước cũa protein XBXS tính tốn lý thuyết, đường chạy đối chứng (-) chủng không mang gen không xuất băng protein Như vậy, từ kết quà nhuộm coomassie cho thay protein XBX biểu chủng E coli BL21 tái tổ hợp Các enzyme tái tố hợp thường có hoạt tính tốt biếu pha tan cùa tế bào Để kiểm tra tan cũa protein tái tổ hợp tiến hành siêu âm phá tế bào Kết điện di kiếm tra hình 12 M kDa T TS KT (-) Hình 13 Kết kiểm tra protein XBX pha tan M: protein chuẩn (Fermentas) TS: protein tồng số KT: protein không tan T: protein tan (-): đối chứng âm Kết quà hình 13 cho thấy protein XBX biểu chùng E coli BL21 yếu dạng không tan, dạng khơng mong muốn Do đó, chúng tơi tiến hành lựa chọn điều kiện đề biếu protein dạng tan Vì dạng tan khả protein cuộn xoắn cấu trúc cao hon, vùng định hoạt tính bộc lộ SVTH: Chu Thị Khánh Ly 32 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 3.3 Lựa chọn điều kiện biểu 3.3.1 Nhiệt độ ni cấy chủng mơi trường có chất cảm ứng Thơng thường nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng cũa E coli 37°c Tuy nhiên, chủng E coli tái tồ hợp điều kiện quan tâm trước tiên khả tống hợp protein tái tố hợp Trong nghiên cứu này, tiến hành cảm ứng tế bào bang 1PTG nồng độ cuối 0,5 mM cho thay đối nhiệt độ 20°C, 25°c, 30°C, 37°c Sau nuôi cấy sinh khối tế bào thu bang cách ly tâm Chúng đưa mẫu giá trị ODtìoo = 10 Tiếp theo mẫu protein biến tính bang đệm biển tính điện di kiểm tra gel SDS- PAGE 12,6% Kết điện di quan sát sau nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie (Hình 13) Hình 14 Phân tích sàn phẩm biếu protein E coli BL21 mang gen xbx nhiệt độ khác M: protein chuẩn T: protein tan TS: protein tổng số KT: protein khơng tan Hình 14 cho thấy nhiệt độ 20°C 25°c protein XBX tồng hợp tồng hợp kém, với nhiệt độ 37°c băng protein quan tâm xuất hon so với protein nhiệt độ 30°C Chúng nhận thay rang nhiệt độ 30°C băng protein thu tốt Do đó, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ để biểu SETH: Chu Thị Khánh Ly 33 KÌ8.CNSH 11-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp 30°C Tuy nhiên, tất nhiệt độ khảo sát, XBX tổng hợp chủ yếu pha khơng tan Vì vậy, tiến hành khảo sát nồng độ IPTG với mong muốn nồng độ IPTG thấp, tốc độ cảm ứng biếu protein tái tổ hợp thấp nên khã enzyme đóng gói tốt pha protein tan 3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG Nồng độ chất cám ứng điều kiện quan trọng định khả biếu cúa protein ngoại lai Bên cạnh chất đắt tiền Do đó, việc xác định nồng độ IPTG tối ưu cho trình biểu protein ngoại lai cơng việc cần thiết có ý nghĩa thiết thực trinh sán xuất sau Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành cảm ứng biếu dải nồng độ IPTG khác nhau: mM, 0,02 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,8 mM, mM, 1,5 mM, mM Chủng E coli BL21 tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LBA 20"C lắc 200 vịng/phút Sau ni cấy tiến hành đo OD6()() thu mẫu kết bang Báng Bảng giá trị OD600 thu mầu Nồng độ IPTG nĨM OD 600 thu mẫu 0.02 715 8.95 5.375 395 375 0.05 0.1 0.2 5.7 5.52 0.3 0.4 0.5 0s 615 265 185 15 5.02 5.35 Te bào thu lại cách ly tâm với tốc độ 600 vòng/ phút 10 phút Sau đó, đưa OD600 = 10 xử lý sóng siêu âm Ket quà điện di kiếm tra gel polyacrylamide 12,6% ( hình 15) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 34 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Kết bảng cho thấy cám ứng nồng độ IPTG từ đến 0,8 mM, sinh khối tế bào thay đồi không đáng kế Chứng tỏ biếu XBX không làm ành hưởng đen sinh trướng phát triển cùa tế bào Tổng số I (■) kữa 0.02 0.05 0.1 M 012 0.3 0.4 0.5 0.0 X 1.5 Hình 15 Phân tích protein tồng số biều E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 0-2 mM: nồng độ 1PTG cám ứng M: Protein chuẩn (Fennentas) Pha tan I kDa [õ \ ' M 0.02 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Q.s 0.8^ 1.5 (-) I 116,0 Hình 16 Phân tích protein pha tan biếu E coli BL21 mang gcn xhx nồng độ 1PTG khác 0-2 mM: nồng độ 1PTG cám ứng M: Protein chuẩn (Fcrmcntas) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 35 KÌ8.CNSH 11-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Quan sát ảnh điện di, thấy cảm ứng IPTG nồng độ 0,02 mM, nồng độ IPTG thấp nên không thấy băng protein XBX, chứng tở nồng độ chất cảm ứng không đủ đế căm ứng promoter sinh tổng hợp protein tái tồ hợp Từ nồng độ 0,05 mM trở lên thấy xuất XBX kích thước 51,7 kDa Hàm lượng protein biếu tương đương cãm ứng nồng độ 0,2 mM đến mM IPTG Kết quã kiểm tra pha tan cho thấy băng protein quan tâm xuất cảm ứng nồng độ 0,05 mM trở lên Tuy nhiên hàm lượng protein thấp Chúng chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,3 mM băng protein tái tồ hợp thu pha tan nhiều SVTH: Chu Thị Khánh Ly 36 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KÉT LUẬN Với mục tiêu đặt trinh thực đề tài “Nghiên cứu biếu gen xbxs mã hóa xylanase E coli sừ dụng vector biếu pET-22b(+)”, hồn thành cơng việc sau: - Thiết kế thành cơng vector biếu pET22b-xfcr mang gcn xbx mã hóa - Biếu thành công protein XBX chúng biếu E coli BL21 - XBX biếu pha tan tốt chửng nuôi cấy cho enzyme xylanase E coli mơi trường LBA có chứa 0,3 mM 1PTG với nhiệt độ nuôi cấy 20°C SVTH: Chu Thị Khánh Ly 37 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KIÊN NGHỊ Đe tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Cần kiểm tra hoạt tính sơ enzyme tái tổ hợp - Tinh chế XBX đế xác định tính chất xylanase SVTH: Chu Thị Khánh Ly 38 KÌ8.CNSH 11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO I Biely, p., Microbial xylanolytic systems, Trends in Biotechnol 3,286- 289, 1985 Puls, J., Chemistry and biochemistry of hemicelluloses: Relationship between hemicellulose structure and cnzyms required for hydrolysis, Macromol Symp 120, 183-196, 1997 Bissoon, s., Christov, L and Singh, s., Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochem 37, 567-572, 2002 Dervilly, G., Thibault, F and Saulnier, L., Experimental evidence for a semi-flexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res 330, 365-372, 2001 Tcleman, A., Tcnkanen, M., Jacobs A and Dahlman, o., Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono) xylan isolated from birch and beech, Carbohydrate Research 337, 373-377, 2002 La-Grange, D c., Claeyssens, M., Pretorius, I s., van-Zyl, w H., Coexpression of the Bacillus pumilus beta-xylosidase (xynB) gene with the Trichoderma reesei beta-xylanase-2 (xyn2) gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Appl Microbiol Biotechnol 54, 195-200, 2000 Poutanen, K Characterisation of xylanolytic enzyms for potential applications Ph.D Thesis, Technical Research Centre of Finland, Publications, 47, Espoo, 1988 Gomes, J., Gomes, 1., Terler, K., Gubala, N., Ditzelmuller, G and Steiner, w., Optimisation of culture medium and conditions for a - L - arabinofuranosidase production by the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus, Enzym Microb Techno! 27, 414-422, 2000 Hazlewood, G p and Gilbert, H J., Molecular biology of hemicellulases, in Hemicelluloses and Hemicellulases, Coughlan, M p and Hazlewood, G p Eds., Portland Press, London, 103-126, 1993 10 Wong, K.K.Y., Tan, L, u L and Saddler, J N., Multiplicity of P1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications, Microbiol Rev 52, 305-317, 1988 11 Sapag, A., Wouters, J., Lambert, c., loannes, p., Eyzaguirre, J and Depiereux, E., The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships, J Biotechnol 109-131,2002 12 Kuno, A., Kaneko, s., Ohtsuki, H., Ito, s., Fujimoto z., Mizuno, H„ Hasegawa T., Taira K., Kusakabe, I And Hayashi, K., Novel sugar-binding specificity of the type XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from Streptomyces olivaccoviridis E-86, FEBS Letts 482, 231-236, 2000 13 Biely, p., Markovik, o., and Mislovicova, D., Sensitive detection of cndo-l,4-Pglucanascs and endo-1,4-P-xylanascs in gels, Anal Biochem 144, 147-151, 1985 SVTH: Chu Thị Khánh Ly 39 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 14 Biely, p Vrsanska, M., Tcnkancn, M and Klucpfel, D Endo-p-xylanascs families: differences in catalytic properties, J Biotechnol 57, 151-166, 1997 15 Jeffries T w Biochemistry and genetics of microbial xylanases Curr Opin Biotechnol 1, 337-342, 1996 16 Torronen, A., Harkki, A., Rouvinen, J., Three dimensional structure of endo1,4-P-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in active state, EMBOJ B 3, 2493-2501, 1994 17 Wakarchuk, w w Campbell, R.L Sung, W.L., Davoodi, J and Yaguchi, M., Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase, Prot Sci 3, 467-475, 1994 18 Leggio, L L Jenkins, J., HarrisG.W and Pickersgill, R w., X-ray cystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A, Proteins: Struct Function and Genetics 41, 362-374, 2000 19 Meagher, MM, Tao, B.Y., Chow, J M., and Reilly, P.J., Kinetcs and subsite mapping of p-D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus endoxylanase, Carbohydr Res 173, 273-283, 1988 20 Bray, M R and Clarke, A J., Identification of an essential tyrosyl residue in the binding site of Schizophyllum commune xylanase-A, Biochemistry, 34, 20062014, 1995 21 Kulkarni N., Shendye A and Rao, M., Molecular and biotechnological aspects of xylanases, FEMS Microbiol Rev 23, 411-456, 1999 22 Clecmput, G., Hcssing, M., van Oort, M., Dcconynck, M and Dclcour, J A., Purification and characterization of p-D-xylosidase and an cndo-xylanasc from wheat flour, Plant-Physiol 113,377-386, 1997 23 Lebeda, A., Luhová, L., Sedlá, M and Jan, D., The role of enzyms in plantfungal pathogens interactions, Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 108,89-95,2001 24 c Feoli, J D Hancock, c R Monge, c L Jones, and c w Starkey, Effects of xylanasc and wheat middings in diets for finishing pigs, 124-127, Swine Day 2006 25 Dawn Elizabeth Stephens, Protein engineering or a fungal xylanase, Department of Biotechnology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of Technology, Durban, South Africa February 2007 26 Tamba-Berehoiu Radiana, Jurcoane Stefana, Popa N.c, Bagiu Liliana, Rosu Ana, Testing of the efficiency of some enzymatic mixture, concerning the conversion of several lignoccllulosic biomass’ sourses, to reducing sugars, Lucrări ậtiinNitĩce Zootehnie ặi Biotehnologii, vol 41(1), Timiặoara, 155-161, 2008 27 J Ragauskas, Kathleen M Poll, Effect of Xylanase Pretreatment Procedures for Nonchlorine Bleaching, Institute of Paper Science and Technology, Atlanta, GA 30318, 1993 SVTH: Chu Thị Khánh Ly 40 KI 8.CNSH 11-02 ... Trong nghiên cứu sử dụng vector pET- 22b(+) làm vector biếu Vector pET- 22b(+) có chiều dài 5493 bp (hỉnh 5) vector sử dụng chủ yếu cho tách dòng biếu gen tái tổ họp E coli cấu tạo, vector bao gồm:... (xynB) gene with the Trichoderma reesei beta -xylanase- 2 (xyn2) gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Appl Microbiol Biotechnol 54, 195-200, 2000 Poutanen, K Characterisation of xylanolytic enzyms... tài nghiên cứu thiết kế vector biếu biếu gen mã hóa enzyme xylanase E coli mơ tà tóm tắt hình Gen xbx có kích thước 1410 bp khuếch đại từ vector tách dòng pBluexbxs cắt đồng thời cặp enzyme hạn