Biểu hiện gen NAT05 mã hóa nattokinase trong bacillus Subtilis BD170

Nội dung của bài viết trình bày việc tối ưu hóa thời gian cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng IPTG của gen nat05 mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 với hoạt tính protease mạnh. Tại thời điểm 10 giờ, nat05 biểu hiện nattokinase mạnh gấp 9,5 lần so với đối chứng.

pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 130, Số 1A, 69–75, 2021 BIỂU HIỆN GEN NAT05 MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG BACILLUS SUBTILIS BD170 Nguyễn Thị Anh Thư1,2*, Hồ Thị Trang1 Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế, Việt Nam Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế, Ngô Quyền, Huế, Việt Nam * Tác giả liên hệ Nguyễn Thị Anh Thư (Ngày nhận bài: 19-05-2020; Ngày chấp nhận đăng: 12-11-2020) Tóm tắt Nattokinase, serine protease có sản phẩm Natto truyền thống Nhật Bản, có khả làm tan đặc hiệu sợi fibrin gây đơng máu có ích việc phân hủy huyết khối nội sinh người Nattokinase sản xuất phương pháp lên men lẫn công nghệ DNA tái tổ hợp Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày việc tối ưu hóa thời gian cảm ứng nồng độ chất cảm ứng IPTG gen nat05 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 với hoạt tính protease mạnh Tại thời điểm 10 giờ, nat05 biểu nattokinase mạnh gấp 9,5 lần so với đối chứng Ở nồng độ IPTG mM, nat05 sinh hàm lượng nattokinase mạnh (gấp 10 lần so với đối chứng) Từ khóa: Bacillus subtilis, nattokinase, nat05, biểu Expression of nat05 encoding for a nattokinase in Bacillus subtilis BD170 Nguyen Thi Anh Thu1,2 *, Ho Thi Trang1 University of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue St., Hue, Vietnam University of Medicine and Pharmacy, Hue University, Ngo Quyen St., Hue, Vietnam * Correspondence to Nguyen Thi Anh Thu (Received: 19 May 2020; Accepted: 12 November 2020) Abstract Nattokinase, a serine protease found in the Japanese Natto product, can specifically dissolve fibrin fibers causing coagulation and is useful in endogenous thrombolysis Currently, nattokinase is produced with the help of traditional fermentation and recombinant DNA technology approaches In this study, we presents the optimization of time and the inducing substance (IPTG) concentration of gene nat05 encoding for a nattokinase in Bacillus subtilis BD170 with strong protease activity After 10 hours’ cultivation, nat05 expresses 9.5 times higher than the control At the IPTG concentration of mM, nat05 exhibits the strongest activity, which is 10 times higher than the control Keywords: Bacillus subtilis, nattokinase, nat05, expression Đặt vấn đề hay nhồi máu não tăng cao Việt Nam nước giới Theo tổ chức Y tế Thế giới, hàng Hiện nay, tỉ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim cục máu đông chứng nhồi máu tim DOI: 10.26459/hueunijns.v130i1A.5785 69 Nguyễn Thị Anh Thư CS mạch mà nguyên nhân hậu chứng Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu huyết khối Căn bệnh thật trở thành mối đe dọa sức khỏe người Trước đây, người ta thường điều trị bệnh phẫu thuật Chủng Bacillus subtilis BD170 tạo dùng số loại enzyme urokinase, dòng mang vector pHT43 tái tổ hợp gen nat05 streptokinase, v.v làm tan huyết khối có hiệu (pHT43/nat05) chủng Bacillus subtilis BD170 tức khơng kéo dài lâu, đắt tiền có nguy (chủng hoang dại) phịng thí nghiệm Bộ biến chứng gây xuất huyết Nattokinase thực môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường có hiệu cao sản phẩm làm tan Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp Vector huyết tụ thông thường khác urokinase, pHT43 (MoBiTec, Mỹ) sử dụng để biểu streptokinase tissue plasminogen activator gen B subtilis BD170 (Hình 1) (t- PA) Nattokinase thu nhận chủ yếu đường lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể Hiện có nghiên cứu bước đầu tạo nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính hệ thống vi khuẩn (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactococcus sp.) [1] Hướng nghiên cứu nattokinase tái tổ hợp bước đầu cho thấy hiệu enzyme tái tổ hợp biểu có hoạt tính tiết ngoại bào [2] Tuy nhiên, nghiên cứu nước theo Hình Vector pHT43 (MoBiTec, Mỹ) hướng nattokinase tái tổ hợp nhu cầu sử dụng nattokinase ngày tăng cao 2.2 nhờ lợi ích [3-5] Trong nước, Kiểm tra biểu nattokinase ngoại bào hệ thống vector pHT43 công ty dược phẩm bắt đầu cho sản Phương pháp phẩm từ nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao [6] Việc tìm Tách chiết plasmid tái tổ hợp pHT43 kiếm nguồn nguyên liệu nattokinase có hoạt tính Chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp cấy ổn định giá phù hợp định hướng nhiều mL môi trường LB lỏng (1% tryptone, 0,5% công ty nước Do vậy, việc tìm hiểu thu dịch chiết nấm men, 1% NaCl) qua đêm 37 °C với nhận nguồn gen mã hóa nattokinase tốt từ tốc độ lắc 200 vòng·phút–1 Sinh khối tế bào chủng B subtilis tái tổ hợp mở triển vọng cho thu hồi ly tâm 13.000 vịng·phút–1/5 phút cơng nghệ sản xuất thu nhận nattokinase hoạt Plasmid tái tổ hợp pHT43 B subtilis tách tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm chiết cách sử dụng kit GeneJET Plasmid thực phẩm chức Trong nghiên cứu này, Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific) Sản phẩm chúng tơi trình bày kết điều kiện biểu trình tách chiết sử dụng để kiểm tra tối ưu gen nat05 mã hóa nattokinase có mặt gen nat05 tái tổ hợp B subtilis Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp BD170 Kiểm tra có mặt vector pHT43 tái tổ hợp Sự có mặt vector tái tổ hợp pHT43 mang gen nat05 kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 1) 70 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 130, Số 1A, 69–75, 2021 Bảng Cặp mồi khuếch đại gen nat05 Tên gọi Trình tự nucleotide Kích thước (pb) NatF 5’-GGATCCTTCAGCAACAAGTCTGC-3’ 1100 pb NatR 5’-CCCGGGTTATTGTGCAGCTGCTT-3’ Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 40 ng DNA tng s, 10 pmol/àL mi primer, 10 àL 2ì PCR Master Mix (Fermentas) với tổng thể tích Khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng lên sinh tổng hợp nattokinase Cảm ứng sinh tổng hợp nattokinase phản ứng 20 µL Chu trình khuếch đại bao gồm biến tính 95 °C phút; biến tính 95 °C 30 giây, gắn mồi 55 °C 30 giây, kéo dài 72 °C phút, lặp lại với 30 chu kỳ; cuối sản phẩm PCR hoàn thiện 72 °C 10 phút Sản phẩm PCR sau gắn A cách ủ với enzyme 1U Taq (Thermo Fisher Scientific) 10 phút 72 °C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8% Chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp nuôi cấy qua đêm môi trường LB lỏng (1% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men, 1% NaCl) 37 °C với tốc độ lắc 200 vịng·phút–1 Nồng độ sinh khối dịch ni cấy đo phương pháp quang phổ bước sóng 600 nm Sau đó, dịch ni cấy chuyển qua mơi trường LB lỏng với thể tích cho giá trị quang phổ bước sóng 600 nm đạt 0,1 tiến hành lắc với tốc độ 200 vòng·phút –1 37 °C (OD600~0,6–0,8) Nattokinase tái Kiểm tra biểu gen nattokinase Khả tiết nattokinase môi trường bên chủng B subtilis mang vector tái tổ hợp pHT43 gen nat05 kiểm tra thông qua so sánh vòng phân giải với chất skim milk tổ hợp cảm ứng với IPTG nồng độ mM tiếp tục nuôi cấy cảm ứng 6, 8, 10, 12 14 Sau cảm ứng, dịch môi trường chứa enzyme ngoại bào nattokinase thu nhận cách ly tâm 12,000 vòng·phút–1 10 phút Các khuẩn lạc đơn tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LB 37 °C qua đêm, lắc tốc độ °C Đối chứng B subtilis BD170 (chủng hoang dại) 200 vòng·phút–1 Pha lỗng dịch ni cấy với mơi trường LB đến OD600 = 0,15 nuôi đến OD600 đạt 0,7–0,8 Sinh tổng hợp nattokinase ngoại bào cảm ứng với isopropyl Tinh chế protein Dịch nuôi cấy B subtilis BD170 sau β-D-1- thu nhận tinh chế cách ly tâm 13.000 thiogalactopyranoside (IPTG) với nồng độ mM vòng·phút–1/15 phút °C kết tủa ủ 37 °C Thu mẫu sau hai nuôi cấy để acetone theo tỷ lệ mẫu/acetone 1:4, ủ tủ kiểm tra hoạt tính nattokinase Sau cảm ứng –20 °C từ đến Tiếp tục ly tâm lạnh 13.000 sinh tổng hợp nattokinase, chuẩn bị đĩa mơi trường vịng·phút–1/20 phút °C để loại bỏ dịch Cuối LB có bổ sung 1,5% agar 2% skim milk, tạo cùng, rửa qua kết tủa nước cất hòa lỗ bề mặt đĩa mơi trường với đường kính tan đệm phosphate 100 mM pH 7,5 mm Hút lấy 50 µL dịch ni cấy cho vào lỗ, ủ 37 °C qua đêm Vòng phân giải skim milk khuẩn lạc khác khảo sát DOI: 10.26459/hueunijns.v130i1A.5785 71 Nguyễn Thị Anh Thư CS Kiểm tra biểu phương pháp điện di SDSPAGE Chuẩn bị separating gel (4 mL dung dịch acrylamide 30%, 2,5 mL đệm separating gel 4x, 3,5 mL DW, 50 L 10% APS, L TEMED) stacking gel (1 mL dung dịch acrylamide 30%, 1,5 mL đệm stacking gel 4x, 3,5 mL DW, 30 L 10% APS, L TEMED) Mẫu protein bổ sung đệm mẫu SDS theo tỷ lệ mẫu/đệm mẫu 3:1 biến tính nhiệt 10 phút Mẫu tải vào giếng chạy hiệu điện 55 V 20 phút stacking gel 85 V trong1 50 phút separating gel Gel sau chạy xong, mẫu Nồng độ cảm ứng IPTG đến sinh tổng hợp nattokinase Cảm ứng sinh tổng hợp nattokinase Chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp nuôi cấy qua đêm môi trường LB lỏng (1% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men, 1% NaCl) 37 °C với tốc độ lắc 200 vịng·phút–1 Dịch ni cấy đo sinh khối phương pháp quang phổ bước sóng 600 nm Sau chuyển qua mơi trường LB lỏng với thể tích cho giá trị quang phổ bước sóng 600 nm đạt 0,1 tiến hành ni cấy lắc 200 vòng·phút–1 37 °C nhuộm dung dịch coomassie blue 30 (OD600~0,6–0,8) Nattokinase tái tổ hợp cảm phút rửa dung dịch rửa gel qua đêm ứng bình tam giác chứa 20 mL môi trường LB với nồng độ IPTG 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 4,0 mM Xác định hoạt độ protein tổng số Hoạt tính protease tổng số dịch nuôi cấy B subtilis BD170 tái tổ hợp mang gen nat05 thu nhận kiểm tra phương pháp quang phổ bước sóng 660 nm Một trăm micro lít thời gian 10 tốc độ lắc 180 vòng·phút Đối chứng B subtilis BD170 –1 (chủng hoang dại) Tinh chế protein dịch ni cấy ủ với 500 µL dung dịch casein Dịch nuôi cấy B subtilis BD170 sau 0,65% đệm 50 mM potassium phosphate, pH thu nhận tinh chế cách ly tâm 13.000 7,5 Phản ứng tiến hành 10 phút 37 vòng·phút–1/15 phút °C Dịch kết tủa °C Sau đó, phản ứng kết thúc cách bổ acetone theo tỷ lệ mẫu/acetone 1:4, ủ sung 500 µL dung dịch 110 mM trichloroacetic acid –20°C, (TCA) Loại bỏ kết tủa từ hỗn hợp phản ứng 13.000vòng·phút /20 phút °C để loại bỏ dịch ly tâm với tốc độ 13.000 vòng·phút–1/15 phút °C Cuối cùng, rửa kết tủa nước cất hịa Năm trăm micro lít dịch ủ với 1,25 mL tan đệm phosphate 100 mM pH 7,5 dung dịch Na2CO3 250 µL dung dịch Folin Ciocalteu's phenol N Sản phẩm trình thủy phân casein xác định quang phổ bước sóng 660 nm máy Evolution 60S UVVisible Spectrophotometer (Thermo Scientific, Mỹ) Hoạt độ protease xác định dựa vào đường chuẩn sử dụng chất tyrosine Một đơn vị hoạt độ protease xác định lượng enzyme cần thiết để thủy phân tạo thành µmol tyrosine phút điều kiện phản ứng 1–2 giờ, tiếp tục ly tâm lạnh –1 Kiểm tra biểu phương pháp điện di SDSPAGE Chuẩn bị separating gel (4 mL dung dịch acrylamide 30%, 2,5 mL đệm separating gel 4x, 3,5 mL DW, 50 L 10% APS, L TEMED) stacking gel (1 mL dung dịch acrylamide 30%, 1,5 mL đệm stacking gel 4x, 3,5 mL DW, 30 L 10% APS, L TEMED) Mẫu protein bổ sung đệm mẫu SDS theo tỷ lệ mẫu/đệm mẫu 3:1 biến tính nhiệt 10 phút Mẫu tải vào giếng chạy 55 V 20 phút stacking gel 85 V 50 phút separating gel 72 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 130, Số 1A, 69–75, 2021 Gel sau chạy xong, mẫu nhuộm dung dịch coomassie blue 30 phút rửa dung dịch rửa gel qua đêm Xác định hoạt độ protein tổng số Hoạt tính protease tổng số dịch nuôi cấy B subtilis BD170 tái tổ hợp mang gen nat05 thu nhận kiểm tra phương pháp quang phổ bước sóng 660 nm Một trăm micro lít dịch ni cấy ủ với 500 µL dung dịch casein 0,65% đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7,5 Phản ứng tiến hành 10 phút 37 °C Sau đó, phản ứng kết thúc cách bổ Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR Nat05 WT mẫu đối chứng; M maker 100 bp PCR Molecular Ruler (Bio-Rad); R1, R2, R3, R4, R5, R6 khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pHT43/nat05 sau biến nạp sung 500 µL dung dịch 110 mM trichloroacetic acid (TCA) Loại bỏ kết tủa ly tâm với tốc độ 13,000 vòng·phút–1/15 phút °C Năm trăm micro lít dịch ủ với 1,25 mL dung dịch Na2CO3 250 µL dung dịch Folin Ciocalteu's phenol N Sản phẩm trình thủy phân casein xác định quang phổ bước sóng 660 nm máy Evolution 60S UV-Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific, Mỹ) Hoạt độ protease xác định dựa vào đường chuẩn sử dụng chất tyrosine Một đơn vị hoạt độ protease xác định lượng enzyme cần thiết để thủy phân tạo thành µmol tyrosine phút điều kiện phản ứng Kết 3.1 Kiểm tra biểu nattokinase ngoại bào hệ thống vector pHT43 Kiểm tra biểu gen nattokinase Khả sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis chứa vector tái tổ hợp pHT43 mang gen nat05 kiểm tra cách quan sát vòng phân giải với chất skim milk Chủng B subtilis tái tổ hợp dòng R4 có vịng phân giải lớn (Hình 3), chứng tỏ dịng có khả sinh tổng hợp protease mạnh nhất, mạnh chủng NC chủng hoang dại nat05 Do đó, dịng R4 chọn để khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến biểu gen nat05 chủng B subtilis BD170 Kiểm tra có mặt vector pHT43 tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pHT43 mang gen nat05 sau tách chiết từ B subtilis BD170 kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Vector tái tổ hợp pHT43 mang gen nat05 biến nạp thành công vào B.subtilis BD170 tạo dòng R1, R2, R3, R4, R5, R6 (Hình 2) DOI: 10.26459/hueunijns.v130i1A.5785 Hình Hình ảnh vịng phân giải skim milk chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp chủng tự nhiên cảm ứng IPTG với nồng độ mM 73 Nguyễn Thị Anh Thư CS 3.2 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng đến sinh tổng hợp nattokinase pHT43/nat05 nồng độ IPTG khác Chủng B subtilis sau cảm ứng thời IPTG mM, vi khuẩn sinh nattokinase mạnh trình bày Bảng Kết cho thấy, nồng độ gian khác phân tích biểu phương pháp điện di SDS-PAGE (Hình 4) Sau 10 giờ, chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp biểu nattokinase (~37 kDa) mạnh (Hình 4) Chủng NC biểu nattokinase yếu chủng tái tổ hợp Kết phân tích hoạt độ protease tổng số chủng B subtilis BD170 mang vector tái tổ hợp pHT43/nat05 thời gian cảm ứng khác trình bày Bảng Kết cho thấy chủng B subtilis BD170 Hình Hình ảnh điện di khả biểu chủng B subtilis BD170 cảm ứng sau giờ, giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 M marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) mang vector tái tổ hợp pHT43/nat05 có hoạt độ nattokinase cao so với đối chứng Trong đó, thời điểm 10 giờ, vi khuẩn có hoạt độ nattokinase cao 3.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp nattokinase Chủng B subtilis BD170 sau cảm ứng nồng độ IPTG khác phân tích biểu phương pháp điện di SDS-PAGE (Hình 5) Kết phân tích hoạt độ protease tổng số chủng B subtilis BD170 mang vector tái tổ hợp Hình Hình ảnh điện di khả biểu chủng B.subtilis BD170 nồng độ IPTG: 0,5, 1, 2, mM M marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) Bảng Hoạt độ protease tổng số khảo sát thời gian khác (mM) Thời gian cảm ứng (giờ) Chủng 10 12 14 NC 0,0083 0,0115 0,0172 0,0054 0,0047 R4 0,0757 0,0917 0,1630 0,1432 0,1097 Bảng Hoạt độ protease tổng số khảo sát nồng độ IPTG khác (mM) Nồng độ IPTG (mM) Chủng R4 NC 74 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 0,0220 0,1198 0,1635 0,0947 0,1154 0,0159 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 130, Số 1A, 69–75, 2021 Kết luận Quá trình nghiên cứu tối ưu hóa thời gian cảm ứng nồng độ chất cảm ứng IPTG gen nat05 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 cho thấy, thời điểm 10 sau cảm ứng, chủng B subtilis BD170 biểu nattokinase mạnh mạnh chủng đối chứng Ở nồng độ IPTG mM, chủng B subtilis BD170 sinh nattokinase mạnh Thông tin tài trợ Nghiên cứu thực tài trợ đề tài Khoa học công nghệ cấp Đại học Huế, mã số DHH 2018-04-82 Tài liệu tham khảo Mỹ LTP Nghiên cứu khả sinh tổng hợp Nattokinase Bacillus subtilis phân lập từ thực phẩm chức natto [luận văn] Huế (VN): Đại học Khoa Học, Đại học Huế; 2015 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 enzym phân hủy huyết khối nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 2014;30(6S) Chen PT, Chiang C-J, Chao Y-P Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis Biotechnology Progress 2007;23(4):808-13 Liang X, Jia S, Sun Y, Chen M, Chen X, Zhong J, et al Secretory Expression of Nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli Molecular Biotechnology 2007;37(3):187-94 Liang X, Zhang L, Zhong J, Huan L Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis Applied Microbiology and Biotechnology 2007;75(1):95-101 Hương ĐT Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chiết enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto [luận văn] Hà Nội (VN): Trường đại học Dược Hà Nội; 2013 Nguyen TT, Quyen TD, Le HT Cloning and enhancing production of a detergent- and organicsolvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-genedeficient Bacillus subtilis WB800 Microbial Cell Factories 2013;12(1):79 Tuấn TQ, Ái LTT, Anh NQ, Trinh NT, Anh ĐTL, Hiệp ĐM, et al Tạo dòng biểu vượt mức DOI: 10.26459/hueunijns.v130i1A.5785 75 ... trình bày kết điều kiện biểu trình tách chiết sử dụng để kiểm tra tối ưu gen nat05 mã hóa nattokinase có mặt gen nat05 tái tổ hợp B subtilis Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp BD170 Kiểm tra có mặt... nghiên cứu tối ưu hóa thời gian cảm ứng nồng độ chất cảm ứng IPTG gen nat05 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 cho thấy, thời điểm 10 sau cảm ứng, chủng B subtilis BD170 biểu nattokinase mạnh... 3.1 Kiểm tra biểu nattokinase ngoại bào hệ thống vector pHT43 Kiểm tra biểu gen nattokinase Khả sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis chứa vector tái tổ hợp pHT43 mang gen nat05 kiểm tra