Cải thiện mức độ biểu hiện của gen NATC10 mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

Nattokinase, một serine protease có trong sản phẩm Natto truyền thống của Nhật Bản, có khả năng làm tan đặc hiệu các sợi fibrin gây đông máu, rất có ích trong việc phân hủy huyết khối nội sinh ở người. Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp để nâng cao mức độ biểu hiện của chủng Bacillus subtilis BD170 mang gen natC10 mã hóa nattokinase.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) CẢI THIỆN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN NATC10 MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG BACILLUS SUBTILIS BD170 TÁI TỔ HỢP Tô Tuyết Trinh1, Đặng Thị Thùy Trang1, Phạm Tăng Phong1, Đoàn Phước Minh Đức1, Nguyễn Thị Anh Thư1,2* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa Học, Đại học Huế Trường Đại học Y- Dược, Đại học Huế * Email: ntathu@huemed-univ.edu.vn Ngày nhận bài: 24/02/2021; ngày hoàn thành phản biện: 6/3/2021; ngày duyệt đăng: 02/11/2021 TÓM TẮT Nattokinase, serine protease có sản phẩm Natto truyền thống Nhật Bản, có khả làm tan đặc hiệu sợi fibrin gây đơng máu, có ích việc phân hủy huyết khối nội sinh người Nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp để nâng cao mức độ biểu chủng Bacillus subtilis BD170 mang gen natC10 mã hóa nattokinase Các điều kiện nuôi cấy để biểu gen tối ưu bao gồm mật độ tế bào thời điểm cảm ứng, tốc độ lắc, nhiệt độ cảm ứng, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng môi trường nuôi cấy Mức độ biểu cao gen natC10 xác định nồng độ IPTG 1,2 mM, 12 sau cảm ứng 39C , tốc độ lắc 200 vòng/phút với mật độ tế bào OD600 đạt giá trị 0,8 ni cấy mơi trường LB lỏng Từ khóa: Bacillus subtilis, nattokinase, natC10, biểu ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quỵ não bệnh lý mạch máu não nguy hiểm phổ biến nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ giới Nguyên nhân cục máu đơng chặn lưu lượng máu đến tế bào não gây bệnh đột quỵ, bệnh nguy hiểm, khó cấp cứu chữa trị, khả hồi phục sức khỏe ban đầu khó, đa số bệnh nhân đột quỵ gặp phải di chứng nặng nề, ảnh hưởng đến sống sinh hoạt người bệnh, tốn chi phí điều trị gia đình xã hội Phân giải fibrin đóng vai trị quan trọng liệu pháp điều trị bệnh tắc mạch máu Do chất fibrin protein, fibrin bị phân hủy enzyme protease Các protease thường sử dụng điều trị gồm có nattokinase, urokinase, streptokinase plasmin Urokinase plasmin diện thể người tích lũy 109 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp plasmin gây tượng xuất huyết Streptokinase có nguồn gốc từ vi sinh vật, có giá thành sản xuất rẻ nhiên gây đáp ứng miễn dịch đưa vào thể gây hiệu ứng không mong muốn xuất huyết trong, dị ứng Hiện nay, nattokinase liệu pháp sử dụng để chống lại bệnh máu đông [4], [5] Nattokinase enzyme thủy phân fibrin mạnh tạo trình lên men cách bổ sung Bacillus natto Hiện nay, có nghiên cứu tạo nattokinase tái tổ hợp bước đầu cho thấy hiệu cao enzyme tái tổ hợp biểu có hoạt tính cao enzyme ngoại bào [1], [2], [3] Sumi cs (1987) [6] lần phát nattokinase, serine protease, có sản phẩm Natto truyền thống Nhật Bản So sánh khả làm tan huyết tụ với dược phẩm thơng thường khác, nattokinase có nhiều ưu điểm tính an toàn, hiệu chứng minh lâm sàng, hoạt tính cao tồn nội mạc thời gian dài liều uống nên hiệu điều trị bệnh máu đơng trì Hơn nữa, nattokinase hỗ trợ tăng cường sản sinh plasmin (enzyme thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc) Nattokinase thực có hiệu cao loại làm tan huyết tụ thông thường khác urokinase, streptokinase tissue plasminogen activator (t-PA) Hiện nay, nhu cầu sử dụng nattokinase ngày tăng nhiều lợi ích mà mang lại Việc tìm hiểu tối ưu điều kiện biểu nattokinase tái tổ hợp từ chủng B subtilis thực cần thiết để tạo nguồn cung cấp nattokinase rẻ với hoạt tính cao Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết điều kiện biểu tối ưu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp quy mơ phịng thí nghiệm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BD170 mang vector pHT43 có chứa gen natC10 mã hố nattokinase (pHT43/natC10) Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn Chủng B subtilis BD170 mang vector pHT43/natC10 nuôi cấy qua đêm ml môi trường LB lỏng (1% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men, 1% NaCl) có bổ sung kháng sinh 50µg/ml chloramphenicol 37oC với tốc độ lắc 200 vịng/phút Quy trình cảm ứng sinh tổng hợp nattokinase tiến hành khuyến cáo nhà sản xuất (Mobitec, Germany) Sau 12 đến 14 giờ, 2,5ml dịch tế bào ni cấy qua đêm 110 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) cấy vào bình 250ml có chứa 50ml mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Tế bào nuôi cấy 37oC, 220 vòng/phút mật độ tế bào OD600 đạt giá trị tối ưu Mật độ tế bào thời điểm cảm ứng (OD600) thử nghiệm khoảng từ 0,4 đến 1,0 Ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn đến biểu gen đánh giá máy ni cấy có tốc độ lắc từ 160 vòng/phút đến 220 vòng/phút Nhiệt độ cảm ứng khảo sát từ 33oC đến 39oC Thời gian ứng khảo sát giá trị khác từ đến 14 Sự cảm ứng gen natC10 thực cách bổ sung Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG) nồng độ khác từ 0,6mM đến 1,4mM Môi trường nuôi cấy khảo sát loại môi trường LB lỏng YPD lỏng (2% D-glucose, 2% peptone 1% dịch chiết nấm men) Đối chứng B subtilis BD170 dạng chủng hoang dại Kết tối ưu điều kiện khảo sát trước sử dụng cho thí nghiệm sau 2.2.2 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide Dịch ni cấy B subtilis BD170 có vector pHT43/natC10 ly tâm lạnh 13000 vòng/phút 10 phút 4oC, thu dịch kết tủa nattokinase acetone theo tỷ lệ mẫu : acetone, tiếp tục ly tâm lạnh 13000 vòng/phút 20 phút 4oC, loại bỏ dịch kết tủa hòa tan đệm PBS pH 7,5 (phosphate- buffered saline) Mẫu sau điện di SDS-PAGE 12% (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) để đánh giá mức độ biểu gen natC10 Sau điện di xong, gel nhuộm Coomassie Brilliant Blue để quan sát băng protein KẾT QUẢ 3.1 Ảnh hưởng mật độ tế bào Nhiều nghiên cứu chứng minh thời điểm cảm ứng ni cấy tế bào có ảnh hưởng đáng kể đến tổng hợp hoạt động protein tái tổ hợp Vì vậy, cần phải tối ưu hóa mật độ tế bào để biểu protein cao trước bổ sung chất cảm ứng Chúng nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tế bào giá trị khác OD600 (0,4;0,6;0,8;1,0) Sau đó, dịch ni bổ sung 1mM IPTG, nuôi cấyở 37oC máy lắc với tốc độ lắc 180 vòng/phút Sự biểu gen natC10 mong đợi để tạo protein khoảng 37,5 kDa (Hình 1) 111 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng cỡ mẫu lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1-4: mẫu đối chứng ni cấy khơng có cảm ứng IPTG tương ứng với cỡ mẫu có OD600 từ 0,41,0 (gia số 0,2) 5-8: mẫu TC3 ni cấy có cảm ứng IPTG tương ứng với cỡ mẫu có OD600 từ 0,4-1,0 (gia số 0,2) Kết điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp biểu cao giá trị OD600 từ 0,6 đến 0,8 So sánh cường độ băng protein cho thấy OD600 đạt 0,8 thích hợp cho biểu cao gen natC10 Chủng NC (negative control) biểu nattokinase yếu chủng B subtilis tái tổ hợp 3.2 Ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn Để đánh giá ảnh hưởng tốc độ lắc đến sản xuất protein, mật độ tế bào OD600 đạt 0,8, thử nghiệm tốc độ lắc khác (160 vịng/phút, 180 vịng/phút, 200 vịng/phút, 220 vịng/phút) có bổ sung 1mM IPTG thực 37oC Kết thể hình 112 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) Hình Ảnh hưởng tốc độ lắc lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 dòng TC3 M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1-4: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng IPTG tương ứng với tốc độ lắc 160 vòng/phút, 180 vòng/phút, 200 vòng/phút, 220 vòng/phút 5-8: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG tương ứng với tốc độ lắc 160 vòng/phút, 180 vòng/phút, 200 vòng/phút, 220 vịng/phút Từ hình ảnh điện di SDS-PAGE hình cho thấy kích thước băng protein tăng dần từ 160 vòng/phút đến 200 vòng/phút, băng protein lớn giá trị 200 vịng/phút, sau giảm dần Chủng NC biểu nattokinase yếu chủng B subtilis tái tổ hợp Do đó, chúng tơi chọn tốc độ lắc tối ưu 200 vòng/phút cho lần khảo sát 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng Đối với ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng đến sản xuất protein, giá trị nhiệt độ khác nghiên cứu từ 33oC đến 39oC Khi mật độ tế bào OD600 đạt 0,8, mẫu dịch nuôi cấy cảm ứng 33oC,35oC,37oC,39oC với tốc độ lắc 200 vịng/phút có bổ sung 1mM IPTG Kết trình bày hình 113 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 dòng TC3 M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1-4: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng IPTG tương ứng với nhiệt độ 33oC, 35oC, 37oC, 39oC 5-8: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG tương ứng với nhiệt độ 33oC, 35oC, 37oC, 39oC Dựa vào kết hình cho thấy kích thước băng protein tăng dần từ 33oC đến 39oC, băng protein lớn giá trị 39oC Chủng NC biểu nattokinase yếu chủng B subtilis tái tổ hợp Vì vậy, mẫu có nhiệt độ 39oC cho mức biểu gen natC10 mã hóa enzyme nattokinase TC3 mạnh 3.4 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng Các thời gian cảm ứng khác (8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ) sử dụng để khảo sát ảnh hưởng chúng biểu gen natC10 cách sử dụng IPTG 1mM 39oC tốc độ lắc 200 vòng/phút Kết điện di SDS-PAGE gen natC10 biểu protein cao sau 12 (hình 4) 114 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) Hình Ảnh hưởng thời gian cảm ứng lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 dòng TC3 M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1-4: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng IPTG tương ứng với thời gian giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ.5-8: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG tương ứng với thời gian cảm ứng giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu gen natC10 thực 39oC, 200 vòng/phút 12 Nồng độ IPTG sử dụng 0,6mM; 0,8mM; 1mM; 1,2mM; 1,4mM Kết thể hình 115 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu gen natC10 mã hóa enzyme nattokinase Bacillus subtilis BD170 dòng TC3.M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng IPTG 2-6: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG với nồng độ 0,6mM; 0,8mM; 1mM; 1,2mM; 1,4mM Từ hình ảnh điện di SDS-PAGE hình cho thấy kích thước băng protein tăng dần từ nồng độ IPTG 0,6mM đến 1,2mM, băng protein lớn nồng độ IPTG 1,2mM Chủng NC biểu nattokinase yếu chủng B subtilis tái tổ hợp Vì vậy, mẫu có nồng độ IPTG 1,2mM cho mức biểu gen natC10 mã hóa enzyme nattokinase TC3 mạnh 3.6 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Để đánh giá ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sản xuất protein, nghiên cứu thực môi trường khác LB lỏng YPD lỏng mật độ tế bào OD600 đạt 0,8 có bổ sung 1mM IPTG tốc độ lắc 200 vòng/phút, 37oC Kết thể hình Hình Ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 dòng TC3 M: marker Page RulerTM Prestained Protein Ladder (hãng Thermo Fisher Scientific) 1: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng ni mơi trường LB lỏng 2: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG nuôi môi trường LB lỏng 3: mẫu đối chứng khơng có cảm ứng ni mơi trường YPD lỏng 4: mẫu TC3 có cảm ứng IPTG ni môi trường YPD lỏng Dựa vào kết hình ta thấy kích thước băng protein ni cấy môi trường LB lỏng lớn Trong kích thước băng protein mẫu ni cấy môi trường YPD mờ Chủng NC biểu nattokinase yếu chủng B subtilis tái tổ hợp Vì vậy, mơi trường LB lỏng mơi trường thích hợp cho biểu 116 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) gen natC10 mã hóa enzyme nattokinase TC3 Ngược lại, môi trường YPD không phù hợp cho thí nghiệm KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu chúng tơi tối ưu hóa điều kiện cho biểu gen natC10, bao gồm mật độ tế bào OD600 0,8, nhiệt độ cảm ứng 39C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, nồng độ IPTG 1,2mM, thời gian nuôi cấy 12 sau cảm ứng môi trường nuôi cấy môi trường LB Những kết áp dụng để cải thiện sinh tổng hợp enzyme nattokinase nghiên cứu tinh protein TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chen PT, Chiang CJ, Chao YP (2007) Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis, Biotechnology progres,vol 23, pp 808-813 [2] Liang X, Zhang L, Zhong J, Huan L (2007) Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis, Applied microbiology and biotechnology, vol 75, pp 95-101 [3] Liu J, Xing J, Chang T, Ma Z, Liu H (2005) Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods, Process Biochemistry, vol 40(8), pp 2757–2762 [4] Peng Y, Yang X, Zhang Y Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo Applied microbiology and biotechnology 2005;69:126-32 [5] Selvarajan E, Bhatnagar N Nattokinase: an updated critical review on challenges and perspectives Cardiovascular & hematological agents in medicinal chemistry 2017 [6] Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H (1987) A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet, Experientia, vol 43(10), pp 1110-1111 117 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp ENHANCEMENT OF EXPRESSION OF NATC10 GENE ENCODING NATTOKINASE IN RECOMBINANT BACILLUS SUBTILIS BD170 To Tuyet Trinh1, Dang Thi Thuy Trang1, Pham Tang Phong1, Doan Phuoc Minh Duc1, Nguyen Thi Anh Thu1,2* Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University University of Medicine and Pharmacy, Hue University * Email: ntathu@huemed-univ.edu.vn ABSTRACT This study aims to investigate the appropriate culture conditions for enhancing expression level of natC10 gene encoding nattokinase in recombinant Bacillus subtilis BD170 Nattokinase is a serine protease found in traditional Japanese Natto product, has the ability to specifically dissolve fibrin fibers causing coagulation, useful in endogenous thrombolysis Currently, nattokinase is produced by traditional fermentation as well as recombinant DNA technology approaches The culture conditions for gene expression were optimized including cell density at the time of induction, shaking speed, induction temperature, induction time, inducer concentration and culture medium Highest level for natC10 was determined at IPTG concentration of 1.2 mM, 12 hours after induction at 39oC, shaking speed of 200 rpm with cell density at OD600 reached a value of 0.8 and suitable culture medium is LB Keywords: Bacillus subtilis, expression, nattokinase, natC10 Nguyễn Thị Anh Thư sinh ngày 25/02/1985 Thừa Thiên Huế Năm 2008, bà tốt nghiệp cử nhân Sinh học trường ĐH Khoa học, ĐH Huế Năm 2010, bà nhận thạc sĩ Sinh học thực nghiệm trường ĐH Khoa học, ĐH Huế Hiện bà NCS chuyên ngành Công nghệ sinh học trường ĐH Khoa học, ĐH Huế, công tác Khoa Cơ bản, trường ĐH Y Dược, ĐH Huế Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ sinh học, Sinh lý người động vật 118 ... 115 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu gen natC10 mã hóa enzyme nattokinase Bacillus subtilis BD170 dịng... trình bày hình 113 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng lên biểu gen natC10 Bacillus subtilis BD170 dòng TC3 M: marker... với tốc độ lắc 180 vòng/phút Sự biểu gen natC10 mong đợi để tạo protein khoảng 37,5 kDa (Hình 1) 111 Cải thiện mức độ biểu gen natC10 mã hóa nattokinase Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp Hình