BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETAGALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21" ppt

Trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp, -galactosidaza đóng vai trò dấu chuẩn trong quá trình tách và chọn dòng phân tử nhờ hiện tượng bất hoạt enzym trên các vectơ có chèn gen tái tổ hợp... Ngh

BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ

BETA-GALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ATCC 11105 TRONG E COLI BL21

Trần Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Lịch, Trương Nam Hải

Viện công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG

Ngô Tiến Hiển

Viện Công nghiệp thực phẩm

ĐẶT VẤN ĐỀ

-Galactosidaza (-D-galactosidase galactohydrolase,

EC3.2.1.32) xúc tác quá trình thuỷ phân galactosyl ở vị trí tận cùng của hydratcacbon, glycoprotein và galactolipit [1]

-Galactosidaza thuỷ phân cơ chất từ đầu không khử, tại vị trí -D-galactosyl tận cùng của -D-galactosizit [2, 3] để chuyển hóa lactoza thành galactoza và glucoza [3, 4] -Galactosidaza có mặt phổ biến trong giới động vật, thực vật, nấm và vi sinh vật Ở vi khuẩn, cấu trúc và khối lượng

phân tử của -galactosidaza rất khác nhau Enzym này có thể tồn tại dưới dạng một tiểu phần như -galactosidaza của

Thermus sp.A4 (khối lượng phân tử 75 kDa), và dạng nhiều tiểu phần như -galactosidaza của T aquaticus (khối lượng phân tử lớn hơn 700 kDa) -galactosidaza của E coli tồn

tại dưới dạng một protein gồm 4 tiểu phần giống nhau,

chức năng hoạt động của mỗi tiểu phần độc lập với nhau và

có khối lượng phân tử là 116,353 kDa [2]

-Galactosidaza được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm, -

galactosidaza được bổ sung vào quá trình lên men từ bơ sữa như kem, sữa chua để tránh sự kết tinh lactoza Trong quy trình sản xuất sữa, -galactosidaza được bổ sung để thuỷ phân lactoza, làm tăng độ ngọt của sữa [1, 4] Trong ngành

y học, -galactosidaza được điều chế làm thuốc trợ tiêu hoá [4] Trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp, -galactosidaza đóng vai trò dấu chuẩn trong quá trình tách và chọn dòng phân tử nhờ hiện tượng bất hoạt enzym trên các vectơ có chèn gen tái tổ hợp

Trong bài báo này, chúng tôi sẽ trình bày các phương pháp

đã tiến hành để tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng

tổng hợp -galactosidaza cao Gen lacZ từ chủng E coli

ATCC 11105 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR và đưa vào

vectơ biểu hiện pET-22b(+) để tạo vectơ pET-22bLacZ Sau đó vectơ này được biến nạp vào chủng biểu hiện E coli BL21 để tổng hợp -galactosidaza

I NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

I.1 Nguyên liệu

- Plasmit pET-22b(+) (5493bp) do hãng Novagen cung cấp

được sử dụng làm vectơ biểu hiện gen LacZ Cặp mồi dùng

nhân gen LacZ do hãng GENSET Singapore Biotech.Pte Ltd tổng hợp Enzym hạn chế sử dụng của hãng Bio-Lab Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu của hãng Sigma (Mỹ), Prolabo (Pháp), BDH (Đức), Meck (Đức), Fluka (Đức)

- Các thiết bị máy móc cần thiết cho nghiên cứu chuyển

gen của các hãng Perkin Elmer (Mỹ), Eppendorf (Đức), Binder (Đức), Infors (Thuỵ Sỹ), Toledo (Thuỵ Sỹ),

Phamacia (Thuỵ Điển), Bio Rad (Mỹ), Sovall (Mỹ), MJ – Research (Mỹ)

biểu hiện dòng gen

I.3 Nhân gen LacZ mã hoá -galactosidaza bằng kỹ

thuật PCR

Dựa vào trình tự gen LacZ của E coli trong ngân hàng gen quốc tế (gi:7428187), cặp mồi LacZF1-Nco I và LacZR2- Xho I được thiết để dùng cho PCR (hãng GENSET

Singapore Biotech.Pte Ltd tổng hợp) PCR được tiến hành

như sau: Biến tính ADN ở 940C trong 3 phút; nhân ADN bằng 25 chu trình nhiệt với các bước sau: 940C trong 1 phút, 550C 1 phút, 720C trong 1 phút 30 giây Phản ứng nhân ADN kết thúc ở 720C trong 8 phút ADN được giữ ở

40C sau khi kết thúc PCR

I.4 Đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+)

Để đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+) tại vị trí Nco I và Xho I trong vùng đa nối, sản phẩm PCR và vectơ pET-

22b(+) được xử lý bằng hai enzym hạn chế Nco I và Xho I Đoạn gen LacZ và plasmit sau khi xử lý có kích thước

tương ứng ~ 3 kb và ~ 5,4 kb, được nối lại với nhau bằng ADN ligaza Sản phẩm phản ứng nối ghép được biến nạp

vào tế bào E coli BL 21

I.5 Điều kiện môi trường cảm ứng

Cấy chuyển từ khuẩn lạc đơn, dòng tế bào E coli BL 21 mang vectơ biểu hiện pET-22bLacZ sang 5 ml môi trường

lỏng LB + Amp, nuôi lắc 370C qua đêm đến pha ổn định

Từ dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển 1ml sang bình 500

ml chứa 100 ml LB lỏng + Amp, nuôi lắc 370C, sau 2 giờ (OD600nm = 0.6), môi trường được bổ sung chất cảm ứng IPTG (nồng độ cuối cùng 1mM) và tiếp tục nuôi lắc 200 v/phút ở nhiệt độ 200C Tế bào được thu sau 12 giờ cảm ứng

I.6 Tinh sạch -galactosidaza

Chuẩn bị cột 1.5x15 cm Chuyển 4 ml dịch Talon Resin lên cột Cân bằng cột bằng đệm: 50 mM sodium phosphat; 300

mM NaCl, pH 7,4 Tinh chế mẫu qua cột ái lực: ly tâm thu

tế bào sau cảm ứng ở điều kiện 5000 v/phút trong 10 phút ở

40C Hoà tế bào E coli trong 10 ml đệm Tris 10 mM pH 8;

0,2 phenylmethylsulphonyl fluoride Tế bào được phá bằng lyzozyme khi ủ ở 300C, 60 phút Dịch sau khi phá được li tâm ở 13.000 v/phút trong 10 phút Enzym từ dịch nổi được tinh chế nhờ cột ái lực chứa các hạt sepharose gắn Co2+ Sau khi qua cột các protein không có đuôi Histidin sẽ bị rửa trôi bằng đệm photphat pH 7,4 còn -galactosidaza tái tổ hợp có gắn thêm 6 axit amin Histidin được giữ lại trên cột

và được tách ra khỏi cột bằng đệm chiết: 50 mM sodium acetat, 300 mM NaCl, pH 5,0 [5] Quá trình tinh sạch

protein được tiến hành ở 40C

I.7 Định lượng protein

Protein được định lượng bằng phương pháp Bradfrod

Đường chuẩn được xây dựng từ các nồng độ BSA khác nhau ( 2,5g, 5g, 7,5g, 10g, 12,5g, 15g, 17,5g, 20g) Dựa vào đường chuẩn BSA ta có thể định lượng được hàm lượng -galactosidaza [6]

I.8 Nghiên cứu hoạt tính riêng của -galactosidaza

Hoạt tính -galactosidaza được xác định bằng cách cho enzym phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl--D-galactose (ONPG) Dưới tác dụng của enzym ONPG sẽ thủy phân thành galactoza và o-nitrophenol o-Nitrophenil khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng

và hấp thụ ở bước sóng 420nm Từ đây, ta có thể xác định

được hoạt độ enzym khi đo hỗn hợp phản ứng giữa

galactosidaza và ONPG Một đơn vị hoạt tính (U)

-galactosidaza là lượng enzym cần thiết để giải phóng

1mol o-nitrophenil trong 1 phút ở 300C theo điều kiện thí nghiệm

I.9 Động học enzym

Phân tích động học của -galactosidaza được thực hiện với các nồng độ cơ chất khác nhau: 0,02 mg, 0,04 mg, 0,06mg, 0,08 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3mg, 0,4mg, 0,5 mg với lượng enzym cho phản ứng là 300 ng Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 1ml hỗn hợp, phản ứng diễn ra ở 300C trong 5 phút Dừng phản ứng bằng 0,5 ml Na2CO3 và OD được đo ở

bước sóng 420 nm Kết quả được xử lý bằng chương trình toán học trên máy tính Từ đó, các thông số động học của enzym Km và kcat được xác định [7]

II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Nhân gen LacZ bằng PCR

Trong kỹ thuật PCR, hai đoạn mồi được chọn nhằm giới hạn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên Theo dự định,

đoạn gen LacZ mã hoá cho -galactosidaza tái tổ hợp sẽ sử dụng tín hiệu tiết pelB đã được thiết kế sẵn trong pET-

22b(+) Đoạn mồi xuôi (đầu 5’) có chiều dài 25 nucleotit

mang điểm cắt nhân tạo của enzym hạn chế Nco I Đoạn

mồi ngược chiều (đầu 3’) có chiều dài 27 nucleotit mang

điểm cắt nhân tạo của enzym hạn chế Xho I

- Trình tự nucleotit đoạn mồi xuôi: LacZF1-Nco I: 5’–

GCCATGGTGACCATGATTACGGATT- 3’

- Trình tự nucleotit đoạn mồi ngược: LacZR2-Xho I: 5’–

CCGCTCGAGTTTTTGACACCAGACCAA- 3’

Đoạn gen LacZ được nhân lên bằng PCR với hai cặp mồi

được thiết kế như ở trên Dự tính đoạn gen nhân lên có chiều dài khoảng 3000 bp Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Ảnh 1)

Ảnh 1: Kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gien LacZ trên

gel agarose 0,8%

Đường chạy số 1: thang ADN chuẩn

Đường chạy số 2: sản phẩm PCR

Trên gel điện di, sản phẩm PCR là một băng đặc hiệu,

tương ứng với trọng lượng phân tử khoảng 3000 bp như theo dự tính Như vậy trình tự cặp mồi như đã thiết kế và điều kiện chạy PCR là phù hợp để nhân đoạn gen LacZ mã

hoá cho -galactosidaza của chủng E coli ATCC

11105

2 Đưa gen LacZ vào vectơ biểu hiện pET22b(+)

Vectơ pET được Studier và cộng sự thiết kế dựa trên hệ điều khiển promotơ mạnh có nguồn gốc từ phage T7 Hiện nay, có hơn 42 dạng vectơ pET được sử dụng cho biểu hiện trong 15 vật chủ khác nhau Vectơ pET-22b(+) có chiều dài

5493 bp , được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện

gen tái tổ hợp trong E coli pET-22b(+) mang gen lac I mã

hoá cho protein repressơ, can thiệp vào quá trình điều hoà hoạt động của promotơ trên vectơ và được cảm ứng bằng

cơ chất tổng hợp IPTG Gen pelB mã hoá cho peptit tín

hiệu dẫn của các protein tiết tái tổ hợp ra bên ngoài màng tế

bào [Cat No 69744-3] Vectơ biểu hiện pET-22bLacZ

được thiết kế theo sơ đồ 1

Sơ đồ 1: Thiết kế vectơ biểu hiện pET-22bLacZ mang gien

mã hoá cho -galactosidaza của chủng vi khuẩn E coli

ATCC 11105

Đoạn gen LacZ được nhân lên bằng PCR của chủng E coli

ATCC 11105, mục đích đoạn gen này đưa vào vectơ

pET-22b(+) tại hai điểm cắt Nco I và Xho I ở trong vùng đa nối

Để đưa đoạn LacZ vào vectơ thì sản phẩm PCR và ADN plasmit phải được cắt triệt để bằng hai enzym hạn chế Nco

I và Xho I Đoạn gen lacZ và plasmit sau khi cắt được nối

với nhau bằng ADN-ligaza Sản phẩm nối ghép được biến

nạp vào E coli BL21 bằng phương pháp xung điện Sau khi

chọn lọc và kiểm tra các thể biến nạp chúng tôi đã chọn được thể tái tổ hợp mang hệ gen mã hoá -galactosidaza

được đặt tên pET-22bLacZ

3 Biểu hiện gen LacZ mã hoá -galactosidaza trong

chủng tái tổ hợp E coli BL21 trên môi trường thạch đĩa

Khi trong môi trường nuôi cấy có mặt chất cảm ứng IPTG, lập tức phân tử IPTG liên kết ái lực với protein repressơ, làm thay đổi cấu trúc không gian của protein này Vùng promotơ trên vectơ được giải phóng và được T7 ARN

polymeraza nhận biết Lúc này hệ pET-22bLacZ trong E coli BL21 chuyển sang quá trình phiên mã và dịch mã Để định tính sự biểu hiện -galactosidaza trong E coli BL21,

chọn hai dòng tế bào cấy vạch lên môi trường thạch LB +

Amp + IPTG + X-gal: một dòng tế bào E coli BL21 mang

hệ pET-22bLacZ và một dòng tế bào đối chứng E coli

BL21 mang pET-22b(+) không mang gen LacZ Đĩa sau

khi cấy được ủ ở 300C qua đêm (ảnh 2)

Ảnh 2: kiểm tra hệ biểu hiện pET-22bLacZ trong E coli

BL21 trên môi trường thạch đĩa LB chứa IPTG và X-Gal

* Số 1: vạch khuẩn lạc mầu xanh đậm là dòng tế bào E coli BL21 chứa vectơ biểu hiện pET-22bLacZ

* Số 2: vạch khuẩn lạc mầu trắng đục là dòng tế bào E coli

BL21 chứa vector pET-22b(+)

Kết quả là trên đĩa có một vạch khuẩn lạc mầu xanh và một vạch khuẩn lạc mầu trắng Vạch khuẩn lạc mầu xanh đậm (do -galactosidaza thuỷ phân X-gal tạo màu xanh) là

những tế bào chứa vectơ pET-22bLacZ đã được biểu hiện

Vậy -galactosidaza tái tổ hợp đã được biểu hiện trên môi trường thạch đĩa LB + Amp + IPTG + X-gal

4 Tinh sạch -galactosidaza bằng cột sắc kí ái lực

* Kiểm tra lượng -galactosidaza ở dạng tan

-galactosidaza tái tổ hợp biểu hiện trong E coli được tổng

hợp lượng khá lớn khi có mặt chất cảm ứng mạnh IPTG Quá trình tổng hợp -galactosidaza tái tổ hợp quá mạnh nên dễ dẫn tới hiện tượng lỗi trong quá trình hình thành cấu trúc hoạt động của enzym Các protein bị lỗi thường tồn tại

ở dạng không tan, thể vùi và không có hoạt tính Khi cảm ứng cho biểu hiện ở 370C -galactosidaza hầu như tồn tại dưới dạng không tan Để khắc phục hiện tượng này, cần phải thay đổi một số điều kiện khi cảm ứng sao cho tế bào tổng hợp -galactosidaza chậm hơn Khi nuôi cảm ứng ở nhiệt độ thấp hơn: 300C, 250C, 200C thì enzym được tổng hợp dưới dạng tan nhiều hơn, như ở 200C có khoảng 30-40% sau tổng hợp ở dưới dạng tan

* Tinh sạch -galactosidaza

Trong vectơ biểu hiện pET-22b(+) đã được thiết kế sẵn một đoạn Histidin về phía đầu 3’ đoạn gen cấu trúc khi chèn vào vùng đa nối trên vectơ Nhờ vậy khi tổng hợp, enzym được gắn thêm đuôi Histidin và chính đuôi Histidin này có

ái lực đặc hiệu với cột ái lực Resin giúp tinh sạch enzym galactosidaza tái tổ hợp dễ dàng Sản phẩm -galactosidaza sau khi tinh sạch được kiểm tra trên gel SDS -

-popyacrylamit 12 % (ảnh 4)

Ảnh 4: Kiểm tra sản phẩm sau tinh sạch trên gel điện di

SDS - polyacrylamid 12%

Đ/ C 1: Protein của dịch chiết thô trước khi cho lên cột

Đ/ C 2: Protein không đặc hiệu khi cho qua cột ái lực

Đ/C 3: mẫu protein lên cột sau khi rửa 10 lần thể tích cột bằng đệm photphat

Đ/C 4: -galactosidaza được tách ra khỏi cột

Đ/C 5: Thang protein chuẩn

Ảnh trên cho thấy, -galactosidaza được thu lại dưới dạng tinh sạch, trọng lượng khoảng 116 kDa

4 Xác định hoạt tính -galactosidaza bằng cơ chất

ONPG

Hàm lượng -galactosidaza được tính theo phương pháp Bradford là 0,05 mg/ml Hoạt tính riêng -galactosidaza được xác định khi cho phản ứng thuỷ phân cơ chất tổng hợp ONPG (o-nitrophenyl -D- galactopyranoside) Phản ứng enzym được tiến hành với các nồng độ cơ chất ONPG khác nhau, phản ứng được ủ ở 300C trong 5 phút Khi hỗn hợp phản ứng chuyển sang mầu vàng thì dừng phản ứng bằng 0,5 ml Na2CO3 1M Hoạt tính enzym được xác định bằng cách đo độ hấp phụ của hỗn hợp sau phản ứng ở OD

420 nm Từ đó các thông số Km, kcat được xác định như trong bảng dưới đây

Như trong bảng đơn vị hoạt tính của enzym 157,6 U/mg

Với giá trị Km = 0,664 mM ái lực giữa -galactosidaza và

cơ chất tổng hợp ONPG tương đối mạnh trong điều kiện

phản ứng thừa cơ chất Giá trị kcat = 86467 là hiệu lực của

enzym, số vòng quay của một phân tử enzym với các phân

tử cơ chất Ta thấy tốc độ phản ứng xảy khá nhanh trong

một giây một phân tử enzym có khả năng thuỷ phân 86467

phân tử cơ chất

III KẾT LUẬN

- Chúng tôi đã tạo thành công được chủng biểu hiện vi

khuẩn E coli BL21tái tổ hợp mang hệ biểu hiện

pET-22bLacZ chứa gen LacZ mã hóa cho -galactosidaza của

chủng E coli ATCC 11105 có khả năng tổng hợp cao

-galactosidaza

- Đã xác định được đơn vị hoạt tính và các giá trị động học

Km , kcat của -galactosidaza tái tổ hợp

Lời cảm ơn

Công trình được thực hiện theo hợp đồng của đề tài KC –

04 – 07 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm”

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Obon J M., Castellar M R., Iborra J L., Manjon A.,

2000, “-Galactosidase immobilization for milk lactose hydrolysis: a simple experimental and modeling study of batch and continuous reactors”, Biochemical Education, 28, 164-68

2 Leahy M., Vaughan P., Fanning L., Fanning S.,

Sheehan D., 2001, “Purification and some characteristics of

a recombinant dimeric Rhizobium meliloti -galactosidase expressed in Escherichia coli”, Enzyme and Microbial

technology, 28, 682-688

3 Smith D L, Gross K C., 2000, “A Faminly of at Least

Seven -galactosidase Genes is Expressed during Tomato Fruit Development”, Plant Physiology, 123, 1173-1183

4 Kim C., Chung H., Lee M., Choi L., Kim M., 1999,

“Development of dried liposomes containing

-galactosidase for the digestion of lactose in milk”,

International Journal of Pharmaceutics, 183, 185-193

5 “Talon Metal Affinity Resins User Manual PT1320 (PR16704)”, 2001, Clontech, 1-39

6 Daniel M Bollag., Michael D Rozcki.,Stuartj E delstein., 1996 Protein method, p 63-67

7 Christopher K Mathews., K.E Van Holde , 1993, Biochemistry,p 360-406

SUMMARY

Overexpression of LacZ encoding -galactosidase from

E coli ATCC11105 in E coli BL21

Tran Minh Tri, Nguyen Thi Thanh Lich, Truong Nam Hai