BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR" ppsx

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQG Tp HCM Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II TỔNG QUAN Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV (Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếu ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnh sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quan sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất. Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú. Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồng thời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình. Quy trình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Mẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV do Viện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp. Các mẫu này được bảo quản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -20 0 C. Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm được nghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate, phenol pH8, glycerol, sodium acetate). 200 l dịch nghiền được ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol. Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol. Sau ly tâm, cặn được làm khô và hòa lại trong 50 l H 2 O đã xử lý DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng các phần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồi dùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ gen YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạn mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3', YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi 5'- GTCTCACACACATGGACTTC-3'. đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp và cung cấp. Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR. Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT- PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở 42 0 C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi và nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 95 0 C-3'; 15 chu kỳ 94 0 C-30", 62 0 C-30", 72 0 C-30"; 36 chu kỳ 94 0 C-30", 48 0 C-30", 72 0 C-30"; 72 0 C-6'. Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điện di và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (Hybond N+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tự đoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP. Bộ kit DIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) được sử dụng để phát hiện các phân tử lai. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Kết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng: Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng để nhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị trí bắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1). Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ ARN hệ gen YHV Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồi thiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trên ARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp với dịch chiết tôm. Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuật PCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhân bản đoạn ADN có kích thước 303 bp, (2) PCRII nhân bản đoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI. Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCRI và II từ RNA YHV. 1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp); 3 : Thang X 174 Hae-III; 4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp). Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm 1 : Thang 186 bp 2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch chiết tôm Các kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được có cường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thời không thấy sản phẩm ký sinh. Phản ứng tiến hành trên dịch chiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dương tính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARN trong mẫu. Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trình PCR hoạt động tốt. Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫu dò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sản phẩm PCR nhận được. Phản ứng Southern blot được tiến hành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từ ADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADN WSSV (White Spot Syndrome Virus). Hình 4 A, B : Kết quả điện di và Southern blot với mẫu dò đặc hiệu cho YHV 1,2 : Sản phẩm PCR từ MBV; 3,4 : Sản phẩm PCRI từ YHV; 5: Thang X174- HaeIII; 6,7: Sản phẩm PCRII từ YHV; 8,9: Sản phẩm PCR từ WSSV. Kết quả (hình 4 A và B) cho thấy tín hiệu lai là hoàn toàn đặc hiệu cho các mẫu YHV. Độ nhạy của quy trình RT-PCR : Độ nhạy của quy trình được xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trên ARN YHV (30 g/l) pha loãng nhiều bậc. Hình 5 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCR từ RNA YHV pha loãng 6: Thang 100 bp; 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11: Các sản phẩm PCR ứng với độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10- 6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 của RNA YHV Kết quả trên cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được 6 pg ARN YHV hiện diện trong mẫu. Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đầu vàng Quy trình đã thiết lập trên ARN YHV được áp dụng để phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm, kết quả được trình bày trong hình 6 cho thấy có 2/20 mẫu khảo sát cho kết quả dương tính. Các mẫu còn lại, tuy đã được chẩn đoán mô học là dương tính với bệnh đầu vàng nhưng lại cho kết quả RT-PCR âm tính. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân : (1) đoạn mồi không phát hiện được các biến chủng của YHV địa phương, (2) Mẫu không được bảo quản tốt dẫn đến sự phân hủy ARN virut, (3) Bệnh do một virut tương cận nhưng không phải là YHV. Hình 6: Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm đầu vàng. 11: Thang 100 bp ; 1 - 21: Sản phẩm PCR từ các mẫu tôm nghi nhiễm. KẾT LUẬN: [...]...- Quy trình RT-PCR do chúng tôi thiết lập phát hiện được YHV với độ đặc hiệu cao và độ nhạy là 6pg ARN YHV tinh sạch - Trên 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm, quy trình phát hiện 02 mẫu nhiễm YHV TÀI LIỆU THAM KHẢO 1- Cowley J.A., Dimmock C.M., Wongteerasupaya C., Boonsaeng V., Panyim S & Walker P.J 2001 Yellow head... positive rate may be due to high genetic polymorphism of YHV or the presence of other members of the YHCV ACKNOWLEDGMENTS: We gratefully acknowledge J.A Cowley who provided YHV RNA Ngưòi thẩm định nội dung khoa học: GS Lê Đình Lương . PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa. Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân chính gây bệnh đầu vàng. Kết quả trên cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được 6 pg ARN YHV hiện diện trong mẫu. Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đầu vàng Quy trình đã thiết lập trên ARN