BÁO CÁO KHOA HỌC: "TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75" pdf

BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75 Đỗ Ngọc Liên, Phạm Tuấn Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Nguyễn Văn Lợi, Đào Kim Chi Trường Đại học Dược Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch chiết bằng đệm c

TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75

Đỗ Ngọc Liên, Phạm Tuấn Anh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Nguyễn Văn Lợi, Đào Kim Chi

Trường Đại học Dược Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.)

lần đầu tiên được Landsteiner và Raubitchek (1907) thông báo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu, sau này lectin của hạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa học tinh chế và được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học và miễn dịch (6) Mới đây LCA tinh khiết đã được Taketa và cộng sự sử dụng làm nguyên liệu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch dấu hiệu AFP trong ung thư biểu mô tế bào gan nhằm phân biệt với bệnh viêm gan siêu vi trùng thông

thường (7)

Ở Việt Nam đậu lăng cũng đã được trồng nhập nội và sử dụng từ thời Pháp thuộc (1) nhưng chưa có tài liệu nào

công bố về khả năng khai thác nguồn tài nguyên lectin quý hiếm này dùng cho nghiên cứu sinh y học và miễn dịch Xuất phát từ ý tưởng đó chúng tôi bước đầu thực hiện công việc nghiên cứu tinh chế lectin đậu lăng (LCA) và quy trình thử nghiệm chế tạo bộ sinh phẩm lectin dùng trong chẩn đoán y học

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Hạt đậu lăng khô được mua ở siêu thị là sản phẩm tiêu

dùng trong thực phẩm ở nước ta cũng như nhiêù nước trên

thế giới, đã được định tên khoa học là Lens culinaris, L,

(theo Tiến sĩ phân loại học Nguyễn Đăng Khôi), được bóc

vỏ cứng và nghiền thành bột mịn

Hồng cầu các nhóm máu được Viện huyết học truyền máu Trung ương và bệnh viện Bạch Mai cung cấp đã xác định là

không có yếu tố vi sinh vật truyền bệnh Việc xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HAA), biểu thị cho hoạt tính

lectin được thực hiện thường quy ở phòng thí nghiệm sinh

y học thuộc Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tế bào, ĐHQG Hà nội như đã mô tả trước đây(2,6) Các

phương pháp xác định hàm lượnh protein theo Lowry (5), kiểm tra đáng giá mức độ tinh sạch của chế phẩm lectin tinh chế được thực hiện theo kỹ thuật điện di gel

polyacrylamid ( SDS-PAGE) của Laemmli như đã mô tả trước đây (4) Việc tinh chế lectin đậu lăng đã được hoàn thiện nhờ kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 (3)

3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin đậu lăng

Sau khi chiết rút LCA từ bột hạt bằng đệm phốtphát chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2 1mM, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hàm lượng

protein trong dịch chiết Kết quả được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 : Hàm lượng Protein và hoạt tính ngưng kết hồng

cầu của dịch chiết đậu lăng

Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy LCA thể hiện hoạt tính cao nhất ở nhóm máu A Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt độ ngưng kết với hồng cầu nhóm máu A

3.2 Tinh chế lectin đậu lăng

a) Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dịch chiết về 4,5 để loại protein không có hoạt tính Sau khi li tâm, điều chỉnh pH về trung tính bằng NaOH 1M

b) Kết tủa phân đoạn protein đậu lăng bằng (NH4)2SO4 75% bão hoà

Sử dụng dung dịch muối trung tính (NH4)2SO4 ở trên đã kết

tủa toàn bộ protein - lectin trong dịch chiết Điều này được chứng minh là HAA ở dịch nổi sau kết tủa hầu như không

có Như vậy nồng độ (NH4)2SO4 75% bão hoà đựơc sử dụng là thích hợp nhất để kết tủa thuận nghịch lectin

c)Tinh sạch lectin đậu lăng qua cột sắc kí ái lực Sephadex G-75 :

Phần kết tủa lectin bằng (NH4)2SO4 được thu lại và hoà trong đệm phốtphát và thẩm tích 3 lần sau đó sẽ nạp vào cột sắc ký ái lực Sephadex G75 ( kích thước 2x20 cm) đã cân bằng với đệm chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2

1mM Phản hấp phụ bằng dung dịch đệm photphat chứa NaCl 1M, bổ sung glucose 1M và EDTA 1mM Thu phân đoạn 3 ml, tốc độ chảy 20 ml/h Xác định hàm lượng

protein ở các phân đoạn Dồn các phân đoạn có hàm lượng protein cao, thẩm tích và đông khô ở – 45oC trong 8 giờ Toàn bộ kết quả tinh chế được thể hiện trên bảng 2

Bảng 2: Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin đậu

Lens culinaris

Kết quả ở bảng 2 cho thấy từ 2g (2000 mg) bột hạt đậu lăng

(Lens culinaris L.), qua quá trình tách và tinh chế chúng tôi

thu được 0.42 mg LCA tinh khiết, hiệu suất thu hồi hoạt độ

5% và độ sạch tăng lên 57.69 lần Mặc dù LCA đã được

tinh chế có độ sạch tăng lên rất cao nhưng khả năng thu hồi

lectin còn thấp Do đó đây là một vấn đề đặt ra cho chúng

tôi là cần phải tiếp tục nghiên cứu để tăng hiệu suất của quá

trình tinh chế

3.3.Kiểm tra độ tinh sạch của LCA:

Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật điện di trên gel

polyacrylamide để kiểm tra độ tinh sạch của lectin đậu lăng

và xác định trọng lượng phân tử của lectin này Kết quả thể hiện ở hình 1:

Hình 1: Ảnh kết quả điện di các chế phẩm LCA trên gel

polyacrylamid

- Dãy 1: Chế phẩm lectin đậu lăng đã tinh chế qua cột ái lực Sephadex G75 thể hiện chủ yếu 1 băng có khối lượng phân tử xấp xỉ 25 KDa, một băng nhỏ có khối lượng xấp xỉ

12 KDa

- Dãy 2: Dịch nổi sau khi kết tủa dịch chiết đậu lăng

bằng (NH4)2SO4 75% bão hoà

- Dãy 3: Dịch chiết bằng đệm của bột đậu lăng chưa qua tinh sạch

- Dãy 4: Các protein tiêu chuẩn gồm: BSA(66 kDa),

Ovalbumin (45kDa), Lyzozym (14,3 kDa)

Qua ảnh điện di chúng tôi thấy lectin đậu lăng đã tinh chế qua sắc kí ái lực Sephadex G-75 có hai băng, trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa và 12 KDa Trong đó băng 25 KDa chiếm ưu thế (đậm hơn nhiều so với băng 12 KDa) Việc tính toán khối lượng phân tử được thực hiện theo kỹ thuật của Laemmli với việc xây dựng đường đồ thị các protein tiêu chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử (3,4) Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả cho rằng phân tử LCA có thể bao gồm 2 chuỗi  và 2 chuỗi

 có khối lượng tương đương từ 24 kDa và từ 10-12 kDa Phân tử LCA có thể kết hợp giữa các chuỗi  và  để hình thành các mức độ khối lượng phân tử từ 25 kDa đến 45 kDa (6) Điều quan trọng là lectin đậu lăng sau khi được chúng tôi tinh chế có mức độ tinh sạch cao có thể so sánh

với thương phẩm ngoại nhập với giá mua vào rất đắt (610 USD cho 100 mg chế phẩm của hãng Sigma năm 2001), vẫn đảm bảo hoạt tính sinh học ở điều kiện bảo đảm tiêu chuẩn

Quy trình tinh chế LCA được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau:

KẾT LUẬN

1 Lectin từ hạt đậu lăng (Lens culinaris L.) không gây

ngưng kết hồng cầu đặc hiệu nhóm máu, tuy nhiên hoạt độ ngưng kết hồng cầu nhóm máu A là cao nhất so với các nhóm máu khác

2 Sử dụng dung dịch đường glucose 1M/NaCl 1M, EDTA 1mM là thích hợp cho việc phản hấp phụ LCA ra khỏi cột sắc ký ái lực Sephadex G-75

3 Bằng kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 đã tinh chế được LCA có độ tinh khiết cao Chế phẩm LCA thu được có độ sạch tăng 57,69 lần, hiệu suất thu hồi

0,52%

4 Kết quả điện di chế phẩm LCA tinh sạch trên gel

polyacrylamide chỉ phát hiện được 2 băng protein có khối lượng phân tử khoảng 25 KDa và một băng nhỏ khoảng 12 KDa

Đề tài này được hỗ trợ kinh phí của chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản Nhà nước do Bộ khoa học và công

nghệ quản lý

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Đăng Khôi (1979) Nghiên cứu về cây thức ăn cho gia súc ở Việt Nam

Những loài cây bộ Đậu (Fabales) Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật Hà Nội

2 Do ngoc Lien, Cesari IM., Bouty I., Bout D., Hoebeke

J (1992) Immunocapture Assay for quantification of

human IgA antibodies to parasite antigenic enzymes

Applicatin with the alkaline phosphatase of Schistoma

mansoni J Immunoassay 13 (4) USA pp521-539

3 Johnstone A., Thorpe R (1987) Immunochemistry in practice Second edition, Blackwell Scientific Publications,

pp 4 - 16

4 Laemmli U.K 1970 Cleavage of structral proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4

Nature 227, 680-685

5 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L and Raudall R.L 1951 Protein measurement with the Folin phenol

reagent J Biol Chem 193, 265-275

6 Lis H., and Sharon N (1986) Biological properties of lectins The lectins: Properties, functions, and applications

in biology and medicine Acad Press Inc pp 266 - 283

7 Taketa K., Endo Y., Sekiya C., H 1993 ATanikawa K., Koji T., Taga H., Satomura S., Kwai T and Hirai -

Collaborative Study for the Evalution of lectin –Reactive Fetoprotein Early Ditection of Hepatocellular carcinoma .Cancer reasch 53, 5419-5423

SUMMARY

Isolation and purification of the lectin from Lentils

bean seeds (Lens culinaris L.) by affinity

chromatography

Đo Ngoc Lien, Pham Tuan Anh, et al

Faculty of Biology, Hanoi University of science

The lectin (LCA) from Lentils bean seeds (Lens culinaris

L.) was isolated by precipitating with 75% saturated

(NH4)2SO4, thus purified by Sephadex G-75 affinity

chromatography column The purity and molecular mass of this lectin was assesed and determined by SDS-PAGE ( Polyacrylamide Gel Electrophoresis with presence of SDS) The result of purication of LCA showed that the lectin

compounds of two bands of protein about 25 KDa and 12 KDa in SDS-PAGE

Some properties of LCA were determined as: non specific agglutination of human erythrocytes, specific activity of purified lectin about 58 folds higher in comparision with 1M NaCl extraction

Người thẩm dịnh nội dung khoa học: PGS Nguyễn Văn Mùi