Báo cáo khoa học Tạo kháng nguyên bề mặt của hbv (hepatitis b virus) bằng kỹ thuật gen và tạo kháng thể đa tròng

coli BL21DE3/pET-PreS1 mang vector tái tổ hợp pET-PreS1 có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1 ở dạng dung hợp 6XHis-PreS1.. coli BL21DE3/pGEX-PreS1 mang vector tái tổ hợp

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Đề tài :

TẠO KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA

HBV (HEPATITIS B VIRUS) BẰNG KỸ THUẬT GEN VÀ TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG

Cơ quan chủ trì: HỘI SINH HỌC TP.HCM

Chủ nhiệm đề tài : PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC

TP HCM 6/2008

PHẦN I

TÓM TẮT THÔNG TIN- MỤC TIÊU - NỘI DUNG ĐĂNG KÝ

1 Tên đề tài:

Tạo kháng nguyên bề mặt của HBV (Hepatitis B virus) bằng kỹ thuật gen

và tạo kháng thể đa dòng

2 Tên chủ nhiệm đề tài:

TRẦN LINH THƯỚC, PGS.TS

Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q 5, TP Hồ Chí Minh

ĐT: 8308557 (CQ) / 9316262 (NR) / Fax: 8308557 / Mobile: 0913-901644 E-mail: tlthuoc@hcmuns.edu.vn;

3 Đơn vị chủ trì đề tài:

HỘI SINH HỌC TP.HCM (LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH&KT TP.HCM)

4 Danh sách cán bộ trực tiếp tham gia đề tài:

TT Họ và Tên Học vị Cơ quan công tác

1 Nguyễn Lê Trang TSKH/PGS Viện Pasteur TP.HCM

3 Đặng T Phương Thảo ThS Trường ĐH KHTN

3 Huỳnh Ngọc Vi Ca Học viên cao học Trường ĐH KHTN

4 Đặng Trần Hiền Thảo SV Trường ĐH KHTN

5 Lê Thái Hoàng SV Trường ĐH KHTN

6 Nguyễn Thị Huỳnh Nga SV

5 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu của đề tài này là ứng dụng kỹ thuật gen để tạo kháng nguyên bề mặt của vi rút HBV gây bệnh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc

hiệu ở quy mô phòng thí nghiệm

6 Nội dung đăng ký

6.1 Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS 1 hoặc PreS 2 của HBV

- Thu nhận đoạn gen mã hóa kháng nguyên từ máu bệnh nhân viêm gan siêu

vi B bằng phản ứng PCR

- Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên trong E coli (dòng hóa gen vào vectơ tạo dòng, biến nạp vào E coli, chọn lọc và kiểm tra dòng E coli mang gen mục

tiêu);

- Tái tạo dòng trong E coli (tái tạo dòng gen đã thu nhận vào vectơ biểu hiện, biến nạp vào E coli, chọn lọc và kiểm tra dòng E coli mang gen mục tiêu)

6.2 Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

- Biểu hiện kháng nguyên và kiểm chứng (điện di SDS-PAGE, lai miễn dịch)

- Tinh chế kháng nguyên bằng sắc ký ái lực chuyên biệt

6.3 Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên

- Gây miễn dịch chuột hoặc bằng kháng nguyên tái tổ hợp

- Thu nhận kháng thể đa dòng IgG

- Tinh chế IgG bằng sắc ký ái lực chuyên biệt

6.4 Đánh giá kháng thể: hiệu giá, độ đặc hiệu

7 Thời gian, kinh phí và tiến độ thực hiện

7.1 Thời gian và kinh phí

- Thời gian: 24 tháng, từ 11/2004 – 10/2006

- Kinh phí: 180 triệu đồng

7.2 Tiến độ thực thiện các nội dung và sản phẩm

- Giai đoạn I

Từ tháng 11/2004 đến tháng 10/2005 - Kinh phí 120.000.000đ

1 Thu nhận gen mã hóa Pre-S1 (hoặc PreS2) từ

máu bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng PCR

Gen mã hóa Pre-S1 (hoặc PreS2)

2 Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên trong E

coli Các vector mang gen mã hóa kháng nguyên

3 Tái tạo dòng trong E coli Dòng E coli mang gen

mục tiêu

4 Biều hiện kháng nguyên mục tiêu và kiểm

chứng Kết quả điện di SDS-PAGE, lai miễn dịch

5 Tinh chế kháng nguyên bằng sắc ký ái lực Kháng nguyên tinh chế

6 Báo cáo sơ kết giai đoạn I Báo cáo kết quả

- Giai đoạn II

Từ tháng 11/2005 đến tháng 10/2006 - Kinh phí 60.000.000đ

1 Gây miễn dịch chuột/thỏ bằng kháng nguyên Chuột/thỏ đáp ứng miễn

tái tổ hợp dịch

2 Xác nhận hiệu giá kháng thể bằng phản ứng

tủa và ELISA Kết quả đánh giá

3 Thu nhận IgG, tinh chế Kháng thể đa dòng tinh

chế

4 Báo cáo nghiệm thu Báo cáo kết quả

PHẦN II

TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA ĐỀ TÀI

1 CÁC NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN

1.1 Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS1 hoặc PreS 2 của HBV

Đã tiến hành tạo dòng bằng 4 phương án khác nhau và thu được 4 dòng E

coli mang vector biểu hiện kháng nguyên bề mặt:

- Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1 mang vector tái tổ hợp pET-PreS1 có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1 ở dạng dung hợp 6XHis-PreS1

- Dòng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1 mang vector tái tổ hợp pGEX-PreS1

có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1 ở dạng dung hợp PreS1

GST Dòng E coli BL21(DE3 plysS)/pGEXGST PreS226 mang vector tái tổ hợp pGEX- PreS226có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS226 ở dạng dung hợp GST-PreS226 PreS226 là kháng nguyên tái tổ hợp chỉ chứa 26 axít amin đầu tiên của PreS2

- Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 mang vector tái tổ hợp PreS1-S226 có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1-S226 ở dạng dung hợp 6XHis-PreS1-S226 PreS1-S226 là kháng nguyên tái tổ hợp bao gồm PreS1 và 26 axít amin đầu tiên của PreS2

pET-1.2 Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

1.2.1 Biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp

- Đã cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp bằng IPTG ở 4 dòng E coli

thu nhận được (BL21(DE3)/pET-PreS1, BL21(DE3)/pGEX-PreS1, BL21(DE3

plysS) /pGEX-PreS226 và BL21(DE3)/pET-PreS1-S226)

- Chứng minh sự biểu hiện của 4 kháng nguyên tái tổ hợp bằng điện di PAGE và lai Western blot 6XHis-PreS1, GST- PreS226

SDS-1.2.2 Tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

Đã tiến hành tinh chế 3 kháng nguyên tái tổ hợp:

- Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Ni-NTA agarose

- Kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS226 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Glutathione sepharose

- Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Ni-NTA agarose

1.3 Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên

Đã tiến hành gây đáp ứng miễn dịch trên chuột và thu nhận kháng thể đa dòng bằng cách sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 tinh chế

- Sử dụng phương pháp ELISA đã chứng minh được rằng ở độ pha loãng kháng 1/25.600, kháng huyết thanh chuột vẫn nhận diện và gắn vào kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226

- Đã tinh chế kháng thể đa dòng từ kháng huyết thành chuột kháng PreS1-S226 (sử dụng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Protein G Sepharose)

6XHis-1.4 Đánh giá hiệu giá, độ đặc hiệu của kháng thể

Đã kiểm chứng tính đặc hiệu của kháng thể nhận được dựa trên khả năng nhận biết và gắn lên kháng nguyên bề mặt của virút HBV bằng phương pháp Sandwich ELISA

2 SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI THEO NỘI DUNG ĐÃ ĐĂNG KÝ

1 Thu nhận gen mã hóa

kháng nguyên Pre-S1

(hoặc PreS2)

Gen mã hóa Pre-S1

(hoặc PreS2) 4 gen mã hóa 4 kháng nguyên: - Pre-S1

- PreS2-S (kháng nguyên M)

- PreS2-S

- PreS1-S226

2 Tạo dòng gen mã hóa

kháng nguyên trong E

3 Tái tạo dòng trong E

coli Dòng E coli mang gen mục tiêu kháng nguyên: 4 dòng E coli mang gen mã hóa

4 Biều hiện kháng

nguyên mục tiêu và

kiểm chứng

Kết quả điện di PAGE, lai miễn dịch Biểu hiện kháng nguyên và kiểm chứng bằng SDS-PAGE, lai

SDS-Western ở 4 dòng E coli

5 Tinh chế kháng

nguyên bằng sắc ký ái Kháng nguyên tinh chế 3 kháng nguyên tái tổ hợp tinh chế:

lực - 6XHis-PreS1

- GST-PreS226

- 6XHis-PreS1-S226

6 Gây miễn dịch

chuột/thỏ bằng kháng

nguyên tái tổ hợp

Chuột/thỏ đáp ứng miễn dịch Gây đáp ứng miễn dịch chuột bằng kháng nguyên 6XHis-PreS1-

S226

7 Xác nhận hiệu giá

kháng thể bằng phản

ứng tủa và ELISA

Kết quả đánh giá - Xác nhận hiệu giá kháng thể

bằng phương pháp ELISA

- Xác nhận tính đặc hiệu của kháng thể bằng phương pháp Sandwich ELISA

8 Thu nhận IgG, tinh chế Kháng thể đa dòng

tinh chế Kháng thể đa dòng kháng 6XHis-PreS1-S226

3 SẢN PHẨM KHÁC

- Kết quả đào tạo đại học và sau đại học:

+ 03 khóa luận tốt nghiệp đại học

* Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên PreS1 của virus

viêm gan siêu vi B - Hepatitis B virus (HBV) trong E coli; Trần Đặng Hiền Thảo,

2004

* Tạo dòng & biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên PreS2 của virus

viêm gan siêu vi B - Hepatitis B virus (HBV) trong E coli; Lê Thái Hoàng, 2004

* Tinh chế và khảo sát tính miễn dịch nguyên của protein tái tổ hợp PreS1S226 của virus gây bệnh viêm gan siêu vi B (HBV), Nguyễn Thị Huỳnh Nga,

2006

+ 01 luận văn thạc sĩ:

* Tạo kháng nguyên tái tổ hợp, kháng thể đa dòng để ứng dụng trong chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B, Huỳnh Ngọc Vi Ca, 2006

- Bài báo công bố: 01

* Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa đoạn peptide PreS226 của virus

gây bệnh viêm gan B trong E coli, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 149-155, 2004

Con đường lây nhiễm quan trọng nhất là từ mẹ sang con Ngoài ra, bệnh còn lây qua đường tình dục, qua các dụng cụ bén nhọn có dính máu và dịch tiết làm rách da - niêm Nhân viên y tế là một trong những đối tượng có nguy cơ bị nhiễm cao do phải tiếp xúc thường xuyên với các loại dịch thể và máu Do đó, viêm gan siêu vi B còn được công nhận là một bệnh nghề nghiệp và là một bệnh lây nhiễm trong bệnh viện

Hiện nay, ước tính có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm hoặc đã bị nhiễm HBV, trong đó khoảng 350 triệu người bị nhiễm mãn tính, làm chết hàng năm khoảng 1 triệu người Tỷ lệ phát bệnh sau khi nhiễm thay đổi phụ thuộc vào lứa tuổi Có khoảng 80-90% trẻ sơ sinh dưới 1 năm tuổi nhiễm HBV sẽ trở nên mãn tính; tỷ lệ này là 30-50% ở lứa tuổi 1-4 tuổi và 25% người bị nhiễm mãn tính sẽ chết vì ung thư hoặc xơ gan Ở người lớn, 30-50% trường hợp bị nhiễm sau lần tiếp xúc đầu tiên, 2-6% sẽ trở thành nhiễm mãn tính và 15% số này sẽ chết vì bệnh gan (http://www.Who.int/emc).

Nước ta thuộc vùng dịch tễ lưu hành của viêm gan, đặc biệt đối với viêm gan B Số liệu điều tra năm 1998 trên 1.570 người tại tỉnh Thanh Hóa cho kết quả tỷ lệ nhiễm HBV trung bình là 17,2%, trong đó trẻ em là 12,5%, lứa tuổi vị thành niên là 20,5% và người lớn là 18,8% Hiện nay, tỷ lệ lưu hành bệnh viêm gan siêu vi B rất cao (ước tính khoảng 20% dân số có mang mầm bệnh) và thường dẫn đến xơ gan, ung thư gan và gây tử vong (http://www.ykhoanet.com).

Mức độ phổ biến và nguy hiểm do nhiễm HBV nêu trên đã tạo ra nhu cầu bức bách trong việc tiêm phòng và chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B Việc tiêm phòng có thể thực hiện ở trẻ mới sinh, tuy nhiên liều lượng sẽ thay đổi tùy thuộc vào người mẹ có mang mầm bệnh hay không Đối với các lứa tuổi còn lại, trước khi tiêm phòng, cần tiến hành chẩn đoán xem đã bị nhiễm HBV chưa Mặt khác, việc chẩn đoán cũng cần thiết nhằm xác định bệnh khi cơ thể có những biểu hiện bệnh lý về gan, để có biện pháp trị liệu thích hợp Do vậy, hiện nay nhu cầu chẩn đoán viêm gan siêu vi B là rất lớn, ước tính không dưới 100 xét nghiệm/ngày/đơn

vị xét nghiệm

Sự hiện diện của kháng nguyên bề mặt trên vỏ virút gây viêm gan B (HBsAg) là một trong những chỉ điểm huyết thanh quan trọng trong chẩn đoán các thể bệnh lâm sàng, trong xét nghiệm để tiến hành tiêm thuốc chủng ngừa cũng

như theo dõi sự tiến triển của bệnh trong quá trình điều trị Ở Việt Nam, phương pháp được chủ yếu dùng trong chẩn đoán HBV là ELISA Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, nhạy, rẻ tiền, có thể tiến hành kiểm tra cùng một lúc nhiều mẫu, và thao tác tương đối đơn giản Tuy nhiên, hiện nay, tất cả các đơn vị xét nghiệm HBV bằng kỹ thuật ELISA tại Việt Nam đều phụ thuộc vào bộ hóa chất (Kit) nhập từ nước ngoài, được cung cấp bởi nhiều công ty khác nhau (Abott, Bayer, Pharmatech…) Do đó, gây không ít khó khăn trong việc thực hiện do phải phụ thuộc vào nguồn cung cấp từ ngoài nước, đồng thời làm tăng chi phí xét nghiệm Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào trong nước được thực hiện nhằm phát triển các bộ Kit miễn dịch để chẩn đoán HBV do hạn chế về khả năng kỹ thuật trong việc tạo kháng nguyên để sản xuất kháng thể Đề tài này nhằm tạo kháng nguyên HBV tái tổ hợp và tạo kháng thể đa dòng tạo cơ sở cho việc phát triển phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu B ở Việt Nam

3.2 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Viêm gan siêu vi B là một vấn đề về sức khỏe mang tính toàn cầu Theo thống kê của WHO, năm 1994, trên thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viên gan siêu vi B trong đó có 350 triệu người nhiễm bệnh ở thể mãn tính, 25%- 40% số người nhiễm virus mãn tính sẽ chuyển thành xơ gan và ung thư tối cấp Ước tính hàng năm có khoảng 2 triệu người viêm gan mãn tính chết vì xơ gan và ung thư gan Hiện nay, cơ sở phân tử về cấu trúc, chức năng các thanh phần và về miễn dịch học của bệnh viêm gan do siêu vi B đã được biết rất rõ

3.2.1 Cơ sở phân tử cấu trúc và chức năng các thành phần của HBV

Bộ gen của HBV chứa bốn khung đọc mở (Open reading frame – ORF) mã hóa cho protein vỏ (PreS1, PreS2 và S); protein lõi (protein tiền lõi PreC, HBeAg và HBcAg); polymerase (HBPol) và protein X (HBx) Đầu 5’ của mạch (+) nằm dưới đầu 5’ của mạch (-) khoảng 200bp và chứa trình tự DR2 (direct repeat), đầu 5’ của mạch (-) chứa trình tự DR1, những trình tự này có vai trò trong

quá trình bắt cặp mồi để tổng hợp những sợi DNA tương ứng (Hình 1) Đầu 3’ của

mạch (+) không cố định, gắn với DNA polymerase của virus (C Seeger et al.,

Hepatitis B Virus Biology, Microbio & Mol Bio Reviews, 64, 51-68, 2000)

a Các protein bề mặt

Gồm 3 nhóm protein là S (SHBs), M (MHBs) và L (LHBs) (Hình 2)

Các phần tử HBV có khả năng gây nhiễm chứa đến 70% S, phần còn lại là M và

L với thành phần tương đương nhau Đây là các glycoprotein vỏ có thể được tiết ra dưới dạng không chứa DNA và không có khả năng gây nhiễm Số lượng của các protein này phong phú và vượt trội hơn nhiều so với những hạt virion có khả năng lây nhiễm Những phân tử này có hai dạng: hình cầu – chứa chủ yếu là protein S và M, hình sợi – chứa một lượng lớn protein L Những phân tử này được cho là

nguyên nhân gây ra những hội chứng miễn dịch phức tạp ở bệnh nhân nhiễm cấp tính và là mồi tạo kháng thể trung hòa anti-S

cystein Ngoài ra, SHBs thường được glycosyl hoá tại vị trí Asp146 SHBs là thành phần chủ yếu cấu thành nên các loại protein bề mặt khác, nên được sản xuất với số lượng lớn Ngoài ra, SHBs còn chứa một epitope mà dựa vào sự phân tích vùng epitope này cho phép ta phân loại các dạng phụ của HBV Những tế bào bị nhiễm HBV trong giai đoạn đầu thường sản xuất ra những protein này với số lượng lớn, trong đó chủ yếu là các dạng hạt không lây nhiễm Nồng độ các hạt không lây nhiễm có trong huyết thanh của người có thể lên đến 200µg/ml

- Protein M (MHBs)

Bao gồm protein S (226 axít amin) và một đoạn PreS2 (55aa) chứa 281 axít amin Vùng PreS2 có tính ưa nước, nằm ở mặt ngoài tế bào và được glycosyl hoá tại vị trí Asp4 Vị trí glycosyl hoá Asp4 của vùng PreS2 là cố định chứ không thay đổi như vị trí glycosyl hoá tại domain S Một số nghiên cứu sâu hơn về protein M cho thấy, chính vị trí glycosyl hoá Asp4 trên vùng PreS2 giúp cho protein M đóng vai trò quan trọng sự tiết ra của hạt virút Vị trí glycosyl hoá Asp4 của vùng PreS2

sẽ tương tác với các phân tử chaperon (calnexin) giúp M được gấp cuộn chính xác để có cấu hình cho phép kết hợp được với nucleocapsid để nảy chồi thành virus (J

Le Seyec et al., Role of the PreS2 domain of the large envelope protein in hepatitis

B virus assembly and infectivity, J Virol, 72, 5573-5578, 1998)

Vùng PreS2 chứa 4 epitope có tính kháng nguyên cao Trong số này có ba epitope của PreS2 hiện diện trong đoạn peptid từ axít amin 1- 26 (Hình 3) Các

epitope này có tính bảo tồn cao, ít có sự biến động giữa các loài HBV phụ Do vậy, đoạn peptid từ axít amin 1 đến 26, tạm gọi là vùng PreS226, là đặc trưng và đại diện cho toàn vùng PreS2

- Protein L (L HBs)

Bao gồm protein S (226 axít amin), PreS2 (55 axít amin) và PreS1 (108 hay

119 axít amin tùy dòng HBV)

Đây là protein bề mặt HBV lớn nhất, khoảng 39 kDa gồm domain S, vùng PreS1 và vùng PreS2 Ngoài vị trí glycosyl hoá trên domain S, cả 2 vùng PreS1 và

Chú thích : vùng

Hình 3: Các vùng epitope trên kháng nguyên PreS 2

55 26

PreS2 đều không có mang vị trí glycosyl hoá nào, nhưng trên vùng PreS1 lại có mang 1 vị trí tín hiệu tại đuôi N giúp giữ đuôi vào màng Vùng PreS1 thường thay đổi nhiều ở virút HBV

c Polymerase

Sản phẩm dịch mã từ ORF P, gồm hai vùng chức năng: protein cuối (terminal protein – TP) ở đầu N và RNase H ở đầu C Vùng TP, nối cộng hóa trị với đầu 5’ của DNA mạch (-), có vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói RNA tiền bộ gen (pgRNA) của virus và giữ vai trò làm mồi trong quá trình phiên mã ngược

d Protein X (HBx)

Là một protein nhỏ, 17kDa, và không có tính gây đáp ứng miễn dịch cao HBx hoạt hóa sự phiên mã một số gen của tế bào chủ và HBVt, là một nhân tố điều hòa đa chức năng giúp HBV thích nghi với những điều kiện bất lợi

3.2.2 Dấu ấn miễn dịch

- Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg): xuất hiện rất sớm, trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4 - 8 tuần kể từ khi có triệu chứng Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mãn Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh cho biết có DNA HBV trong tế bào gan Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng; nếu trong giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trị số ban đầu thì có nguy cơ trở thành người mang virus mãn tính

Có một số trường hợp viêm gan B mà HbsAg âm tính, đây có thể là do HBsAg hiện diện trong cơ thể với nồng độ thấp, nhỏ hơn ngưỡng phát hiện của các kỹ thuật hiện nay hoặc bị trung hòa bởi lượng kháng thể anti-HBs trội hơn

- Kháng nguyên PreS1: PreS1 là một thành phần của protein L thuộc protein bề mặt của HBV.PreS1 là có nhiều chức năng trong đó có chứa epitope có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch ở tế bào B và T với phổ trình diện kháng nguyên rộng hơn so với protein PreS2 và S PreS1 nằm ở ngoài cùng của lớp vỏ của phần tử HBV trưởng thành và có nhiều epitope trùng lắp lên nhau nên phản ứng miễn dịch tạo ra kháng thể anti-PreS1 xảy ra sớm trong quá trình gây bệnh và

có liên quan đến sự loại bỏ và trung hòa virus Kháng thể kháng PreS1 chủ yếu được phát hiện sớm ở những bệnh nhân viêm gan cấp tính, do đó, kháng thể kháng PreS1 có khả năng là một dấu ấn huyết thanh cho sự loại bỏ HBV Khoảng

½ trường hợp bệnh nhân viêm gan cấp tính trong giai đoạn bình phục có thử nghiệm phát hiện kháng thể kháng PreS1 dương tính Trong khi đó, ở những bệnh nhân có sự tồn tại lâu dài của kháng nguyên PreS1 không có kháng thể tương ứng sẽ có nhiều khả năng chuyển sang giai đoạn bệnh mãn tính (C.Y Maeng et al., Fine mapping of virus-neutralizing epitopes on the Hepatitis B Virus PreS1”,

Virology, 270, 9-16, 2000)

- Kháng nguyên PreS2 : PreS2 là thành phần của protein L và protein M thuộc protein bề mặt của HBV Đây là vùng mang nhiều epitope nên có tính kháng nguyên cao Những kháng thể kháng PreS2 sinh ra từ hệ thống miễn dịch sẽ giúp cơ thể không bị nhiễm bởi HBV Trong protein bề mặt L, cùng với vùng PreS1, vùng PreS2 cũng đóng vai trò giúp cho sự bám dính và tấn công của HBV lên tế bào gan Còn trong protein bề mặt M, vai trò chủ yếu của vùng PreS2 là giúp cho sự nảy chồi của HBV

Những thí nghiệm gần đây cho thấy vùng PreS (PreS1 và PreS2) có tính miễn dịch cao hơn Trong cơ thể người bệnh, những kháng thể kháng những epitope trên vùng PreS được phát hiện thấy trước khi phát hiện được những kháng thể kháng epitope của vùng S

- Kháng nguyên E (HBeAg) là kháng nguyên hòa tan thường liên quan đến HbsAg, phản ánh mức độ lây nhiễm của viêm gan B

Kháng nguyên HBeAg xuất hiện sớm trong giai đoạn tiền vàng da Sự biến mất của HBeAg và xuất hiện anti-HBe là dấu hiệu của bệnh đang lùi dần Ngược lại trong viêm gan mãn tấn công thường thấy HBeAg(+) chứng tỏ virus luôn luôn nhân lên

Ở những người có HBeAg(+) và HBsAg(+) thì tỷ lệ lây nhiễm rất cao, đặc biệt ở phụ nữ có thai, nếu HBsAg(+) thì cần theo dõi HBeAg, nếu HBeAg(+) thì hầu hết con của họ bị lây nhiễm

- Kháng nguyên C (HbcAg) : HbcAg là kháng nguyên lõi (core) được lớp vỏ HbsAg bao bọc nên không có trong máu ở dạng tự do, vì vậy, các kỹ thuật miễn dịch học thông thường không phát hiện được HbcAg chỉ xuất hiện ở trong tế bào gan và chỉ có thể phát hiện được khi làm sinh thiết gan Khi trong tế bào gan có HbcAg thì bao giờ cũng có HbsAg trên màng tế bào và nồng độ DNA polymerase luôn luôn tăng cao…

- Kháng thể anti-HBs : là kháng thể kháng lại HbsAg, xuất hiện muộn 2 – 16 tuần sau khi lượng HbsAg bắt đầu giảm IgM anti-HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp còn IgG anti-HBs xuất hiện muộn và tồn tại lâu dài hơn

Khi xét nghiệm thấy anti-HBs(+) là dấu hiệu bệnh đã được cải thiện HBs có tác dụng chống tái nhiễm HBV

Anti-Khi tiêm vắcxin viêm gan B thì anti-HBs là kháng thể duy nhất phát hiện được trong máu Nồng độ kháng thể anti-HBs cao hay thấp còn phụ thuộc vào một số các yếu tố như : công hiệu vắcxin, liều lượng và thời gian

- Kháng thể anti-HBe: là kháng thể kháng lại HBeAg, thường có ở huyết thanh người mang HBsAg hiệu giá thấp, chỉ nên xét nghiệm HBeAg và anti-HBe

ở những người có HBsAg(+)

Khi xuất hiện anti-HBe là dấu hiệu bệnh đang hồi phục IgM anti-HBe xuấthiện sớm còn IgG anti-HBe xuất hiện muộn hơn Sự có mặt của kháng thể anti-HBe không có tác dụng chống tái nhiễm HBV, mà chỉ biểu hiện đã từng mắc HBV

Bảng 1 Các dấu ấn chỉ thị sự nhiễm HBV

Quá trình nhiễm Dấu ấn Cấp tính Mãn tính Nhiễm trong quá khứ

HBsAg + + - HBeAg ban đầu +, sau đó - +/- -

anti-HBc IgM + - -

anti-HBc IgG + + +

anti-HBe ban đầu -, sau đó - +/- +

HBV DNA ban đầu +, sau đó - +/- -

ALT Tăng (đáng kể) Tăng (nhẹ) Bình thường

3.2.3 Các ứng dụng kháng nguyên bề mặt PreS1, PreS2

Gần đây, ngoài kháng nguyên S (HbsAg), các kháng nguyên PreS1, PreS2 thuộc nhóm kháng nguyên bề mặt L và M đang được nghiên cứu ứng dụng do những ưu điểm sau:

- Có tính ổn định cao, không biến động như S

- Chứa vị trí gắn với thụ thể của tế bào gan

- Chứa nhiều epitope có tính kháng nguyên cao

- Kháng thể kháng PreS1 và PreS2 có khả năng trung hòa virút

- Có nhiều ưu điểm để làm vắcxin phòng bệnh, điều trị và chẩn đoán

Có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bề mặt PreS1 và PreS2 của HBV nhằm mục đích chữa bệnh hoặc làm vắcxin phòng bệnh viêm gan B Chẳng hạn, những nhà khoa học thuộc Viện gan, Shenzhen, Trung Quốc đã dung hợp đoạn axit amin từ 3 - 55 của preS1 với đầu C của trình tự HBcAg (1-115) để tổng hợp protein HBVCS1 Protein này kích thích phản ứng miễn dịch anti-HBc mạnh và anti-PreS1 trung bình Việc chủng ngừa HBVCS1 giúp giảm lượng HBsAg và HBV DNA trong huyết thanh của những con chuột thử nghiệm HBVCS1 có thể là một văcxin trị liệu hữu hiệu đối với những trường hợp viêm gan B mãn tính

Những nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu khoa học sự sống và công nghệ sinh học Hàn Quốc đã tổng hợp thành công kháng thể đơn dòng gắn chuyên biệt

với vùng axit amin từ 21 - 47 của peptide PreS1 bằng cách gây miễn dịch chuột bằng đoạn peptide PreS1

Những nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu Kimball của Trung tâm máu New York cho rằng vì kháng nguyên có vai trò trong sự tương tác với thụ thể của tế bào gan nên những kháng thể gắn chuyên biệt với kháng nguyên này có thể trung hoà tính gây bệnh của virus bằng cách ngăn không cho chúng gắn với tế bào Vì vậy, hiện nay người ta đang tiếp tục nghiên cứu để chế tạo ra những kháng nguyên để dùng làm văcxin viêm gan B

3.3 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao của viêm gan siêu vi B, 50 – 70% dân

cư đã từng nhiễm bệnh, ước tính có khoảng 10 triệu người mang HBsAg Tỷ lệ mang HBsAg cao nhất là ở độ tuổi từ 41 - 50 chiếm 18,7%, thấp nhất là từ 0 -10 tuổi chiếm 10,7%, nhưng tỷ lệ HBeAg(+) /HBsAg(+) của lứa tuổi 0 - 10 lại là 91% Theo diễn tiến tự nhiên, tỷ lệ mất HBsAg hàng năm là 1 - 2%, và chuyển đổi huyết thanh HBeAg là 9,6% Về lây truyền dọc, nếu thai phụ có HBsAg(+), nguy cơ con bị nhiễm là 40 - 50%, còn thai phụ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+), nguy cơ con bị nhiễm là 90% Tỷ lệ viêm gan cấp ở bệnh viện có dấu ấn của siêu

vi viêm gan B là 40 - 50%, bệnh xơ gan trên người mang HBsAg(+) là 30 - 40% Ung thư gan chiếm 38/100000 người dân, đứng thứ hai sau ung thư phổi, HBsAg(+) trong ung thư gan là 80 - 90% Virút viêm gan B là căn nguyên quan trọng nhất gây ung thư gan tối cấp, chiếm 71,37% các trường hợp có liên quan đến viêm gan mãn và xơ gan ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu nhận và giải trình tự kháng nguyên bề mặt của virus HBV (Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội); các nhóm nghiên cứu khác phát triển kit chẩn đoán HBV bằng kỹ thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, Trường ĐH Khoa học tự nhiên; Phạm Hùng Vân, ĐH Y Dược Tp HCM) Ngoài ra, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tiếp nhận chuyển giao công nghệ từ Hàn Quốc để sản xuất HBsAg tái tổ hợp làm vắcxin

Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhóm nghiên cứu và công trình nào trong nước nghiên cứu các kháng nguyên vùng PreS (PreS1, PreS2) làm cơ sở cho các ứng dụng trong chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh viên gan do HBV

3.4 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Mục tiêu của đề tài này là ứng dụng kỹ thuật gen để tạo kháng nguyên bề mặt của vi rút HBV gây bệnh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc

hiệu ở quy mô phòng thí nghiệm

3.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để thu nhận kháng nguyên tái tổ hợp nhằm tạo kháng thể đa dòng, chúng tôi đã thực hiện các phương án sau nay:

- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS1 tái tổ hợp:

Phương án này được thực hiện với 2 hệ thống vector biểu hiện khác nhau: + Hệ thống vector biểu hiện pET43.1b(+); kháng nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp NUS-6XHis-PreS1;

+ Hệ thống vector biểu hiện pGEX-2TK; kháng nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp GST-PreS1

- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS226:

Trong PreS2 chỉ đoạn gen 26 axit amin đầu tiên đã được xác định có chứa epitope Do vậy chỉ đoạn peptide chứa 26 axit amin này được quan tâm để tạo dòng và biểu hiện trong đề tài này và được ký hiệu là PreS226 Gen mã hóa PreS226 được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX-2TK và kháng nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp GST- PreS226

- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS1-S226:

Để thu nhận được kháng nguyên mang đủ các đặc tính miễn dịch của PreS1

và PreS2, chúng tôi thực hiện phương án tạo dòng và biểu hiện đoạn peptide chứa đồng thời PreS1 và PreS226 Peptide này được đặt tên là PreS1-S226 Việc biểu hiện kháng nguyên PreS1-S226 tái tổ hợp được thực hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pET-28a; kháng nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp 6XHis- PreS1-S226

3.5.1 Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt PreS 1 , PreS 2 26, PreS 1 -S 2 26

của HBV

- Các gen mã hóa kháng nguyên PreS1, PreS226 và PreS1-S226 được thu nhận bằng phản ứng PCR bằng các cặp mồi tự thiết kế dựa trên khuôn là DNA bộ gen của HBV được tách chiết từ mẫu huyết thanh bệnh phẩm dương tính với HbsAg

- Các gen này được tạo dòng vào vector pBlueScript và được biến nạp vào tế

bào chủ E coli DH-5α

- Dòng E coli, các vector tái tổ hợp được phân tích, kiểm chứng bằng PCR

khuẩn lạc, PCR plasmid, cắt giới hạn và giải trình tự

- Các vector tái tổ hợp được dùng làm nguồn gen để tái tạo dòng nhằm tạo ra cá dòng biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp tương ứng

3.5.2 Tạo các dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS1 , PreS 2 26, PreS 1 -S 2 26 của HBV

3.5.2.1 Tạo các dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS 1

- Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên PreS1 ở dạng dung hợp 6XHis- PreS1:

+ Gen mã hóa PreS1 được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pET43.1b(+); + Vector tái tổ hợp (pET-PreS1) được biến nạp vào tế bào chủ E coli

BL21(DE3)

- Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên PreS1 ở dạng dung hợp PreS1:

GST-+ Gen mã hóa PreS1 được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pGEX-2TK;

+ Vector tái tổ hợp (pGEX-PreS1) được biến nạp vào tế bào chủ E coli

BL21(DE3)

3.5.2.2 Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS 2 26

- Gen mã hóa PreS226 được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pGEX-2TK

- Vector tái tổ hợp (pGEX-PreS226) được biến nạp vào tế bào chủ E coli BL21(DE3 plysS)

3.5.2.3 Tạo dòng E coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS 1 - S 2 26

- Gen mã hóa PreS1-S226 được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pET-28a

- Vector tái tổ hợp (pET-PreS1-S226) được biến nạp vào tế bào chủ E coli

BL21(DE3)

3.5.3 Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

3.5.3.1 Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên 6XHis-PreS 1 tái tổ hợp

- Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1 được cảm ứng biểu hiện 6XHis-PreS1

3.5.3.2 Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên GST-PreS 1 tái tổ hợp

- Dòng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1 được cảm ứng biểu hiện GST-PreS1

bằng IPTG;

- Sự biểu hiện kháng nguyên GST-PreS1 được kiểm chứng bằng điện di PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng GST và kháng thể kháng PreS1

SDS-3.5.3.3 Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên GST-PreS 2 26 tái tổ hợp

- Dòng E coli BL21(DE3pLys)/pGEX-PreS226 được cảm ứng biểu hiện GST- PreS226bằng IPTG;

- Sự biểu hiện kháng nguyên GST-PreS226được kiểm chứng bằng điện di SDS-PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng GST

- Kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS226 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Glutathione sepharose

3.5.3.4 Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên 6XHis-PreS 1 -S 2 26 tái tổ hợp

- Dòng E coli BL21(DE3)/pET-pET-PreS1-S226 được cảm ứng biểu hiện 6XHis- PreS1-S226bằng IPTG;

- Sự biểu hiện kháng nguyên PreS1-S226 được kiểm chứng bằng điện di PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng 6XHis và kháng thể kháng PreS1

SDS Kháng nguyên tái tổ hợp PreS1-S226 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Ni-NTA sepharose

3.5.4 Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên PreS 1 -S 2 26 tái tổ hợp

- Đã tiến hành gây miễn dịch chuột bằng kháng nguyên PreS1-S226 tái tổ hợp tinh chế

- Đã thu kháng thể IgG chuột và tinh chế bằng cột sắc ký ái lực protein G

3.5.5 Đánh giá kháng thể: hiệu giá, độ nhạy, độ đặc hiệu

- Kháng thể thu được được sử dụng cho phản ứng Sandwich ELISA để kiểm chứng khả năng nhận diện và gắn kháng nguyên HBs trong các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với HbsAg bằng bộ Kit ELISA thương phẩm

3.6 HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

3.6.1 Hóa chất

a Hóa chất dùng cho quá trình tách chiết và tinh chế DNA plasmid từ vi

khuẩn và DNA từ virus

- Dung dịch I: glucose 50mM; Tris-HCl pH 8,0 25mM, EDTA pH 8,0 10mM; hấp khử trùng ở 121oC, trong 15 phút trước khi sử dụng

- Dung dịch II (pha ngay trước khi sử dụng) Trong 200µl dung dịch II, có các thành phần như sau: sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 20µl, NaOH 5N 8µl, nước cất 172µl

- Dung dịch III (KOAc) pH 4,8: glacial acetic acid 0,2M, potassium acetate 0,2M; hấp khử trùng 121oC, trong 15 phút trước khi sử dụng

- RNase 1mg/ml, giữ ở -20oC

- Phenol pH 8,0 bão hoà trong TE, giữ trong tủ mát 4oC

- Chloroform

- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)

- Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)

- Ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)

- Dung dịch TE: Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA 1mM

- PEG 6000 20% (Wako, Nhật Bản) trong NaCl 15%, hấp khử trùng 121oC, trong 15 phút, giữ ở nhiệt độ phòng

- Sodium acetate 3M, pH 4,8 (giữ ở nhiệt độ phòng)

- Dung dịch ly giải virus: Tris-HCl pH8 10mM, EDTA 10mM, SDS 2%,

Proteinase K 500µg/ml

b Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose

- Agarose (SeaKem® LE Agarose, Mỹ) (các nồng độ gel thường sử dụng là 0,8%, 1%, 1,5% và 2%)

- Ethidium bromide 10mg/ml

- Dung dịch điện di TAE 50X (pH 7,9 – 8,0): Tris-base 242g, glacial acetic acid 57,1g, EDTA 500mM 100ml, nước cất đủ 1000ml

- Dung dịch nạp mẫu (loading dye) (giữ ở 4oC): bromophenol blue 0,25%;

glycerol trong TAE 1X 40%

c Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- Taq DNA polymerase (Amersham Biosciences) nồng độ 1U/µl, được bảo

quản trong dung dịch gồm 50mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,1mM, DTT 5mM và glycerol 50%, ở -20oC

- Đệm PCR 10X đi kèm với Taq DNA polymerase (Perkin – Elmer), Native

Pfu DNA polymerase (Stratagene)

- dNTP (Amersham Biosciences) mỗi dNTP có nồng độ 2mM trong nước (pH

7,5)

- MgCl2 , MgSO4 25mM

- Mồi (primer), được ký hiệu F1(21) và R1(21), do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử A (LabA), Trường đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp

c Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế

Các enzyme cắt hạn chế được sử dụng để thực hiện phản ứng cắt DNA

plasmid vector và gen mục tiêu là HindIII (Toyobo, Nhật Bản), và BamHI

(Fermentas) Thành phần của các phản ứng cắt được thực hiện dựa theo hướng dẫn sử dụng

d Hóa chất dùng cho quá trình tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt

Chloroform, sodium acetate 3M, pH 4,8, ethanol 70% và cồn tuyệt đối lạnh

e Hóa chất dùng cho phản ứng nối

Enzyme được sử dụng cho phản ứng nối là T4 DNA ligase của hãng Fermentas và các hóa chất làm đệm đi kèm

g Hóa chất dùng cho quá trình làm tế bào khả nạp và biến nạp

- Dung dịch CM: CaCl2 5%, MgCl2 15%

- CaCl2 100mM lạnh, vô trùng (giữ ở 4oC)

- Glycerol 80% vô trùng (pha loãng khi sử dụng)

- Ampicillin 100mg/ml (pha trong nước cất hai lần)

h Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu hiện gen mục tiêu

IPTG 1M (giữ ở -20oC)

i Hóa chất dùng cho điện di protein

- Gel polyacrylamide 100 × 100 × 0,75mm, nồng độ 12,5% có thành phần như sau:

+ Gel phân tách (separating gel): nước cất 2880µl, Tris-HCl 1,5M, pH 8,8 1670µl, 40% acrylamide 2100µl, SDS 10% 67µl, ammonium persulphate (APS) một ít, TEMED 2µl

+ Gel gom (stacking gel): nước cất 1255µl, Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 500µl, 40% acrylamide 225µl, SDS 10% 20µl, APS một ít, TEMED 1µl

- Dung dịch nạp mẫu 6X (pH 6,8) (giữ ở 4oC): glycerol 30%, bromophenol

blue 0,25%, xylene cyanol 0,25%

- Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml

- Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): Coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml, glacial acetic acid 25,0ml, nước cất 112,5ml

- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): glacial acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước cất 800ml

k Hóa chất dùng cho Western Blot

- Dung dịch Towbin: Tris-HCl 25mM, glycine 192mM, SDS 3,5mM, nước cất methanol 20% (v/v, thêm vào khi sử dụng)

- Dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,5): Na2HPO4 khan 80mM, NaH2PO4.2H2O 20mM, NaCl 100mM

- Dung dịch PBST (Phosphate Buffered Saline Tween): 0,5% (v/v) Tween 20 trong dung dịch PBS

- Dung dịch khóa màng (membrane blocking): Blocking reagent (sữa gầy) 0,5g, dung dịch PBST 10ml

- Dung dịch kháng thể chuột anti-6XHis, anti-GST anti-PreS1 (Abcam, Anh): 0,5µl kháng thể (10mg/ml), 15ml dung dịch PBST

- Dung dịch kháng thể thứ cấp đánh dấu (kháng thể thỏ kháng kháng thể chuột-HRP): 0,5µl kháng thể-HRP (10mg/ml) (Abcam, Anh), 15ml dung dịch PBST

- Dung dịch hiện phim Hyperfilm™ECL (Amersham Biosciences): dung dịch developer, dung dịch Fixer

l Hóa chất dùng để bảo quản chủng

Glycerol 80% vô trùng (pha loãng khi sử dụng), nước cất vô trùng

m Hóa chất dùng để tinh chế protein dung hợp với His-Tag

- Cột Nikel-nitrilotriacetic acid (cột Ni-NTA) (Qiagen, Nhật)

- Đệm rửa (Wash buffer) (Dung dịch A) có thành phần như sau: Tris HCl 25

mM, NaCl 500 mM, imidazole 10 mM, pH 8,0

- Đệm dung ly (Elution buffer) (Dung dịch C): Tris HCl 25 mM, NaCl 500

n Hóa chất dùng để tinh chế protein dung hợp với GST

- Cột Glutathione-Sepharose: GSTTrapTMFF dung tích 5ml (Amersham Biosciences)

- Dung dịch nạp mẫu (Binding buffer) pH 7,3: 140mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8mM KH2PO4

o Hóa chất dùng cho tinh chế kháng thể

- Ammonium sulfate bão hòa: 75g/100ml

- Cột Hi TrapTM Protein G HP (Amersham Biosciences) 1ml

- Dung dịch gắn cột: 0,02M Sodium phosphate pH 7,0

- Dung dịch dung ly: 0,1M glycine-HCl pH 2,7

- Dung dịch trung hòa:1M Tris-HCl pH 9,0

- Dung dịch bảo quản cột: 100mM sodium phosphate, pH 7,0

p Hóa chất dùng để gây đáp ứng miễn dịch chuột

- Complete Freund Adjuvant (Difco)

- Incomplete Freund Adjuvant (Difco)

- Nước cất tiêm

q Hoá chất dùng cho ELISA

- Antigen coating buffer pH 7,2 – 7,4: 0,16% Na2CO3, 0,293% NaHCO3,

0,02% sodium azide

- PBS buffer: 1 lít phosphate buffer pH 7,6 – 8, 14,61g NaCl, 1ml Tween 20

- Blocking buffer: 5% sữa gầy trong PBS buffer

- Citrate buffer pH 5: 0,1M citric acid, 0,1M Na2HPO4

- OPD buffer pH 5: 40µg OPD/1ml citrate buffer

- OPD-H2O2 buffer: 0,015% H2O2 trong OPD buffer

- Stop solution: H2SO4 2N

- Kháng thể chuột đơn dòng kháng HBsAg (Abcam, Anh),

- Kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Abcam): 1/10.000

3.6.2 Môi trường

- Môi trường LB (Luria – Bertani): trypton 1,0%, cao nấm men 0,5%, NaCl

0,5%

- Môi trường LB - Ampicillin (LBA): thành phần môi trường tương tự như môi trường LB nhưng được bổ sung vô trùng ampicillin với nồng độ cuối 50µg/ml

ở 40 - 50oC sau khi hấp khử trùng

Tất cả các môi trường trên đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 25 phút sau khi pha Nếu là môi trường rắn, bổ sung thêm 2% agar

3.7 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.7.1 Vật liệu

a Chủng vi sinh vật

- Chủng E coli DH5α {F- endA1 hsdR17 (rk-/mk-) sup44 thi λ- recA1 gyrA96

∆lacU169 (φ80lacZ∆M15)} dùng để tạo dòng gen mã hóa PreS1, PreS226, PreS1-

S226

- Chủng E coli BL21(DE3) thuộc chủng E coli B có kiểu gen F-, ompT,

hsdS B (rB- mB-), gal dcm met (DE3) dùng để biểu hiện pET43.1b(+)-PreS1, PreS1 và pET- PreS1- S226

pGEX Chủng E coli BL21(DE3 plysS) (E coli F - OmpT hsds (r

-B m

-B ) dcm+ Tet r

gal λ (DE3) endA The[plysS Cam r ] a dùng để biểu hiện PreS226-pGEX

b Plasmid

- Plasmid tạo dòng: pBluescript II SK+ (H ình 3)

- Plasmid biểu hiện pET43.1b(+) (Hình 4) là vector biểu hiện, mang gen kháng kháng sinh ampicillin (amp r), trình tự khởi đầu sao chép f1 ori, T7 promoter

và lac operator (Hình 4) Đây là một promoter được cảm ứng với IPTG Trong tế

bào chủ gen mục tiêu sẽ được biểu hiện khi có sự hiện diện của IPTG trong môi trường nuôi cấy Nus-Tag là một protein giúp làm tăng khả năng tan của protein dung hợp trong tế bào chất

- Plasmid biểu hiện pET-28a(+) (Hình 5) có kích thước 5369bp với trình tự

khởi đầu sao chép f1 ori, mang gen kháng kháng sinh Kanamycine được sử dụng làm nhân tố chọn lọc thể biến nạp mang vector tái tổ hợp

Hình 11: Vector pET-43.1b(+) Hình 3 Bản đồ plasmid pBluescriptII SK(+)

Đây là một vector biểu hiện

dưới sự kiểm soát của T7

promoter được nhận diện bởi T7

RNA polymerase của tế bào chủ

E coli và lac operator, làm tăng

khả năng kiểm soát sự hoạt động

của T7 promoter tránh tình trạng

“rò rỉ“ trong việc biểu hiện

protein khi chưa được cảm ứng

Ngay trước và sau vùng multi

cloning site (MCS), mang các vị

trí nhận biết duy nhất của

enzyme cắt giới hạn, phục vụ

cho việc dòng hóa gen mục tiêu

là 2 trình tự mã hóa cho 6

histidine (6XHis)

giúp cho việc phát hiện và tinh chế protein mục tiêu

- Plasmid biểu hiện: pGEX-2TK (Hình 6) là vector biểu hiện, mang gen kháng kháng sinh ampicillin (amp r ), trình tự khởi đầu sao chép ori pBR322, tac

promoter và lac operator Đây là một promoter được cảm ứng với IPTG Trong tế bào chủ gen mục tiêu sẽ được biểu hiện khi có sự hiện diện của IPTG trong môi trường nuôi cấy dưới dạng dung hợp với GST (Glutathione S-Transferase) giúp dễ dàng tinh chế protein dung hợp bằng cột sắc ký ái lực gắn glutathione

c Các thang phân tử lượng dùng trong điện di

- Thang DNA

Stop codon

Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Arg Ala Ser Val

CTG GTT CCG CGT GGA TCT CGT CGT GCA TCT GTT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA

BamHI EcoRI Thrombin Kinase

pBR322 ori

Amp

lacI q

Ptac GST

Thang λ-HindIII Thang 100bp Thang100bp

(Fermentas) (Fermentas) (NewEngland BioLab)

Hình 7 Kích thước các thang phân tử lượng

- Thang phân tử lượng protein: phosphorylase b 94kDa, albumin 67kDa, ovalbumin 43kDa, carbonic anhydrase 30kDa, trypsin inhibitor 20kDa, α-

lactalbumin 14,4kDa

- Thang phân tử lượng protein đã được nhuộm dùng trong Western Blot: α2macroglobulin 180kDa, β-galactosidase 116kDa, fructose-6-phosphate kinase 84kDa, pyruvate kinase 58kDa, fumarase 48,5kDa, lactate dehydrogenase 36,5kDa, triosephosphate isomerase 26,6kDa

-d Vật liệu để thu nhận DNA của virút HBV

Nguồn DNA của HBV được thu nhận từ huyết thanh của bệnh nhân có kết quả xét nghiệm dương tính với HBs do Viện Pasteur cung cấp

e Huyết thanh dương tính và âm tính HBsAg

Dùng để xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng PreS1- S226 thu được đối với kháng nguyên bề mặt của HBV bằng phương pháp Sandwich ELISA Các huyết thanh này đã được xác nhận dương tính hoặc âm tính bằng ELISA sử dụng bộ Kit thương mại và được cung cấp bởi Bệnh viện Y dược TP.HCM

3.7.2 Tạo dòng gen mã hóa PreS 1 , PreS 2 26, PreS 1 - S 226

a Thu nhận DNA bộ gen của HBV

Tiến hành thu nhận DNA bộ gen của HBV với quy trình như sau: trộn huyết thanh (huyết thanh của bệnh nhân có kết quả xét nghiệm HbsAg dương tính) với dung dịch phá màng (SDS 2%, Proteinase K 2mg/ml, EDTA 10mM), ủ 37°C trong

37 giờ Sau đó, xử lý với phenol và choloroform để loại bỏ protein Thu nhận phần dịch nổi có chứa DNA bộ gen của HBV, tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối lạnh, rửa tủa bằng ethanol 70% Cuối cùng, hòa tan và bảo quản DNA trong TE

b Phản ứng PCR thu nhận gen mã hóa PreS1 , PreS 2 26, PreS 1 - S 2 26

- Đoạn gen mã hóa cho PreS1 của HBV được thu nhận bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu là PreS1-for (CGGAATTCCATGGGAGGTT GGTCTTCCA AACCTCGG) / PreS1-rev (CGGAATTCGGCCTGAGGATGACT) Sản phẩm PCR chứa vùng PreS1 có kích thước 357bp mã hóa cho một peptid 119 axít amin

- Đoạn gen mã hóa cho PreS2 được thu nhận dưới dạng gen mã hóa protein M (tức là PreS2-S) bằng phương pháp PCR với cặp mồi PreS2-for (GCTGGA TCCATGCAGTGGAACTCCACA) / PreS1-rev (CGGAATTCGGCCTGA GGATG ACT) Sản phẩm PCR có kích thước 843bp mã hóa cho M chứa 281 axít amin, trong đó PreS2 là đoạn 55 amino acid đầu tiên và S chứa 226 axít amin

- Đoạn gen mã hóa cho 26 axít amin đầu tiên của PreS2, được đặt tên là PreS226 được thu nhận bằng phương pháp PCR dùng cặp mồi PreS1-for (CGGAATTCCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGG) / PreS2-rev (GCTGG ATCCGTTCGCTGCAGGGTCCCC) Sản phẩm PCR có kích thước 78bp

- Đoạn gen mã hóa cho PreS1-S226 (bao gồm vùng mã hóa cho PreS1 chứa

119 axít amin và vùng mã hóa cho 26 axít amin đầu tiên của PreS2) được thu nhận bằng bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu là PreS1-for (CGGAATT CCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGG) / PreS2-rev (GCTGG ATCCGTT CGCTGCAGGGTCCCC) Sản phẩm PCR có kích thước 435bp mã hóa cho một peptid chứa 145 axít amin

Tất cả các phản ứng PCR nêu trên đều được thực hiện trong phản ứng với

thành phần như saut: 0,5µl DNA HBV; 5µl dung dịch đệm 10X; 3µl MgSO4

25mM; 5µl dNTP 8mM; 1µl mồi xuôi F; 1µl mồi ngược R; 0,5µl Pfu DNA

polymerase (2,5U/µl); 34µl nước cất hai lần Điều kiện phản ứng PCR là: 95°C - 1phút, 55°C – 1 phút, 72°C – 1 phút (30 chu kỳ); 72°C - 15 phút; 4°C - 15 phút Sau khi kết thúc phản ứng, lấy 5µl sản phẩm thu được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% Các bước tiến hành như sau: cân 0,45g agarose cho vào erlen 100ml Bổ sung 30ml dung dịch TAE 1X, đun cho đến khi agarose tan hết Để ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch hơi nguội rồi đổ vào khuôn điện di Khi gel đông, cho dung dịch TAE 1X vào, gỡ lược Trộn mẫu với dung dịch nạp mẫu (loading dye), bơm vào giếng Tiến hành điện di với cường độ 100V, khoảng

20 phút Sau khi điện di xong, ngâm gel trong nước chứa 1 - 2 giọt ethidium bromide khoảng 10 - 15 phút, xem kết quả bằng hộp soi đèn tử ngoại

c Tinh chế sản phẩm PCR

Để chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng cắt, phần sản phẩm PCR còn lại được tinh chế theo quy trình như sau:

- Cho một thể tích chloroform (1V) vào eppendorf chứa sản phẩm PCR, vortex nhẹ, ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, hút chuyển dịch nổi vào một eppendorf mới

- Bổ sung sodium acetate (tỷ lệ 1/10V) và ethanol 99,9% lạnh (tỷ lệ 2,5/1V),

ủ từ 15 - 30 phút ở 4oC, ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút, thu tủa

- Rửa tủa bằng ethanol 70% lạnh (tỷ lệ 1/1V), ly tâm 13.000 vòng/phút, 20 phút, thu tủa và để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Bổ sung dung dịch TE 1X và giữ mẫu ở 4oC

c Tạo dòng gen mã hóa PreS 1 , PreS 2 -S (M), PreS 2 26 và PreS 1 -S 2 26

Đoạn gen PreS1, M và PreS1-S226 từ phản ứng PCR đã tinh chế được nối vào

vector pBluescript đã mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV Các vector tái

tổ hợp tạo thành được đặt tên là pBlue-PreS1, pBlue-M, pBlue-PreS226, PreS1-S226 Mỗi vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào chủ E coli DH5α Dòng E coli tái tổ hợp được sàng lọc bằng môi trường LB Amp50 -X-gal Qui trình

pBlue-tạo dòng gen mã hóa PreS1, M, PreS226 và PreS1-S226 trong plasmid pBluescript

được minh họa trên Hình 8

Các vector tái tổ hợp này được ly trích từ dòng E coli tái tổ hợp và được

dùng làm nguồn để thu nhận gen dùng trong tái tạo dòng trên vector biểu hiện

3.7.3 Tách chiết, thu nhận và tinh chế vector

a Tách chiết, thu nhận vector plasmid

- Cấy các tế bào E coli mang plasmid vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường

LBA, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC trong máy lắc ổn nhiệt

- Hút dịch vi khuẩn vào một eppendorf 1,5ml, ly tâm thu sinh khối 10.000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng Lặp lại từ 3 – 4 lần để thu hết sinh khối Hút bỏ phần dịch môi trường còn thừa bên trên

- Cho vào eppendorf chứa sinh khối 100µl dung dịch I, vortex để huyền phù lượng sinh khối thật kỹ

- Thêm 200µl dung dịch II vào eppendorf trên, đảo nhẹ eppendorf Sau đó, thêm tiếp 150µl dung dịch III, lắc nhẹ

- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút ở nhiệt độ phòng Thu dịch nổi vào một eppendorf mới, bỏ cặn

- Cho vào eppendorf chứa dịch nổi ở trên 1µl RNase, ủ ở 37oC trong khoảng một hoặc hơn một giờ

- Cho vào eppendorf trên 250µl dung dịch phenol bão hòa trong TE và 250µl dung dịch chloroform, vortex đều

- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng Hút chuyển dịch nổi vào một eppendorf mới

- Cho vào eppendorf chứa dịch nổi này 500µl dung dịch chloroform, vortex đều Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng Hút chuyển dịch nổi vào một eppendorf mới

- Bổ sung vào eppendorf trên 1000µl isopropanol lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 20 phút ở 4oC Thu tủa

- Rửa tủa trên bằng 500µl ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 20 phút ở 4oC Thu tủa và để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Hòa tan tủa trong 30µl

TE 1X và giữ ở 4oC

b Tinh chế plasmid

Plasmid sau khi tách chiết có thể bị lẫn một lượng nhỏ RNA, gây khó khăn cho các thí nghiệm cắt nối tiếp theo Do đó, để thực hiện phản ứng cắt hạn chế thuận lợi, plasmid đã tách chiết này sẽ được tinh chế bằng cách sử dụng PEG

6000 theo quy trình như sau:

- Bổ sung vào eppendorf chứa plasmid tách chiết dung dịch sodium acetate (1/10V) và PEG 6000 20% (1V), ủ qua đêm ở 4oC

- Ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút ở 4oC Thu cặn

- Bổ sung vào eppendorf chứa cặn này 2,5V ethanol 99,9% lạnh Ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút, ở 4oC Thu cặn

- Rửa tủa bằng ethanol 70% (1V) lạnh Ly tâm 13.000 vòng/phút, 20 phút, ở

4oC Thu tủa và để cặn khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Hòa tan cặn trong dung dịch TE 1X và giữ ở 4oC

3.7.4 Tạo vector tái tổ hợp pET- PreS 1

Gen PreS1 và plasmid vector pET43.1b(+) được xử lý bằng 2 enzyme cắt hạn

chế BamHI và HindIII để tạo ra hai đầu cắt tương hợp với nhau theo qui trình được minh họa trên Hình 9

Pfu DNA polymerase

Đoạn gen mục tiêu

Nối bằng T4 DNA ligase

Khuẩn lạc màu trắng mang plasmid tái tổ hợp Biến nạp

la cZ

Hình 8 Sơ đồ minh họa quy trình tạo dịng đầu bằng

pBlue-PreX: pBlue-PreS 1 ; pBlue-M, pBlue-PreS 2 26 và pBlue-PreS 1 -S 2 26

a Xử lý gen mã hóa PreS 1 lần lượt bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và HindIII

Đầu tiên, tiến hành phản ứng cắt hạn chế bằng enzyme BamHI với tổng thể tích 40µl và thành phần như sau: gen preS 1 7,5µl, đệm 10X BamHI+ 4µl, BamHI

(10U/µl) 1,5µl, nước cất 27µl (tổng thể tích 40µl) Phản ứng cắt được thực hiện ở

37oC, trong vòng 3 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt bằng quy trình tinh chế sản phẩm PCR

Thực hiện tiếp phản ứng cắt hạn chế với enzyme HindIII với tổng thể tích phản ứng là 40µl gồm: preS 1 /BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, HindIII

1,5µl (tổng thể tích 40µl) Sau khi thực hiện phản ứng cắt xong (37oC, 3 giờ), tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm cắt theo quy trình tinh chế dành cho sản phẩm PCR, bảo quản mẫu ở 4oC trong dung dịch TE 1X để thực hiện tiếp những thí nghiệm tiếp theo

b Xử lý plasmid vector pET43.1b(+) bằng BamHI và HindIII tạo đầu dính

- Phản ứng cắt pET43.1b(+) bằng BamHI: pET43.1b(+) 43µl, đệm BamHI+

5µl, BamHI 2µl (tổng thể tích 50µl)

- Phản ứng cắt pET43.1b(+)/BamHI bằng HindIII: pET43.1b(+)/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, HindIII 1,5µl (tổng thể tích 40µl)

Mỗi phản ứng cắt này cũng được thực hiện ở 37oC, trong 3 giờ Sau mỗi phản ứng cắt, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt

c Tạo vector tái tổ hợp pET- PreS 1

Đặt eppendorf 0,5ml vào một chậu đá, lần lượt hút các dung dịch sau vào

eppendorf: pET43.1b(+)/BamHI+HindIII 0,5µl, PreS1/BamHI+HindIII 1,5µl, nước

cất 15µl, đệm T4 DNA ligase 2µl, enzyme T4 DNA ligase 1µl (tổng thể tích 20µl) Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy ổn nhiệt trong 4 giờ, ở 160C Sau khi phản ứng nối kết thúc, thực hiện ngay bước biến nạp nhằm đưa sản phẩm nối vào chủng biểu

hiện E coli BL21(DE3)

3.7.5 Tạo vector tái tổ hợp pGEX- PreS 1

Gen mã hóa PreS1 và vector pGEX-2TK được xử lý bằng 2 enzyme cắt hạn

chế BamHI và EcoRI để tạo ra hai đầu cắt tương hợp với nhau theo qui trình được minh họa trên Hình 10

a Xử lý gen mã hóa PreS 1 lần lượt bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI

Đầu tiên, tiến hành phản ứng cắt hạn chế bằng enzyme BamHI với tổng thể tích 40µl và thành phần như sau: preS 1 7,5µl, đệm 10X BamHI+ 4µl, BamHI

(10U/µl) 1,5µl, nước cất 27µl (tổng thể tích 40µl) Phản ứng cắt được thực hiện ở

37oC, trong vòng 3 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt bằng quy trình tinh chế sản phẩm PCR

Thực hiện tiếp phản ứng cắt hạn chế với enzyme EcoRI với tổng thể tích phản ứng là 40µl gồm: preS 1 /BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, EcoRI

1,5µl (tổng thể tích 40µl) Sau khi thực hiện phản ứng cắt xong (37oC, 3 giờ), tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm cắt theo quy trình tinh chế dành cho sản phẩm PCR, bảo quản mẫu ở 4oC trong dung dịch TE 1X để thực hiện tiếp những thí nghiệm tiếp theo

b Xử lý plasmid vector pGEX-2TK bằng BamHI và EcoRI tạo đầu dính

- Phản ứng cắt pGEX-2TK bằng BamHI: pGEX-2TK 43µl, đệm BamHI+ 5µl,

BamHI 2µl (tổng thể tích 50µl)

- Phản ứng cắt pGEX-2TK/BamHI bằng EcoRI: pGEX-2TK/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, EcoRI 1,5µl (tổng thể tích 40µl)

pET-PreS 1 pET43.1b(+)

preS 1

Hình 9 Sơ đồ qui trình tạo vector tái tổ hợp pET-PreS 1

Mỗi phản ứng cắt này cũng được thực hiện ở 37oC, trong 3 giờ Sau mỗi phản ứng cắt, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt

c Tạo vector tái tổ hợp pGEX- PreS 1

Đặt eppendorf 0,5ml vào một chậu nước đá, lần lượt hút các dung dịch sau

vào eppendorf: pGEX-2TK/BamHI+EcoRI 0,5µl, preS 1 /BamHI+EcoRI 1,5µl, nước

cất 15µl, đệm T4 DNA ligase 2µl, enzyme T4 DNA ligase 1µl (tổng thể tích 20µl) Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy ổn nhiệt trong 4 giờ, ở 160C Sau khi phản ứng nối kết thúc, thực hiện ngay bước biến nạp nhằm đưa sản phẩm nối vào chủng biểu

hiện E coli BL21(DE3)

3.7.6 Tạo vector tái tổ hợp pGEX- PreS2 26

Gen mã hóa PreS226 và vector pGEX-2TK được xử lý bằng các enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI tạo đầu dính để tạo ra hai đầu cắt tương hợp với nhau theo qui trình được minh họa trên Hình 11

a Xử lý đoạn gen mục tiêu preS 2 26 bằng enzym cắt giới hạn

Sản phẩm khuếch đại preS 2 26 thu được từ phản ứng PCR và tinh chế được

cắt bằng enzym cắt giới hạn BamHI và EcoRI để tạo hai đầu dính Thành phần

phản ứng cắt như sau: sản phẩm PCR PreS226 25µl, buffer Y+Tango 8µl, nước cất

4µl, BamHI 1,5µl, EcoRI 1,5µl (tổng cộng 40µl) Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC, trong 3 giờ, điện di trên gel agarose 1,5 % Sản phẩm được tinh chế qua gel

b Xử lý vector pGEX bằng enzym cắt giới hạn

Vector pGEX cũng được cắt bằng bằng 2 enzym BamHI và EcoRI để mở vòng

và tạo đầu dính tương hợp Thành phần phản ứng như sau: DNA plasmid 10µl, buffer Y+ Tango 4µl, BamHI 0,5µl, EcoRI 0,5µl, nước cất 5µl ( tổng cộng20µl) Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ ở 37oC, trong 3 giờ Sau đó, đem điện di trên gel agarose 1%, tinh chế sản phẩm

c Tạo plasmid tái tổ hợp pGEX-PreS 2 26

Vector pGEX sau khi cắt mở vòng tạo 2 đầu so le bằng BamHI và EcoRI được

nối với đoạn DNA mục tiêu cũng được xử lý 2 đầu với cùng enzym trên

Đặt eppendorf 0,5ml vào một chậu nước đá, lần lượt hút các dung dịch sau

vào eppendorf: pGEX-2TK/BamHI+EcoRI 0,5µl, PreS226/BamHI+ EcoRI 1,5µl,

nước cất 6,5µl, đệm T4 DNA ligase 1µl, enzyme T4 DNA ligase 0,5µl (tổng thể tích 10µl) Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy ổn nhiệt trong 4 giờ, ở 160C Sau khi phản ứng nối kết thúc, thực hiện ngay bước biến nạp nhằm đưa sản phẩm nối vào

chủng biểu hiện E coli BL21(DE3 plysS)

3.7.7 Tạo vector tái pET- PreS1 -S 2 26

Gen PreS1- S226 và plasmid vector pET-28a được xử lý bằng 2 enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI để tạo ra hai đầu cắt tương hợp với nhau

a Xử lý gen mã hóa PreS 1 -S 2 26 lần lượt bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI

Đầu tiên, tiến hành phản ứng cắt hạn chế bằng enzyme BamHI với tổng thể tích 40µl và thành phần như sau: preS 1 -S 2 26 7,5µl, đệm 10X BamHI+ 4µl, BamHI

(10U/µl) 1,5µl, nước cất 27µl (tổng thể tích 40µl) Phản ứng cắt được thực hiện ở

37oC, trong vòng 3 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt bằng quy trình tinh chế sản phẩm PCR

Thực hiện tiếp phản ứng cắt hạn chế với enzyme EcoRI với tổng thể tích phản ứng là 40µl gồm: preS 1 -S 2 26/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, EcoRI 1,5µl (tổng thể tích 40µl) Sau khi thực hiện phản ứng cắt xong (37oC, 3 giờ), tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm cắt theo quy trình tinh chế dành cho sản phẩm PCR, bảo quản mẫu ở 4oC trong dung dịch TE 1X để thực hiện tiếp những thí nghiệm tiếp theo

b Xử lý plasmid vector pET-28a bằng BamHI và EcoRI tạo đầu dính

- Phản ứng cắt pET-28a bằng BamHI: pET-28a 43µl, đệm BamHI+ 5µl,

BamHI 2µl (Tổng thể tích 50µl)

- Phản ứng cắt pET-28a/BamHI bằng EcoRI: pET-28a/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, EcoRI 1,5µl (tổng thể tích 40µl)

Mỗi phản ứng cắt này cũng được thực hiện ở 37oC, trong 3 giờ Sau mỗi phản ứng cắt, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt

c Tạo vector tái tổ hợp pET-PreS 1 -S 2 26

Đặt eppendorf 0,5ml vào một chậu nước đá, lần lượt hút các dung dịch sau

vào eppendorf: pET-28a /BamHI+EcoRI 0,5µl, preS 1 -S 2 26/BamHI+ EcoRI 1,5µl,

nước cất 15µl, đệm T4 DNA ligase 2µl, enzyme T4 DNA ligase 1µl (tổng thể tích 20µl) Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy ổn nhiệt trong 4 giờ, ở 160C Sau khi phản ứng nối kết thúc, thực hiện ngay bước biến nạp nhằm đưa sản phẩm nối vào

chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

3.7.8 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ E coli

a Chuẩn bị tế bào khả nạp

- Cấy 50µl E coli BL21(DE3) (dùng để biến nạp vector tái tổ hợp

pET-PreS1, pGEX-PreS1, pET-PreS1-S226) hoặc E coli BL21(DE3 plysS) (dùng để biến

nạp vector tái tổ hợp pGEX-PreS226) vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC

- Cho 200µl dịch tế bào trên vào một ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng mới, nuôi cấy lắc trong khoảng 2 giờ ở 37oC

- Thao tác vô trùng chuyển dịch tế bào này vào 5 eppendorf vô trùng, giữ lạnh trong hộp chứa đá trong 30 phút