c. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford
3.7.15. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
Sử dụng chuột cái 6 tuần tuổi được cung cấp bởi Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, khảo sát 3 con/lơ. Đối với lần tiêm đầu tiên, trộn Freund Complete Adjuvant (FCA) và dịch chứa kháng nguyên PreS1-S226 (đã tinh chế) theo tỉ lệ 1V:1V. Lượng kháng nguyên là 10µg/con, thể tích tiêm tối đa là 100µl/con. Sau 4
tuần, tiêm nhắc chuột với liều lượng tương tự nhưng thay FCA bằng Freund Incomplete Adjuvant (FIA). Sau 3 ngày, lấy máu chuột để kiểm tra. Sau 10 ngày, tiêm nhắc lần 2 với nồng độ kháng nguyên giảm ½ (5µg/con).
Máu chuột được thu vào eppendorf. Ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đĩ, ly tâm 3000 vịng/phút, 15 phút. Thu nhận huyết thanh ở phần dịch nổi.
3.7.16. Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng PreS1-S226 trong huyết
thanh chuột
Sự hiện diện của kháng thể kháng PreS1-S226 trong huyết thanh chuột đã được gây đáp ứng miễn dịch bằng PreS1-S226 được kiểm chứng bằng phương pháp ELISA theo nguyên tắc được trình bày trên Hình 11.
Huyết thanh thu nhận từ chuột được gây đáp ứng miễn dịch được bổ sung vào các giếng đã được phủ sẵn kháng nguyên PreS1-S226. Sau khi rửa giếng, chỉ những kháng thể bắt cặp chuyên biệt với kháng nguyên mục tiêu mới được giữ lại. Các kháng thể này cĩ nguồn gốc từ chuột nên được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp kháng phần Fc của chuột đánh dấu bằng HRP. Enzyme này sẽ chuyển hĩa cơ chất OPD tạo sản phẩm cĩ màu vàng. Cường độ màu được đo ở bước sĩng 492nm. Thí nghiệm được thực hiện song song với mẫu huyết thanh của chuột trước khi tiêm kháng nguyên để khẳng định kháng thể cĩ được sau khi tiêm kháng nguyên vào chuột, khơng phải bản thân chuột cĩ sẵn đĩ.
Tiến hành phủ mỗi giếng của microplate bằng 100µl kháng nguyên PreS1- S226 cĩ nồng độ 1µg/ml, ủ 4oC qua đêm hoặc 37oC, 2 giờ. Rửa giếng bằng PBST để loại bỏ các protein cịn dư, khơng gắn vào đĩa. Khĩa giếng bằng dung dịch sữa gầy 5%, 200µl/giếng ủ 37oC, 2 giờ. Rửa giếng. Bổ sung 100µl huyết thanh/giếng với độ pha lỗng khác nhau. Ủ 37oC, 1 giờ. Rửa giếng để loại bỏ hồn tồn huyết thanh và những thành phần khơng gắn vào giếng. Bổ sung 100µl/giếng kháng thể kháng kháng thể chuột được cộng hợp với enzyme HRP, ủ 37oC, 1 giờ. Rửa giếng. Bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch OPD (40µg/ml và H2O2 0,06%). Ủ trong tối 15-30 phút cho đến khi màu hiện ra và ổn định. Bổ sung 100µl H2SO4 2M vào từng giếng để ngừng phản ứng. Đọc kết quả ở bước sĩng 492nm.
3.7.17.Thu nhận và tinh chế kháng thể kháng PreS1-S226bằng cột protein G
Kháng thể chuột trong kháng huyết thanh đầu tiên được tủa bằng muối ammonium sulfate ở nồng độ 50%. Ở nồng độ này, protein được tủa chủ yếu là kháng thể, vì vậy cho phép loại bỏ bớt một lượng đáng kể các protein tạp hiện diện trong huyết thanh. Sau đĩ, kháng thể trong tủa được tiếp tục tinh chế qua cột protein G (một protein bề mặt tế bào vi khuẩn Streptococcus aureus chủng G148 cĩ ái lực cao với phần Fc của các kháng thể IgG).
Hình 11. Nguyên tắc phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PreS1-S226 trong huyết thanh chuột
(a) Phủ đĩa với kháng nguyên mục tiêu, (b) Bổ sung huyết thanh; (c) Bổ sung kháng thể kháng phần Fc của chuột; (d) Bổ sung cơ chất hiện màu
Tiến hành thu nhận và tinh chế kháng thể như sau:
Bổ sung 1ml ammonium sulfate bão hịa vào 1ml huyết thanh chuột để đạt nồng độ cuối cùng là 50%, ủ ở 4oC qua đêm. Ly tâm 3000g, 30 phút. Thu tủa, hịa trong 2ml (NH4)2SO4 50%. Ly tâm 3000g, 30 phút. Hịa tủa trong 2ml (NH4)2SO4
50%. Ly tâm 3000g, 30 phút. Thu tủa, hịa trong 4ml dung dịch gắn cột. Cân bằng cột với 5ml dung dịch gắn cột. Cho dung dịch chứa kháng thể qua cột. Thu nhận 1ml dịch qua cột. Rửa cột bằng 10ml dung dịch gắn cột để loại bỏ các thành phần khơng đặc hiệu. Thu 1ml dịch qua cột. Dung ly kháng thể bằng 5ml dung dịch dung ly. Bắt đầu thu nhận dịch qua cột vào các eppendorf cĩ chứa sẵn 200µl dung dịch trung hịa. Độ tinh sạch của kháng thể sau tinh chế được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Đo nồng độ kháng thể thu được bằng phương pháp Bradford.
3.7.18. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể kháng PreS1-S226bằng Sandwich
ELISA
Tính đặc hiệu của kháng thể kháng PreS1-S226 được kiểm chứng bằng phương pháp Sandwich ELISA để phát hiện kháng nguyên HBs trong mẫu huyết thanh đã được xác nhận âm tính và dương tính.
Kháng thể kháng PreS1-S226 sau tinh chế được sử dụng để phủ đĩa ELISA với nồng độ 500ng/ml, 100µl/giếng. Sau đĩ, bổ sung huyết thanh cần kiểm tra vào các giếng. HBsAg nếu hiện diện trong huyết thanh sẽ bị bắt giữ lại trong giếng. Sau đĩ, kháng thể đơn dịng từ chuột kháng HBsAg được bổ sung để gắn lên kháng nguyên HBs; tiếp theo, kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột cộng hợp với enzyme HRP được bổ sung để phát hiện sự hiện diện của phức hợp trên.
Các bước tiến hành như sau:
Phủ từng giếng bằng 100µl kháng thể kháng PreS1/S2(26) với nồng độ
Hình 12. Nguyên tắc kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể PreS1-S226 bằng phương pháp Sandwich ELISA
(a)Phủ đĩa với kháng thể PreS1-S226 sau tinh chế (b)Bổ sung huyết thanh chứa hoặc khơng chứa HBsAg (c)Bổ sung kháng thể đơn dịng (từ chuột) kháng HBsAg
(d) Bổ sung kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột cộng hợp với HRP (e) Bổ sung cơ chất hiện màu
500ng/ml, ủ 4oC qua đêm hoặc 37oC, 2 giờ. Rửa giếng bằng PBST để loại bỏ các kháng thể cịn dư, khơng gắn vào đĩa. Khĩa giếng bằng dung dịch sữa gầy 5%, 200µl/giếng ủ 37oC, 2 giờ. Rửa giếng. Bổ sung 100µl huyết thanh/giếng với độ pha lỗng khác nhau. Ủ 37oC, 1 giờ. Rửa giếng để loại bỏ hồn tồn huyết thanh và những thành phần khơng gắn vào giếng. Bổ sung 100µl kháng thể kháng PreS1/S2(26) với nồng độ 1µg/ml vào mỗi giếng. Ủ 37oC, 1 giờ. Bổ sung kháng thể kháng chuột 100µl/giếng ủ 37oC, 1 giờ. Rửa giếng. Bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch OPD (40µg/ml và H2O2 0,06%). Ủ trong tối 15-30 phút cho đến khi màu hiện ra và ổn định. Bổ sung 100µl H2SO4 2M vào từng giếng để ngừng phản ứng. Đọc kết quả ở bước sĩng 492nm.
3.8. KẾT QUẢ
3.8.1. Tạo dịng gen mã hĩa PreS1 và M
Gen mã hĩa PreS1 và M được nhân bản bằng phương pháp PCR dựa trên khuơn là DNA từ huyết thanh bệnh nhân cĩ kết quả xét nghiệm dương tính với anti-Hbs, mang HbsAg, với cặp mồi chuyên biệt tự thiết kế.
Đoạn gen mã hĩa cho PreS1 là vùng chứa 119 amino acid, cĩ kích thước 357bp. Đây là tồn bộ trình tự mã hĩa (ORF), chứa một codon khởi đầu dịch mã ATG nhưng khơng cĩ codon kết thúc (được bổ sung khi được tạo dịng vào vector biểu hiện).
Đoạn gen mã hĩa M được tạo dịng là đoạn chứa 281 axít amin (bao gồm 55 axít amin của PreS2 và 226 axít amin của S), cĩ kích thước 843bp.
Các sản phẩm PCR được tinh chế qua gel và nối bằng phương pháp nối đầu bằng vào vector pBluescript. Các vector tái tổ hợp được sàng lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh ampicilline và hoạt tính phân giải X-gal của enzyme β- galactosidase. Những khuẩn lạc trắng mọc được trên mơi trường LB cĩ bổ sung kháng sinh Amp là những khuẩn lạc dự kiến cĩ mang gen mục tiêu. Sau đĩ, tiến hành kiểm chứng các dịng dự kiến bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho từng gen tương ứng và phương pháp enzyme cắt giới hạn.
Kết quả phân tích bằng enzyme cắt giới hạn trên Hình 13 cho thấy vector tái tổ hợp pBlue-preS1 khi được cắt bằng hai enzyme BamHI và HindIII đã cho 2 vạch kích thước khoảng 2958bp (tương ứng với kích thước pBlue đã mở vịng) và 357bp của preS1 (giếng 6). Tương tự, vector tái tổ hợp pBlue-CF2 (mang gen m, tức là
preS2-S) khi được cắt bằng hai enzyme BamHI và EcoRI đã cho 2 vạch kích thước khoảng 2958bp (tương ứng với kích thước pBlue đã mở vịng) và 843bp của m
(giếng 6).
Các dịng mang gen preS1 và m được tách chiết, thu nhận plasmid và giải trình tự để xác định trình tự của gen. Trình tự gen được giải cĩ độ tương đồng cao (97% -99,8%) so với các trình tự được cơng bố trên ngân hàng gen (Hình 14, 15).
Hình 13. Kết quả phân tích các dịng mang gen PreS1 và gen M (CF2) bằng phương pháp enzyme cắt giới hạn
1, Thang l-HindIII; 2, Thang 100bp; 3, pBluescript; 4, pBluescript/EcoRV; 5, pBlue-PreS1; 6, pBlue-PreS1/BamHI+HindIII; 7, pBlue-CF2; 8, pBlue-CF2/BamHI+EcoRI PreS1; 6, pBlue-PreS1/BamHI+HindIII; 7, pBlue-CF2; 8, pBlue-CF2/BamHI+EcoRI
357 bp 843 bp 2958 bp 4361 bp 2322 bp Hình 14. Kết quả so sánh trình tự
plasmid tái tổ hợp pBlue-preS1 với trình tựđược cơng bố trên ngân hàng gen (AB07483911).