d. Kiểm tra trình tự nucleotide và axít amin của các dịng tái tổ hợp pGEX PreS 1 và pET-PreS1-S
3.8.6. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS
Đoạn peptid PreS226 tái tổ hợp được tổng hợp dưới dạng protein dung hợp với GST-PreS226 (Hình 30) bằng cách nuơi dịng BL21(DE3 plysS)/pGEX- PreS226 đến giai đoạn cuối của pha tăng trưởng hàm mũ và được cảm ứng bằng biểu hiện gen bằng IPTG. Sự biểu hiện PreS226 trong tế bào BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS226 được kiểm chứng bằng cách thu sinh khối, tạo dịch đồng nhất và phân tích sự hiện diện của GST-PreS226 bằng phương pháp SDS-PAGE và bằng Western blot với kháng thể kháng GST.
Kết quả điện di SDS-PAGE (Hình 31) cho thấy các mẫu dịch đồng nhất tế bào BL21(DE3 plysS) (giếng 2); BL21(DE3 plysS)/pGEX (giếng 3); BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS226 (giếng 5) khơng được cảm ứng biểu hiện gen bằng IPTG đều khơng cĩ sự hiện diện của vạch đậm tương ứng với GST (29kDa) hoặc GST- PreS226 (31kDa). Khi được cảm ứng bằng IPTG, trong tế bào E. coli pGEX/
1 2 3 1 2 3
Hình 29. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện của protein dung hợp
bằngWestern blot với kháng thể kháng His-Tag. A, SDS-PAGE; B, Western blot.
1, BL21(DE3)/pET43.1b(+), IPTG (+); 2, BL21(DE3)/pET-PreS1, IPTG (-); 3, BL21(DE3) /pET-PreS1, IPTG (+);
B A A
Gluththione S-transferase Ampr
MCS MCS PreS226 Promoter tac GST (29KDa) PreS226 NH2 COOH + IPTG
GST phía sau, làm sản xuất vượt mức protein GST (giếng 4), tạo một vạch to đậm cĩ trong lượng khoảng 29kDa. Trường hợp tế bào BL21(DE3 plysS)/pGEX- PreS226, khi được cảm ứng bằng IPTG (giếng 6), protein dung hợp GST-PreS226 đã được tổng hợp vượt mức thành một vạch protein to, đậm cĩ trọng lượng khoảng 31 KDa, là kích thước tính tĩan của protein dung hợp GST-PreS226.
Để khẳng định được vạch protein được tổng hợp vượt mức là GST-PreS226, chúng tơi tiến hành lai Western blot với kháng thể chuột kháng GST. Vạch lại được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp kháng kháng thể chuột (anti-mouse IgG) được đánh dấu bằng horseradish peroxidase. Sự phát sáng của vạch lai được ghi nhận bằng phim chuyên biệt. Kết quả lai Western Blot (Hình 32) cho thấy cĩ hai vạch lai trên phim cĩ vị trí tương ứng với vị trí của protein GST (giếng 4) và protein dung hợp GST-PreS226 (giếng 6) khi điện di trên gel SDS-PAGE.
Việc thực hiện kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE và phương pháp lai Western Blot đã cho phép khẳng định được sự biểu hiện của kháng nguyên PreS226 dưới dạng protein dung hợp GST-PreS226 trong tế bào E. coli BL21(DE3 plysS)/ pGEX-PreS226.
3.8.7. Tinh chế protein tái tổ hợp 6XHis-PreS1 và GST-PreS226
Protein 6XHis-PreS1 được tinh chế qua cột Ni-NTA theo nguyên tắc sắc ký ái lực chuyên biệt. Chủng Escherichia coli BL21(DE3) /pET-PreS1 được nuơi cấy và cảm ứng bằng IPTG 0,4mM trong 4 giờ. Từ 1000ml dịch nuơi cấy vi khuẩn đã thu được 4g sinh khối tươi. Sau khi tinh chế, 8 phân đoạn 3ml sau khi dung ly được điện di. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chỉ cĩ 4 phân đoạn đầu cĩ xuất hiện vạch cĩ kích thước bằng với kích thước của protein PreS1. Gộp các phân đoạn cĩ protein quan tâm, tủa protein với ammonium sulfat. Thay đổi nồng độ muối của dung dịch đệm bằng phương pháp thẩm tích. Thể tích cuối cùng là 3ml. Đo nồng
14,4 20,1 20,1 30 KDa 94 67
43 Hình 31. Kết quả phân tích sự biểu hiện PreS226 bằng điện di SDS-PAGE.