HindIII
Đầu tiên, tiến hành phản ứng cắt hạn chế bằng enzyme BamHI với tổng thể tích 40µl và thành phần như sau: gen preS1 7,5µl, đệm 10X BamHI+ 4µl, BamHI (10U/µl) 1,5µl, nước cất 27µl (tổng thể tích 40µl). Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC, trong vịng 3 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt bằng quy trình tinh chế sản phẩm PCR.
Thực hiện tiếp phản ứng cắt hạn chế với enzyme HindIII với tổng thể tích phản ứng là 40µl gồm: preS1/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, HindIII 1,5µl (tổng thể tích 40µl). Sau khi thực hiện phản ứng cắt xong (37oC, 3 giờ), tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm cắt theo quy trình tinh chế dành cho sản phẩm PCR, bảo quản mẫu ở 4oC trong dung dịch TE 1X để thực hiện tiếp những thí nghiệm tiếp theo.
Thực hiện tiếp phản ứng cắt hạn chế với enzyme HindIII với tổng thể tích phản ứng là 40µl gồm: preS1/BamHI 20µl, đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, HindIII 1,5µl (tổng thể tích 40µl). Sau khi thực hiện phản ứng cắt xong (37oC, 3 giờ), tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm cắt theo quy trình tinh chế dành cho sản phẩm PCR, bảo quản mẫu ở 4oC trong dung dịch TE 1X để thực hiện tiếp những thí nghiệm tiếp theo. đệm 10XK 4µl, nước cất 14,5µl, HindIII 1,5µl (tổng thể tích 40µl).
Mỗi phản ứng cắt này cũng được thực hiện ở 37oC, trong 3 giờ. Sau mỗi phản ứng cắt, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt.
c. Tạo vector tái tổ hợp pET- PreS1
Đặt eppendorf 0,5ml vào một chậu đá, lần lượt hút các dung dịch sau vào eppendorf: pET43.1b(+)/BamHI+HindIII 0,5µl, PreS1/BamHI+HindIII 1,5µl, nước cất 15µl, đệm T4 DNA ligase 2µl, enzyme T4 DNA ligase 1µl (tổng thể tích 20µl). Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy ổn nhiệt trong 4 giờ, ở 160C. Sau khi phản ứng nối kết thúc, thực hiện ngay bước biến nạp nhằm đưa sản phẩm nối vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3).
3.7.5.. Tạo vector tái tổ hợp pGEX-PreS1
Gen mã hĩa PreS1 và vector pGEX-2TK được xử lý bằng 2 enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI để tạo ra hai đầu cắt tương hợp với nhau theo qui trình được minh họa trên Hình 10.
a. Xử lý gen mã hĩa PreS1 lần lượt bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI EcoRI
Đầu tiên, tiến hành phản ứng cắt hạn chế bằng enzyme BamHI với tổng thể tích 40µl và thành phần như sau: preS1 7,5µl, đệm 10X BamHI+ 4µl, BamHI (10U/µl) 1,5µl, nước cất 27µl (tổng thể tích 40µl). Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC, trong vịng 3 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành tinh chế sản phẩm cắt bằng quy trình tinh chế sản phẩm PCR.