Đoạn gen mã hĩa PreS226 được nhân bản bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu chứa hai vị trí cắt của BamHI và EcoRIdựa trên khuơn là DNA của plasmid pBlue-CF2. Sản phẩm của phản ứng PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 1,5% cùng với thang chuẩn 100bp để xác định kích thước (Hình 19).
Ở giếng thứ 2, hai vạch tương ứng với 2 trạng thái tự nhiên của plasmid pB- CF2. Trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, một vạch kích thước khỏang 78bp tương ứng với kích thước của preS226, sản phẩm thu được cĩ kích thước 78bp khi so sánh với thang 100bp (giếng 4). Sản phẩm PCR này được tinh chế, sau đĩ
Hình 18. Kết quả phân tích vector pET- PreS1 bằng phương pháp PCR và cắt giới hạn
1, Thang 100bp; 2, preS1; 3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc; 4, pET-PreS1; 5, Sản phẩm PCR từ pET-PreS1; 6: pET43.1b(+) /BamHI+HindIII; 7, pET-PreS1/BamHI+ HindIII; 8, Thang λHindIII
xử lý 2 đầu bằng BamHI và EcoRI để tạo hai đầu dính để nối vào vector biểu hiện pGEX-2TK.
b. Tạo vector tái tổ hợp và tạo dịng E. coli biểu hiện PreS226
Thực hiện nối sản phẩm PCR preS226 đã được xử lý bằng BamHI và EcoRI với DNA của vector pGEX-2TK đã được xử lý bằng cùng hai enzym này. Vector tái hợp được ký hiệu là pGEX-PreS226. Tồn bộ sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3 plysS) bằng phương pháp hĩa biến nạp. Thể biến nạp được chọn lọc dựa trên mơi trường LB agar cĩ chứa ampicillin 50µg/ml. Chỉ các thể biến nạp chứa vector mới cĩ khả năng kháng kháng sinh và tạo khuẩn lạc trên mơi trường này. Kết quả sàng lọc thể biến nạp (Hình 20) cho thấy trên đĩa đối chứng (trãi tế bào BL21(DE3 plysS) khơng được biến nạp), vi khuẩn khơng phát triển trên mơi trường cĩ kháng sinh Amp. Ngược lại, trên đĩa biến nạp (trãi tế bào BL21(DE3 plysS) đã được biến nạp), nhiều khuẩn lạc của các thể biến nạp đã hình thành trên mơi trường LB cĩ Amp. Một số khuẩn lạc được chọn để kiểm chứng sự hiện diện của vector tái tổ hợp mang gen preS226 bằng phản ứng PCR khuẩn lạc. Các khuẩn lạc dương tính được nuơi cấy để thu nhận vector tái tổ hợp pGEX-PreS226 và phân tích kiểm chứng vector này.
Hình 20. Kết quả biến nạp vector pGEX-PreS226 vào BL21(DE3 plysS)
4361 2322 2322 2027
78bp
Hình 19. Kết quả nhân bản đoạn gen preS226 bằng PCR.
1, Thang λ HindIII; 2, pB-CF2; 3, Sản phẩm PCR preS226; 4, Thang 100bp
1, Đối chứng (BL21(DE3 pLysS), trên mơi trường LB/Amp); 2, Biến nạp (BL21(DE3 plysS) được biến nạp, trên mơi trường LB/Amp