Báo cáo y học: "phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan cấp tính bằng phản ứng RT-PCR" pot

phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan cấp tính bằng phản ứng RT-PCR Lê Thanh Hà* Hoàng Quang* Lê Thanh Hòa** Tóm tắt Từ 7 mẫu huyết thanh của bệnh nhân (BN) được chẩn đoán viêm gan, sử dụng phản ứng RT-PCR phát hiện hệ gen HCV và xác định 3 mẫu huyết thanh anti-HCV dương tính cho kết quả có ARN- HCV. Trong 7 mẫu huyết thanh BN viêm gan cấp tính, 3 mẫu xác định có virut viêm gan C thuộc nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae và 4 mẫu còn lại không chứa ARN-HCV. Qua đó cho thấy, ARN-HCV tồn tại trong huyết thanh cung cấp nguồn gen làm khuôn cho phương pháp RT-PCR, có thể sử dụng chẩn đoán sớm và phát hiện tái nhiễm. * Từ khoá: RT-PCT; Virut viêm gan C; ARN- HCV; Anti-HCV; Viêm gan cấp tính. Detection of hepatitis C virus in patients with acute hepatitis by RT-PCR Le Thanh Ha Hoang Quang Le Thanh Hoa Summary Of 7 plasma samples of patients with hepatitis, RNA- HVC were detected 3 positive anti-HCV plasma samples by RT-PCR and 4 samples were not. HCV in plasma samples belongs to Hepacivirus group of the family Flaviviridae. This finding showed that RNA-HCV exists in serum providing the RNA genomic source for RT-PCR to detect HCV for early diagnosis and re-infection of HCV. * Key words: RT-PCR; Hepatitis C virus; RNA- HCV; Anti-HCV; Acute hepatitis. Đặt vấn đề Nhiễm virut viêm gan C (HCV) là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư tế bào gan nguyên phát trên thế giới. Tỷ lệ nhiễm HCV ở Việt Nam có xu hướng ngày càng tăng, do hệ thống sàng lọc máu còn lạc hậu và số người tiêm chích ma túy dùng chung bơm kim tiêm ngày càng gia tăng [1, 2]. * Bệnh viện 103 ** Viện Công nghệ Sinh học Phản biện khoa học: GS. TS. Nguyễn Văn Mùi Hiện nay, nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để chẩn đoán HCV nhưng độ đặc hiệu chưa cao và chỉ phát hiện được bệnh ở giai đoạn muộn. Phản ứng RT-PCR đã giúp phát hiện HCV ở giai đoạn sớm, chính xác và đặc hiệu. Do hệ gen HCV là ARN, nên trước đó cần có phản ứng chuyển đổi ARN thành ADN gọi là sao chép ngược (RT), sau đó mới nhân vùng gen cần nghiên cứu bằng phản ứng PCR. Đây là một kỹ thuật xét nghiệm sử dụng sinh học phân tử nhạy và đặc hiệu, hỗ trợ đắc lực cho việc tiên lượng và đánh giá quá trình điều trị viêm gan C [3]. Phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới để phát hiện virut viêm gan nói chung và viêm gan C nói riêng [5, 6]. ở Việt Nam, việc áp dụng sinh học phân tử vào chẩn đoán bệnh viêm gan do virut còn rất hạn chế. Từ nhu cầu thực tiễn trên, đặc biệt đối với HCV, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sử dụng phản ứng RT-PCR phát hiện HCV trên BN viêm gan cấp tính. Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu kết quả thực hiện RT-PCR sử dụng vùng gen 5’UTR (untranscribed region), phát hiện HCV từ ARN- HCV tồn tại trong mẫu huyết thanh và khẳng định đây là một kỹ thuật xét nghiệm phân tử chính xác, có thể ứng dụng trong sàng lọc HCV ở các mẫu máu/huyết thanh. đối tượng và phương pháp nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu. ARN-HCV được tách từ 7 mẫu huyết thanh của 7 BN viêm gan cấp tính. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phương pháp tách ARN tổng số: Tách chiết ARN tổng số các mẫu bệnh phẩm virut viêm gan C có sử dụng bộ QiaAmp Viral Kit của hãng QIAGEN (Mỹ). Tách chiết ARN tổng số bằng bộ kit này ở nhiệt độ phòng 15 - 25 0 C. * Phương pháp tiến hành phản ứng RT- PCR: Phản ứng RT-PCR được sử dụng là phản ứng một bước (one-step RT-PCR) của hãng QIAGEN [4], với mồi xuôi ký hiệu CC1F, là 5’- CAGAAAGCGTCTAG CCATGG-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 69-88 ở phần đầu của hệ gen HCV; và mồi ngược CC2R là 5’- GAGGTTTAGGATTC GTGCTC-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 363- 344 ở phần đầu của hệ gen HCV. Sản phẩm đoạn ADN của vùng giao gen 5’ UTR và gen C của HCV có độ dài 295 bp. Nguyên liệu phản ứng RT-PCR. Dung môi phản ứng (2x reaction mix): 12,5ml; enzym sao chép ngược (RT- platinum): 1ml; mồi xuôi (10pmol/ml): 1,5ml; mồi ngược (10pmol/ml): 1,5ml; nước: 6,5ml; khuôn (ARN tổng số): 2ml Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR, bao gồm: Bước 1: 50 0 C trong 45 phút: 1 chu kỳ. Bước 2: 94 0 C trong 15 phút: 1 chu kỳ. Các bước 3, 4, 5 thực hiện lặp đi lặp lại trong 45 chu kỳ: Bước 3: 94 0 C trong 1 phút. Bước 4: 54 0 C trong 45 giây. Bước 5: 72 0 C trong 1 phút. Bước 6: 72 0 C trong 7 phút: 1 chu kỳ. Sau đó bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ lạnh 4 0 C. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR được phát hiện khi cho điện di trên thạch agarose 0,8%. kết quả và bàn luận 1. Kết quả thu thập mẫu. Thu thập 7 mẫu máu tách huyết thanh của BN viêm gan virut cấp tại Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện 103 và Khoa Vi sinh vật, Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội. Tất cả các BN này đều nhập viện với chẩn đoán là viêm gan cấp tính. Các mẫu huyết thanh được ký hiệu HC1, HC2, HC3, HC4, HC5, HC6, HC7. Bảng 1: Kết quả xác định các marker virut. HC1 HC2 HC3 HC4 HC5 Anti- HAV - - - - - HBsAg - - - - - Anti- HCV + + + - - * Chỉ có 3 mẫu cho kết quả dương tính. 2. Kết quả tách ARN tổng số từ huyết thanh BN. Lấy 3 mẫu HC1, HC2, HC3 có kết quả anti- HCV (+), tiến hành tách ARN tổng số. ARN tổng số là hỗn hợp các loại ARN, trong đó có thể có cả ARN của hệ gen HCV và sau khi tách được kiểm tra trên thạch agarose 0,8% (hình 1). Kết quả cho thấy cả 3 mẫu huyết thanh này đều chứa ARN tổng số, có thể sử dụng làm khuôn để tiến hành phản ứng RT-PCR. 23.0kb 0.5kb 2.3kb 4.3kb 9.4kb 2.0kb 6.5kb M 1 2 3 ARN tæng sè Hình 1: Kết quả điện di ARN tổng số trên thạch agarose 0,8%. M: Chỉ thị ADN (sử dụng hệ gen của thực khuẩn thể Lambda (l) cắt bằng enzym giới hạn HindIII). Đường chạy 1- 3: 3 mẫu ARN tổng số lần lượt tách từ huyết thanh của các BN HC1, HC2, HC3. 3. Kết quả thực hiện RT-PCR. Để xác định chuỗi ARN của HCV, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu là CC1F và CC2R. Tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi khi thực hiện phản ứng RT- PCR được Caudai và CS (1998) chứng minh rất cao [4]. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR cho thấy, 3 băng ADN có độ dài khoảng 300 bp hiển thị rõ trên thạch (hình 2), độ dài sản phẩm đúng như dự đoán. M 1 2 3 0.5kb 2.3kb 4.3kb 9.4kb 2.0kb 6.5kb 23.0kb ~300 bp [...]... c ARN c a virut HCV, do v y không phát hiện đư c bằng phản ứng RT-PCR (hình 3) Điều đó cho th y c sự tồn tại c ng l c của ARN-HCV ~ 300bp PCR đối với HCV c a 4 mẫu HC4, HC5, HC6, HC7 Hình 3: Kết quả điện di kết luận sản phẩm RT-PCR c a c c mẫu huyết thanh bệnh phẩm - Trong 7 mẫu huyết thanh c a BN viêm gan c p tính ở khu v c Hà (-): Đối chứng âm; M: chỉ thị phân tử AND (sử dụng hệ gen Lamda (l) c t... nucleotid c a mồi CC1F, CC2R và chu trình nhiệt) hoàn toàn đ c hiệu với HCV và cho kết quả chính thu tại Hà Nội chính th c đư c x c định là HCV x c 4 Kết quả giải trình thu c nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae trình tự Toàn bộ chuỗi 5 ứng dụng RT-PCR nucleotid c a đoạn ADN phát hiện HCV trên thu nhận từ c c mẫu một số mẫu huyết HC1, HC2, HC3 đư c thanh BN viêm gan c p giải trình trình tự bằng tính m y. .. đ c trình tự ABI Avant 3100 Sau khi x c định đư c Genetic quy trình kỹ thuật phát Analyzer (Mỹ) tại Viện hiện virut HCV bằng C ng nghệ Sinh h c Với sinh h c phân tử trên 3 kết quả truy c p Ngân mẫu đại diện, th c hiện hàng gen, ARN c a virut phản ứng RT-PCR trên 4 g y bệnh viêm gan c mẫu huyết thanh BN c n trong 3 mẫu huyết thanh lại c ng với đối chứng âm tính (-) (khuôn ARN và kháng thể anti-HCV... đư c thay bằng nư c tinh trong huyết thanh dương khiết) và đối chứng tính Phản ứng RT-PCR dương tính (+) (3 mẫu đã sử dụng nguồn khuôn x c định c chứa ARN- ARN-HCV trong huyết HCV) Kết quả điện di thanh c lợi để chẩn trên thạch agarose 0,8% đoán sớm và phát hiện cho th y 4 mẫu c n lại tái nhiễm HCV không cho sản phẩm RT- (-) M 1 2 3 4 5 6 7 PCR Như v y, 4 mẫu huyết thanh c phản ứng anti-HCV âm tính. ..3: C c sản phẩm RTPCR c độ dài khoảng 300 bp Với kết quả thu nhận đư c sau khi th c hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi cho rằng toàn bộ quy trình kỹ thuật c a Hình 2: Kết quả phản phản ứng RT-PCR đư c ứng PCR c a th c hiện với ARN tổng đoạn gen HCV số làm khuôn từ 3 mẫu trên (thành phần phản M: Chỉ thị ADN (sử dụng hệ gen Lambda (l) c t bằng enzym giới hạn HindIII); Đường ch y 1- ứng, trình tự nucleotid... c t bằng enzym giới hạn HindIII); Đường ch y 1-3: Đối chứng dương; Đường ch y 4-7: Kiểm tra sản phẩm RT- Nội c 3 mẫu (HC1, HC2, HC3) chứa virut (thu c nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae) - C thể sử dụng c p mồi nhiễm HCV tại Thành CC1F-CC2R, cho sản phố Hà Nội, Luận án phẩm khoảng 300 bp, Tiến sỹ Y h c, Hà Nội, thành phần phản ứng và 2004 chu trình nhiệt c a phản ứng 2 Bùi Đại Viêm gan RT-PCR... tần c thể làm ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tinh trùng c trên động vật th c nghiệm và người B c xạ siêu cao tần t c động đến quá trình sinh tinh trùng bằng c chế tr c tiếp qua t c dụng nhiệt ho c cơ chế gián tiếp thông qua tuyến y n, g y rối loạn quá trình sản xuất hormon LH, FSH, c c hormon n y t c dụng lên c c tế bào dòng tinh [5] 4.3 Thăm dò t c dụng c a thu c mediphylamin đến sự hồi ph c. .. trong virut B và D Nhà xuất nghiên c u n y để x y bản Y h c, Hà Nội, dựng kit chẩn đoán phân 2002, tr 12-269 tử HCV từ khuôn HCVARN c trong huyết thanh BN một c ch chính x c và đ c hiệu 3 Lê Thanh Hòa Sinh h c phân tử: Nguyên lý và ứng dụng Tài liệu giảng d y sau Đại h c Viện C ng nghệ Sinh tài liệu tham khảo h c, 2003, tr 72-82 4 Caudai C, Padula 1 Trần Thanh Dương MG, Bettini V, Valensin Dịch tễ h c. .. siêu c u tr c qua kính hiển vi điện tử tinh trùng người, th y nhiều tinh trùng dị dạng Đ c biệt dị dạng ở đầu (ảnh 3, 4) Đầu tinh trùng nhăn nhúm (ảnh 3), c n c hai nhân, màng tế bào nhiều bào tương (ảnh 4) 3 2 1 ảnh 3, 4: Siêu c u tr c đầu tinh trùng người c hình dạng bất thường Đầu c nhân (1) chia thuỳ, bào tương rộng (2, 3) x 10.000 Tạp chí y dư c h c quân sự số 1-2007 Như v y, b c xạ siêu cao... tử PE Detection of HCV and GBV -C/ HGV Swiss Med WKLY, infection by multiplex 2001, 131: 291–298 PCR in plasma samples 6 Liang T, Leonard B, of transfused subjects, J Hoofnagle JH, et al Virological Methods, Pathogenesis, natural 1998, 70: 79–83 history, treatment and 5 Blum HE, prevention of hepatitis C Moradpour D, Cerny A, Ann Inter Med., 2000, Markus H Heim MH 132 4: 296-305 Hepatitis C: An update . thanh c a c c BN HC1, HC2, HC3. 3. Kết quả th c hiện RT-PCR. Để x c định chuỗi ARN c a HCV, chúng tôi sử dụng c p mồi đ c hiệu là CC1F và CC2R. Tính đ c hiệu và độ nh y c a c p mồi. phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan c p tính bằng phản ứng RT-PCR Lê Thanh Hà* Hoàng Quang* Lê Thanh Hòa** Tóm tắt Từ 7 mẫu huyết thanh c a bệnh nhân (BN) đư c chẩn đoán viêm. mẫu huyết thanh BN viêm gan c p tính. Sau khi x c định đư c quy trình kỹ thuật phát hiện virut HCV bằng sinh h c phân tử trên 3 mẫu đại diện, th c hiện phản ứng RT-PCR trên 4 mẫu huyết