BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE" pot

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Nguyễn Tùng Lâm Trường Đại học Ngoại Thương ĐẶT VẤN ĐỀ Haemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong những bệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X. Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000 các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Theo số liệu thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương số lượng bệnh nhân Haemophilia A ở Việt nam cũng không phải là nhỏ. Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Haemophilia A là do các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII (factor VIII). Gen này nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể tại vị trí Xq28. Gen mã hoá cho yếu tố VIII rất lớn (khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon (1). Kỹ thuật PCR dùng Taq ADN polymerase, sau đó phát hiện điểm đột biến bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứu trước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biến của bệnh Haemophilia A(1, 2). Deep Vent ADN polymerase có hoạt tính xúc tác quá trình tổng hợp ADN mới như Taq ADN polymerase. Các nghiên cứu của hãng New England Biolab cho thấy Deep Vent ADN polymerase có nhiều ưu điểm hơn so với Taq ADN polymerase. Ở 95 o C, Taq ADN polymerase bị mất 50% hoạt tính xúc tác sau 40 phút so với 1380 phút cùng điều kiện của Deep Vent ADN polymerase. Deep Vent ADN polymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi ADN mới so với Taq ADN polymerase (3, 4). Những đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là đột biến mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I và Hind III(1, 2). Do vậy, độ chính xác của các sản phẩm PCR so với khuôn mẫu ADN ban đầu rất quan trọng, nó đảm bảo kết quả chẩn đoán phát hiện đột biến ở bệnh nhân Haemophilia A. Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn sử dụng ưu điểm ít gây lỗi trong quá trình xúc tác của Deep Vent ADN polymerase để sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII. Kỹ thuật này có thể ứng dụng để phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chuẩn đoán sớm trước sinh bệnh Haemophilia, phục vụ chương trình chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 19 mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A do Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp. 25 mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Taq ADN polymerase, Deep Vent ADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs (Mỹ). Các hoá chất khác sử dụng cho nghiên cứu này đều của các hãng Sigma, Merck, Promega… Phương pháp nghiên cứu • Tách chiết ADN từ máu được cải tiến theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (5). • Phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq ADN polymerase, với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIII được tiến hành theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự (2). • Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIII, sử dụng enzyme Deep Vent được tối ưu theo theo phương pháp nghiên cứu được mô tả bởi Nguyễn Hoài Giang và các đồng tác giả (6). • Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Bcl I và Hind III theo thường qui chuẩn của hãng New England Biolabs (4). • Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (5). KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 1. Phát hiện đột biến ở intron 18 của gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII 0,5 ml của 44 mẫu máu (19 mẫu của bệnh nhân Haemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻ mạnh) được tách chiết ADN bằng đệm phân giải, đệm phân giải nhân, proteinase K và kết tủa ADN bằng isopropanol, theo phương pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự (5). Kết quả đo OD ở bước sóng 260 nm cho thấy tất cả các mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến hành phản ứng PCR. Sủ dụng điều kiện PCR dùng Taq ADN polymerase cho cặp mồi của intron 18, gen mã hoá yếu tố VIII theo Kogan và cộng sự (30 chu kỳ với 94 o C-1 phút, 45 o C-1 phút, 72 o C -1 phút), chúng tôi đã thành công trong việc khuyếch đại intron này từ các mẫu ADN của người khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia A (giếng 1 , Hình 1). Theo nghiên cứu của hãng New England biolabs và kinh nghiệm của chúng tôi về Deep Vent ADN polymerase (4, 6), điều kiện PCR với Deep Vent ADN polymerase cho cặp mồi của intron 18 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94 o C-30 giây, 50 o C-20 giây, 72 o C-20 giây; 2 mM Mg 2+ ; 200 àM dNTPs. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide 6% cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 có kích thước 142 bp ở cả người bình thường khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia, giống như kết quả của Kogan và cộng sự (giếng 1 đến 3, Hình 1). Theo nghiên cứu trước đây (1, 2), đột biến ở intron 18 sẽ làm thay đổi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những bệnh nhân Haemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme Bcl I (giếng 5, Hình 1). Ngược lại những người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân Haemophilia A không có đột biến ở intron 18 sẽ bị enzyme giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 băng kích thước 99 và 43 bp (giếng 4, Hình 1). Trong số 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với enzyme Bcl I ở 50 o C sau 12 giờ. Trong số 19 mẫu bệnh nhân Haemophilia A có 8 mẫu không bị cắt và 11 mẫu bị cắt bởi enzyme Bcl I ở 50 o C sau 12 giờ. Kết quả này cho thấy có 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố VIII. Hình 1. PCR-RFLP với intron 18 (Haemophilia A). Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh). Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh). Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A). Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 2) sau khi cắt bằng enzyme Bcl I. Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng enzyme Bcl I. Mr: Thang ADN chuẩn - 100bp (New England Biolabs). 2. Phát hiện đột biến ở intron 19 của gen mã hoá yếu tố đông máu số VIII Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng sự là 30 chu kỳ với 94 o C-1 phút, 55 o C-1 phút, 70 o C-3 phút; chúng tôi cũng đã thành công trong việc khuyếch đại intron này bằng Taq ADN polymerase (giếng 1, Hình 2). Tương tự với intron 18, điều kiện PCR với Deep Vent ADN polymerase cho cặp mồi của intron 19 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94 o C-30 giây, 57 o C-20 giây, 72 o C-40 giây và sản phẩm PCR có kích thước 730 bp. Loại trừ 8 mẫu đã phát hiện được mang đột biến ở intron 18, 11 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu cho intron 19 với Deep Vent ADN polymerase theo điều kiện PCR đã được tối ưu hoá như trên (giếng 3 và 5, Hình 2). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ rõ đột biến ở intron 19 sẽ làm thay đổi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III (1, 2). Nghĩa là những bệnh nhân Haemophilia A có đột biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme Hind III. Ngược lại những người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân Haemophilia A không có đột biến ở intron 19 sẽ có một hoặc hai vị trí nhận biết đặc hiệu với enzyme giới hạn Hind III cắt tạo ra 2 băng kích thước 480 và 250 bp hoặc 3 băng kích thước 480, 160 và 90 bp (1, 2). Tất cả các mẫu bệnh nhân Haemophilia A (11/11 hay 100%) đem nghiên cứu, đều bị cắt bởi enzyme Hind III ở 37oC sau 12 giờ (giếng 2, 4 và 6, Hình 2). Kết quả nghiên cứu trên 11 bệnh nhân Haemophilia A cho thấy không phát hiện được đột biến ở intron 19 gen mã hoá cho yếu tố VIII. Kết quả này có thể được giải thích là do đột biến ở intron 19 không phổ biến ở bệnh nhân Haemophilia A của Việt nam hoặc chúng tôi cần tăng số mẫu nghiên cứu lên nhiều hơn nữa. [...]... PCR-RFLP technique with Deep Vent DNA polymerase to detect the mutations in introns 18 and 19 of factor VIII gene from Vietnamese haemophilia A patients Our data showed that 8/19 (42%) patients have the mutation in intron 18 and none of them has the mutation in intron 19 This method can be used for carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A Người thẩm định nội dung khoa học: GS.TS Lê Đình... Vent DNA polymerase gene of Pyrococcus species GB-D The native organism was isolated from a submarine thermal vent at 2010 meters and it able to grow at temperature as high as 104oC Deep Vent DNA polymerase is a high-fidelity thermophilic DNA polymerase The fidelity of Deep Vent DNA polymerase is derived in part from an integral 3’-5’ proofreading exonuclease activity In this study, we applied the PCR-RFLP. .. bằng kỹ thuật PCR-RFLP với Deep Vent ADN polymerase • 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố VII và không có mẫu nào mang đột biến ở intron 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Bowen DJ (2002) Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights Mol Pathol 55:1-8 2 Kogan SC, Doherty M and Gitschier J (1987) An improved method of prenatal diagnosis... SUMMARY Detection of mutations (in Introns 18 and 19) from haemophilia patients by PCR-RFLP with DEEP VENT DNA POLYMERASE Haemophilia A is an X-linked recessive genetic disorder caused by the mutations in the factor VIII gene The incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000 males births The changes of factor VIII gene are the points mutations and inversion mutation in intron 22 Genetics analysis... in haemophilia A families is widely carried out by linkage analysis by allelotyping using restriction fragment length polymorphism (RFLP) and microsatellite repeat (STR) markers to track chromosomes linked with the disease PCR-RFLP is a fast and convenient method to detect the mutations in the factor VIII gene Deep Vent DNA polymerase is purified from the strain of E.coli that carries the Deep Vent. .. nenetics disease by analysis of amplified DNA sequences-application to haemophilia A N Engl J Med 317:985-990 3 Rolfs AI Schuller U Finckh I Weber-Rolfs (1992) PCR: Clinical Diagnostics and Research Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 4 Catalog and Technique Reference 2000-2001 New England Biolab 5 Sambrook J, Frisch EF, and Maniatis T (1989) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 6 Nguyễn... sau khi cắt bằng enzyme Hind III Giếng 5: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu c a bệnh nhân Haemophilia A) Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 5) sau khi cắt bằng enzyme Hind III Mr: Thang ADN chuẩn 100bp KẾT LUẬN • Hình thành được qui trình phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 c a gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh Haemophilia A bằng kỹ. ..Hình 2 PCR-RFLP với intron 19 (Haemophilia A) Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu c a người bình thường khoẻ mạnh) Giếng 2: Sản phẩm PCR (ở giếng 1) sau khi cắt bằng enzyme giới hạn Hind III Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu c a người bình thường... Harbor Laboratory Press, USA 6 Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Phúc, Lê Thị Kim Tuyến (2002) Tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR sử dụng Deep vent ADN polymerase để khuyếch đại gen NS4 c a virút hepatitis C Tạp chí Nghiên cứu Y học 1: 9-11 LỜI CẢM ƠN Các tác giả xin cảm ơn Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương đã cung cấp các mẫu máu c a bệnh nhân Haemophilia A Các tác giả cũng xin cảm ơn TS Nguyễn Hạnh . phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 c a gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh Haemophilia A bằng kỹ thuật PCR-RFLP với Deep Vent ADN polymerase. • 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được. c a Deep Vent ADN polymerase để sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 c a gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII. Kỹ thuật này có thể ứng dụng để phát hiện các. phát hiện điểm đột biến bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứu trước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biến c a bệnh Haemophilia A( 1, 2). Deep Vent ADN polymerase