PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE potx

TCNCYH 38 (5) - 2005 PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE Nguyễn Hoài Giang 1 , Nguyễn Hạnh Phúc 1 Phạm Quang Vinh 2 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương t 2 Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Bệnh Hemophilia A liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII. Vent ADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp ADN mới chính xác hơn so với Taq ADN polymerase. Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP. Phương pháp: Phản ứng chuỗi PCR và cắt enzyme giới hạn RFLP. Kết quả: Phát hiện được 16 trên 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có đột biến ở intron 18. Cũng trong số bệnh nhân này, chúng tôi chưa phát hiện được trường hợp nào mang đột biến ở intron 19. Kết luận: Hình thành được qui trình phát hiện đột biến Hemophilia A bằng PCR - RFLP. Qui trình có thể ứng dụng để phá hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chẩn đoán sớm trước sinh bệnh Hemophilia A. Từ khóa: Hemophilia A, PCR, RFLP, Vent ADN polymerase I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hemophilia (bệnh ưa chảy máu) bao gồm các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII (Hemophilia A) và ở gen của yếu tố IX (Hemophilia B). Hemophilia A là bệnh di truyền liên quan đến nhiễm sắc thể X. Ước tính có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000 các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể tại vị trí Xq28. Gen này rất lớn (khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon [2]. Các đột biến của gen mã hoá cho yếu tố VIII được phát hiện một cách nhanh chóng và chính xác bằng kỹ thuật PCR kết hợp với phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism [2, 4]. Cũng giống như Taq ADN polymerase, một enzyme polymerase được dùng phổ biến trong kỹ thuật PCR, Vent ADN polymerase cũng có khả năng xúc tác tổng hợp các sợi ADN mới. Các nghiên cứu cho thấy Vent ADN polymerase có nhiều ưu điểm vượt trội so với Taq ADN polymerase [5]. Vent ADN polymerase bị mất 50% hoạt tính xúc tác sau 130 phút ở 97,5 o C, so với 10 phút của Taq ADN polymerase. Tốc độ tổng hợp sợi ADN mới của Vent ADN polymerase (trên 80 nucleotide/giây) cũng nhanh hơn so với Taq ADN polymerase (75 nucleotide/giây). Vent ADN polymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi ADN mới (1/31.000) so với Taq ADN polymerase (1/290 đến 1/2.400) [3, 5]. Những đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là đột biến mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I và Hind III [2, 4]. Do vậy, độ chính xác của các sản phẩm PCR so với khuôn mẫu ADN ban đầu rất quan trọng, nó đảm bảo kết quả chẩn đoán phát hiện đột biến ở bệnh nhân Hemophilia A. Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng Các mẫu máu của bệnh nhân Hemophilia A (29 mẫu) được cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. Các mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh (25 mẫu) được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Các enzyme Taq ADN polymerase, Vent ADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và thang ADN chuẩn 100bp sử dụng cho nghiên cứu này là của hãng New England Biolabs (Mỹ). 2. Phương pháp nghiên cứu - Tách chiết ADN từ các mẫu máu của bệ nh nhân Hemophilia A và người bình thường khoẻ mạnh được cải tiến theo phương pháp của Sambrook và cộng sự [6]. 1 TCNCYH 38 (5) - 2005 - Cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 (18F và 18R) và intron 19 (19F và 19R) của gen mã hoá yếu tố VIII được tiến hành phản ứng PCR với Taq ADN polymerase theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự [4]. Trình tự của các cặp mồi là 18F: 5’-TAA AAG CTT TAA ATG GTC TAG GC-3’ 18R: 5’-TTC GAA TTC TGA AAT TAT CTT GTT C-3’ 19F: 5’-AAG GTC CTC GAG GGC GAG CAT-3’ 19R: 5’-AAG GTC GGA TCC GTC CAG AAG-3’ - Phản ứng PCR với Vent ADN polymerase và các cặp mồi 18F - 18R; 19F - 19R được tối ưu theo nghiên cứu của Nguyễn Hoài Giang và cộng sự [1]. - Sản phẩm PCR với cặp mồi 18F và 18R được ủ cùng enzyme giới hạn Bcl I ở 50 o C trong 12 giờ. Sản phẩm PCR với cặp mồi 19F và 19R được ủ cùng enzyme giới hạn Hind III ở 37 o C trong 12 giờ [4]. - Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự [6]. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu tố đông máu số VIII Tất cả các mẫu máu (29 mẫu của bệnh nhân Hemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻ mạnh) được tách chiết ADN theo phương pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự [6]. Kết quả đo OD ở bước sóng 260nm cho thấy tất cả các mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến hành phản ứng PCR. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với Taq ADN polymerase và cặp mồi 18F và 18R theo các thông số đã được tối ưu bởi Kogan và cộng sự. Tiếp theo để sử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP phát hiện các đột biến của bệnh Hemophilia A, chúng tôi tiến hành tối ưu hoá điều kiện cho PCR với enzyme này. Sử dụng số liệu của hãng New England Biolabs và kinh nghiệm dùng Vent ADN polymerase trong nghiên cứu trước của chúng tôi [1, 3], điều kiệ n PCR với enzyme này sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94 o C – 30 giây, 50 o C - 20 giây, 72 o C - 20 giây; 2 mM Mg 2+ ; 200 µM dNTPs. Trên gel polyacrylamide, sản phẩm PCR sử dụng Vent ADN polymerase với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 có kích thước 142bp ở cả người bình thường khoẻ mạnh và bệnh nhân Hemophilia, cũng như khi sử dụng Taq ADN polymerase (giếng 1 đến 3, hình 1). Trong số 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh khi sử dụng kỹ thuật PCR - RFLP với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với enzyme Bcl I ở 50 o C sau 12 giờ. Với 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có 13 mẫu không bị cắt và 16 mẫu bị cắt bởi enzyme Bcl I ở 50 o C sau 12 giờ. Kết quả này cho thấy có 16/29 (55%) số bệnh nhân Hemophilia A được nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố VIII. 2 TCNCYH 38 (5) - 2005 Hình 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu tố VIII ở người bình thường và bệnh nhân Hemophilia A . . t Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ mạnh) Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ mạnh) Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được ách chiết từ máu của bệnh nhân Hemophilia A). Giếng 4: Sản phẩ m PCR (ở giếng 1) sau khi cắt bằng enzyme giới hạn Bcl I. Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 2) sau khi cắt bằng enzyme Bcl I. Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng enzyme Bcl I. Mr: Thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs. 2. PCR - RFLP với Intron 19 của gen yếu tố đông máu số VIII Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng sự là 30 chu kỳ với 94 o C - 1 phút, 55 o C - 1 phút, 70 o C - 3 phút; chúng tôi cũng đã thành công trong việc khuyếch đại intron này bằng Taq ADN polymerase và cặp mồi 19F - 19R (giếng 1, hình 2). Tương tự như với intron 18, điều kiện PCR với Vent ADN polymerase cho cặp mồi 19F và 19R sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94 o C - 30 giây, 57 o C - 20 giây, 72 o C - 40 giây và sản phẩm PCR có kích thước 730bp. Loại trừ 16 mẫu đã phát hiện được mang đột biến ở intron 18, 13 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi 19F và 19R với Vent ADN polymerase theo điều kiện PCR đã được tối ưu hoá như trên (giếng 1 đến 4, hình 2). Tất cả các mẫu bệnh nhân Hemophilia A (13/13) và các mẫu của người bình thường khoẻ m ạnh (25/25) đem nghiên cứu, đều bị cắt bởi enzyme Hind III ở 37 o C sau 12 giờ (giếng 5 và 6, hình 2). Nghĩa là, không có bệnh nhân nào trong số 13 bệnh nhân Hemophilia A được nghiên cứu có đột biến ở intron 19 gen mã hoá cho yếu tố VIII. 3 TCNCYH 38 (5) - 2005 Hình 2. PCR - RFLP với intron 19 của người bình thường và bệnh nhân Hemophilia A Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq ADN polymerase. (ADN khuôn được tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ mạnh) . . . Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu của bệnh nhân Hemophilia A). Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ mạnh) Giếng 4: Sản phẩ m PCR được khuyếch đại với enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ máu của bệnh nhân Haemophilia A) Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng enzyme giới hạn Hind III. Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 4) sau khi cắt bằng enzyme Hind III. Mr: Thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs. IV. BÀN LUẬN 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu tố đông máu số VIII Việc khuyếch đại intron 18 bằng kỹ thuật PCR với Taq ADN polymerase bằng cặp mồi 18F và 18R được tiến hành theo điều kiện PCR của Kogan và cộng sự (30 chu kỳ: 94 o C - 1 phút, 45 o C - 1 phút, 72 o C - 1 phút). Kết quả điện di trên gel polyacrylamide (6%) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi 18F và 18R có kích thước 142bp, giống như kết quả của Kogan và cộng sự đã công bố [4]. Kết quả của các nghiên cứu trước đây về đột biến gen của bệnh Haemophilia cũng đã chỉ rõ [2, 4], đột biến ở intron 18 sẽ làm mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những b ệnh nhân Hemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme Bcl I (giếng 6, hình 1). Ngược lại những người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân Hemophilia A không có đột biến ở intron 18 sẽ bị enzyme giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 băng kích thước 99 và 43 bp (giếng 4, 5, hình 1). Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên 29 mẫu của bệ nh nhân Hemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻ mạnh. Kết quả tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR với intron 18 cho thấy, Vent ADN polymerase cho phép nâng cao nhiệt độ gắn mồi (50 o C) hơn so với sử dụng Taq ADN polymerase (45 o C). Yếu tố này có lẽ cũng góp phần tạo ra sản phẩm PCR đặc hiệu ít lỗi hơn của Taq ADN polymerase [3, 5]. 2. PCR - RFLP với intron 19 của gen yếu tố đông máu số VIII Tương tự như trường hợp khuyếch đại intron 18 bằng Vent ADN polymerase, intron 19 cũng được khuyếch đại thành công bằng enzym này. Các nghiên cứu về đột biến gen của bệnh 4 TCNCYH 38 (5) - 2005 Haemophilia cho thấy đột biến ở intron 19 sẽ làm mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III [2, 4]. Nghĩa là những bệnh nhân Hemophilia A có đột biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme Hind III. Ngược lại những người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân Hemophilia A không có đột biến ở intron 19 sẽ có một hoặc hai vị trí nhận biết đặc hiệ u với enzyme giới hạn Hind III cắt tạo ra 2 băng kích thước 480 và 250bp hoặc 3 băng kích thước 480, 160 và 90bp [2, 4]. Điều này cũng phù hợp với quan sát của chúng tôi trên 13 mẫu bệnh nhân và 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh. Kết quả chưa phát hiện được bệnh nhân mang đột biến ở intron 19 có thể được giải thích là do đột biến ở intron 19 không phổ biến của bệnh nhân Hemophilia A ở Việt Nam hoặc số mẫu nghiên cứu cần được tăng lên nhiều hơn nữa. V. KẾT LUẬN 1. Hình thành được qui trình phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR - RFLP với Vent ADN polymerase. 2. 16/29 (55%) số bệnh nhân Hemophilia A được nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố VIII và không có mẫu nào mang đột biến ở intron 19. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Phúc, Lê Thị Kim Tuyến. (2001). Tối ưu hoá điều kiện PCR để khuyếch đại các alen D1S80 (pMCT118) bằng Vent DNA polymerase. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 3: 20 - 23. 2. Bowen DJ. (2002). Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights. Mol. Pathol. 55: 1 - 8. Catalog and Technique Reference 2005 - 2006. New England Biolab. 3. Kogan SC, Doherty M and Gitschier J (1987). An improved method of prenatal diagnosis of genetics disease by analysis of amplified DNA sequences - application to haemophilia A. N. Engl. J. Med. 317: 985 - 990. 4. Sambrook J, Frisch EF, and Maniatis T. (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. 5. Rolfs AI. Schuller U. Finckh I. Weber - Rolfs (1992). PCR: Clinical Diagnostics and Research. Springer - Verlag Berlin, Heidelberg. Summary DETERMINATION THE MUTATIONS OF HAEMOPHILIA A BY PCR - RFLP WITH VENT DNA POLYMERASE Haemophilia A is an X - linked recessive genetic disorder caused by the mutations in the factor VIII gene. The incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000 males births. Vent DNA polymerase is a high - fidelity thermophilic DNA polymerase. Compared to Taq DNA polymerase, which has a fidelity of 1/290 - 1/2,400, that of Vent DNA polymerase appears to be 5 - 15 times higher (1/31,000). Objectives: Determination the mutations of Haemophilia A by PCR - RFLP with Vent DNA polymerase. Methods: PCR and RFLP. Results: 16/29 (55%) of the Haemophilia A patients has the mutation in intron 18 of factor VIII gene and none of them has the mutation in intron 19. Conclusion: PCR - RFLP are the sensitive tools for detection of mutations and these methods can be used for carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A. Keywords: Haemophilia A, PCR, RFLP, Vent DNA polymerase. 5 . GTT C-3’ 19F: 5’-AAG GTC CTC GAG GGC GAG CAT-3’ 19R: 5’-AAG GTC GGA TCC GTC CAG AAG-3’ - Phản ứng PCR với Vent ADN polymerase và các cặp mồi 18F - 18R;. (5) - 2005 PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE Nguyễn Hoài Giang 1 , Nguyễn Hạnh Phúc 1 Phạm Quang