BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI." pot

BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI. Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea MỞ ĐẦU Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride ở giao diện cơ chất và nước [1] và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến dầu, chuyển hóa sinh học, và đồng phân nhờ một số đặc tính như đặc hiệu cơ chất, vị trí, chọn lọc đồng phân, bền nhiệt và kiềm [2]. Lipase vi khuẩn Family I được chia thành 7 Subfamily dựa vào mức độ tương đồng trình tự amino acid [2]. Lipase Subfamily I.1 (P. aeruginosa [3, 4], Acinetobacter sp. [5, 6], P. fragi [7], etc), và I.2 (B. glumae [8], B. cepacia [9], C. viscosum [10], P. luteola [11], Ralstonia sp. M1 [12], etc) có độ tương đồng trình tự amino acid cao (>33%) [13] và hầu hết chúng còn có một đặc điểm chung khác là gene lipase luôn luôn gắn kết với gene thứ hai nằm ngay sau [3- 5, 9, 12, 14] hoặc trước gene lipase [6]. Gene thứ hai mã hóa một protein được gọi là lipase-specific foldase (modulator, activator, helper protein, hoặc chaperone) cần thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào. Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 đã được nhân dòng, phân tích và xác định thuộc họ phụ I.2 Burkholderia lipase/chaperone [12]. Trong bài báo này, chúng tôi biểu hiện năng suất cao lipase hoàn thiện LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở E. coli BL21 dưới sự điều khiển của T7 promoter. Cả hai protein được tinh sạch và lipase được hoạt hóa với chaperone. Một số tính chất hóa lý của lipase tái tổ hợp được nghiên cứu. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Dầu olive được mua của Sigma (Mỹ), Bacto-tryptone và cao nấm men của Difco (Korea). Enzyme hạn chế, CIAP, T4 ligase do Roche (Korea) cung cấp. DNA Gel-Extraction Kit và Ni-NTA-matrice được mua của QIAGEN, PCR mix và Minipreps của Bioner (Korea). Hình. 1. Các plasmid biểu hiện pELipAB và pELipB dẫn xuất từ vector biểu hiện pET22b+ cho hệ E. coli BL21. Phân đoạn chèn và điểm cắt hạn chế sử dụng để nhân dòng trên hình. T7Pro, T7 promoter; PelB, PelB signal peptide; LipA, lipase hoàn thiện; His, đuôi 6-histidine; T7Ter, T7 terminator; (LipB, 56aa chaperone cắt 56aa; LipB, chaperone hoàn chỉnh. Hai plasmid pELipAB và pELipB (Hình 1) được thiết kế trước đây [12] dẫn xuất từ pET22b+ vector dưới sự kiểm soát của T7 promoter được sử dụng để biểu hiện cao lần lượt lipase LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở Escherichia coli BL21 (DE3). E. coli BL21 được nuôi cấy trong môi trường LB với ampicillin (nồng độ cuối cùng 100 (g/ml) ở 37(C. Hai trăm ml LB chứa 200 (l ampicillin (100 mg/ml) được chủng với 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm và nuôi cấy ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cho tới khi OD600nm đạt 0,6, sau đó cảm ứng với 200 (l IPTG (100 mM). Dịch nuôi cấy được ủ ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cảm ứng. Tế bào tươi được thu nhận bằng ly tâm ở 6,000 rpm trong 10 phút ở 4°C, được sử dụng tinh sạch protein hoặc bảo quản ở -20°C để tinh sạch sau. Chaperone (LipBhis được biểu hiện ở E. coli pELipB dưới dạng hòa mang đuôi 6-his được tinh sạch bằng kit Ni-NTA (QIAGEN). Lipase LipA được biểu hiện dưới dạng thể vùi. Để tinh sạch LipA, tủa 50 ml dịnh nuôi cấy được siêu âm (3x 1 phút, nghỉ 1 phút) trong 1 ml đệm 5 mM imidazole (pH 8,0) và dịch tế bào được ly tâm 15 phút ở 4(C tại 12,000 rpm. Qui trình được lặp lại tối thiểu 5 lần cho tới khi tủa tế bào đồng nhất với một pha trắng. Tủa trắng đồng nhất được hòa lại vào 1 ml đệm 8 M urea (pH 8,0) và lắc ít nhất một giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch LipA được sử dụng để hoạt hóa. Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford với Bio-Rad protein assay kit. Điện di SDS gel 12,5% (w/v) polyacrylamide (SDS-PAGE) được thực hiện theo phương pháp Laemmli [15] với thiết bị Bio-Rad. Hoạt hóa lipase được thực hiện như công bố trước đây [12]. Hai trăm (g lipase LipA tinh sạch được hoạt hóa trong 10 ml nước cất với 220 (g (tỷ lệ phân tử 1:1) chaperone (LipBhis. Sau 24 giờ ở 4°C, dịch nổi lipase được sử dụng để xác định tính chất. Hoạt tính lipase được xác định theo phương pháp pH-stat (pH-stat 718, Metrohm, Thụy sỹ) dùng cơ chất dầu olive như đã mô tả [16]. Một đơn vị hoạt tính được tính là hàm lượng enzyme giải phóng ra 1 (mol acid béo mỗi phút. Để tối ưu nhiệt độ phản ứng, hoạt tính lipase được xác định với pH 8,0 và ở nhiệt độ khác nhau 25 - 75°C. Đối với tối ưu pH phản ứng, hoạt tính enzyme được đo ở 55°C với các giá trị pH khác nhau từ 7,0 đến 11,5. Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền, một lượng lipase được ủ 30 phút [16] trong đệm 0,1 M Tris pH 8,0 ở các nhiệt độ khác nhau 25 - 80°C. Đỗi với ảnh hưởng của pH lên độ bền, một lượng lipase được ủ 30 phút ở 30°C trong đệm 0,1 M (acetate, phosphate, Tris-HCl, glycine/HCl, hoặc phosphate/KOH) với các giá trị pH khác nhau. Hoạt tính còn lại được xác định ở 55°C pH 9,0. Mọi xác định đều được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biểu hiện lipase và chaperone Lipase LipA được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipAB với năng suất cao 70 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh 3) và được tinh sạch theo phương pháp đơn giản nhiều bước ly tâm - siêu âm. SDS-PAGE biểu thị một băng duy nhất sau khi tinh sạch (Hình 2, kênh 4). Chaperone được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipB với mức độ cao 12 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh 1). (LipABis tinh sạch cho một băng protein trên SDS-PAGE (Hình 2, kênh 2). Hình 2. SDS-PAGE của lipase LipA và chaperone LipB tinh sạch bằng Ni-NTA biểu hiện cao ở E. coli BL21. Nhuộm Coomassie Brilliant Blue. Kênh M, thang trọng lượng phân tử chuẩn kDa; Kênh 1, dịch tế bào E. coli pELipB sau khi cảm ứng IPTG; Kênh 2, chaperone LipBhis tinh sạch bằng Ni-NTA (từ dịch E. coli pELipB); Kênh 3, dịch tế bào E. coli pELipAB sau khi cảm ứng IPTG; Kênh 4, lipase LipA tinh sạch (dịch tế bào E. coli pELipAB). Nhiệt độ tối ưu và độ bền với nhiệt Nhiệt độ tối ưu của LipA là 55°C (Hình 3). Hoạt tính lipase tăng dần từ 20% (25°C) lên tối đa 100% (55°C) và sau đó giảm mạnh xuống 69% (60°C). Từ 60 - 75°C, hoạt tính giảm rất chậm từ 69% xuống 57%. Lipase này là enzyme ưa nhiệt. Nhiệt độ ủ khác nhau 25 - 80°C ảnh hưởng rất rõ ràng tới độ bền lipase trong đệm 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 trong 30 phút. Hoạt tính tương đối không xử lý nhiệt (mẫu đối chứng) được định là 100%. Hoạt tính lipase còn lại tỷ lệ nghịch với nhiệt độ ñ. Nó tăng lên 117% khi được ủ ở nhiệt độ thấp (25 - 40°C) (Hình 3). ở nhiệt độ ủ 45°C hoạt tính giữ được 84%. Sau đó, hoạt tính giảm mạnh xuống 3% ở 60°C. Lipase bị bất hoạt (<3%) ở dải nhiệt độ 60 - 80°C (Hình 3). Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lipase (  ) và độ bền (  ). Đối với tối ưu nhiệt độ, hoạt tính của 1 g lipase hoạt hóa được đo bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH 8,0 và nhiệt độ khác nhau 25 - 75C. Đối với độ bền nhiệt, 1 g lipase được ủ trong đệm 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, trong 30 phút, ở nhiệt độ khác nhau 25 - 80°C, và hoạt tính được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH 9,0 và 55°C. pH tối ưu và độ bền pH Hoạt tính tối ưu của LipA được khảo sát ở 55°C với dải pH [...]... hoạt tính giảm mạnh xuống 9% ở pH 11,0 ở pH 11,0 - 12,5, LipA biểu thị độ bền thấp (8 - 9%) KẾT LUẬN Lipase và chaperone chủng Ralstonia sp M1 được biểu hiện cao trong E coli BL21 với mức lần lượt là 70 và 12 mg/g tế bào tươi Lipase sau khi hoạt hóa hoạt động ở nhiệt độ và pH tối ưu 55°C và 10,75 Đây là một enzyme kiềm và chịu nhiệt Độ bền nhiệt tới 45°C, trong môi trường kiềm pH 8,5 - 10,0 TÀI LIỆU... lên độ bền lipase sau 30 phút ủ ở 30°C Hoạt tính tương đối lipase không ủ (4°C) làm đối chứng được định là 100% Hình 4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính lipase () và độ bền () Để tối ưu pH, hoạt tính của 1 g lipase được đo bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở 55°C và pH khác nhau pH 7,0 - 11,0 Đo độ bền pH, 1 g enzyme được xử lý trong đệm 0,1 M với pH khác nhau pH 4,0 - 12,5 ở 30°C trong... (Hình 4) Lipase biểu thị hoạt tính tối ưu ở pH 10,75 Hoạt tính tương đối tăng chậm và dần dần từ 0,4% ở pH 7,0 lên 14,1% ở pH 8,5 sau đó không thay đổi nhiều 13,7 - 15,5% trong dải pH 8,5 - 9,75 Hoạt tính còn lại tăng mạnh từ 15,5% ở pH 9,75 lên hoạt tính tối đa 100% ở 10,75 cũng như giảm mạnh sau tối đa Tại pH 11,5 lipase mất hoạt tính Lipase này rất kiềm pH khác nhau của đệm ủ 0,1 M ảnh hưởng rõ rệt... và hoạt tính lipase được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở 55°C và pH 9,0 Độ bền LipA rất thấp ở dải pH 4,0 - 6,0, hoạt tính còn lại tăng dần từ 5% (pH 4,0) lên 45% (pH 6,0) (Hình 4) Hoạt tính lipase còn lại một nửa (45 - 55%) ở pH 6,0 - 8,0 và tăng mạnh tới tối đa ở pH 9,0 (112% hoặc 131% lần lượt đối với đệm Tris-HCl hoặc glycine/KOH) Khi pH tăng lên 10, hoạt tính lipase. .. homology to the lipase from Pseudomonas glumae Biochim Biophys Acta 1256: 396-402 11 Litthauer, D., A Ginster and E Skein, 2002 Pseudomonas luteola lipase: a new member of the 320residue Pseudomonas lipase family J Enzyme Microb Technol 30: 209-215 12 Quyen, D T., T T Nguyen, T T G Le, H K Kim, T K Oh and J K Lee, 2004 A novel subfamily I.2 lipase and its chaperone from Ralstonia sp M1 with new effectively... properties of the recombinant lipase Protein Expr Purif 28: 102-110 Lời cám ơn: Công trình này được thực hiện nhờ sự tài trợ kinh phí của Chương trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự nhiên năm 2004-2005 SUMMARY Overexpression of a alkaline and thermophilic lipase from Ralstonia sp M1 in E coli Quyen Dinh Thi, Le Thi Thu Giang, Nguyen Thi Thao Institute of Biotechnology, Vietnam Academy... Winkler, 1992 Molecular genetics of the extracellular lipase of Pseudomonas aeruginosa PAO1 J Gen Microbiol 138: 1325-35 5 Sullivan, E R., J G Leahy and R R Colwell, 1999 Cloning and sequence analysis of the lipase and lipase chaperone-encoding genes from Acinetobacter calcoaceticus RAG-1, and redefinition of a proteobacterial lipase family and an analogous lipase chaperone family Gene 230: 277-286 6 Kok,... glumae lipase gene and determination of the active site residues Appl Environ Microbiol 58: 37873791 9 Jorgensen, S., K W Skov and B Diderichsen, 1991 Cloning, sequence, and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia: lipase production in heterologous hosts requires two Pseudomonas genes J Bacteriol 173: 559-567 10 Taipa, M A., K Liebeton, J V Costa, J M Cabral and K E Jaeger, 1995 Lipase. .. of Candida antarctica lipase A and B as compared with with Humicola lanuginosa lipase Biochim Biocphys Acta 1258: 272-276 2 Jaeger, K.-E and T Eggert, 2002 Lipases for biotechnology Curr Opinion in Biotech 13: 390-397 3 Chihara-Siomi, M., K Yoshikawa, N OshimaHirayama, K Yamamoto, Y Sogabe, T Nakatani, T Nishioka and J Oda, 1992 Purification, molecular cloning, and expression of lipase from Pseudomonas... Nugteren-Roodzant, B Vosman and K J Hellingwerf, 1995 Characterization of lipase- deficient mutants of Acinetobacter calcoaceticus BD413: identification of a periplasmic lipase chaperone essential for the production of extracellular lipase J Bacteriol 177: 3295-3307 7 Aoyama, S., N Yoshida and S Inouye, 1988 Cloning, sequencing and expression of the lipase gene from Pseudomonas fragi IFO-12049 in E coli FEBS Lett . from Ralstonia sp. M1 were over-expressed in E. coli BL21 under the control of T7 promoter with a high level of 70 mg and 12 mg protein per gram of wet cells, respectively. The simply purified. lipase: chaperone and an evidence for genome deletions of these genes in Ralstonia solanacearum species. Submitted to Gene. 13. Arpigny, J. L. and K. E. Jaeger, 1999. Bacterial lipolytic enzymes: classification. helper protein, hoặc chaperone) cần thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào. Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp.