BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI." pot

Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh Korea Research Institute of Bioscience and Bio

BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT CỦA CHỦNG RALSTONIA SP M1 Ở E.COLI

Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia

Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea

MỞ ĐẦU

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride ở giao diện cơ chất và nước [1] và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến dầu, chuyển hóa sinh học, và đồng phân nhờ một số đặc tính như đặc hiệu cơ chất, vị trí, chọn lọc đồng phân, bền nhiệt và kiềm [2]

Lipase vi khuẩn Family I được chia thành 7 Subfamily dựa vào mức độ tương đồng trình tự amino acid [2] Lipase

Subfamily I.1 (P aeruginosa [3, 4], Acinetobacter sp [5, 6], P fragi [7], etc), và I.2 (B glumae [8], B cepacia [9],

C viscosum [10], P luteola [11], Ralstonia sp M1 [12], etc) có độ tương đồng trình tự amino acid cao (>33%) [13]

và hầu hết chúng còn có một đặc điểm chung khác là gene lipase luôn luôn gắn kết với gene thứ hai nằm ngay sau

[3-5, 9, 12, 14] hoặc trước gene lipase [6] Gene thứ hai mã hóa một protein được gọi là lipase-specific foldase

(modulator, activator, helper protein, hoặc chaperone) cần thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào

Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt

mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp M1 đã

được nhân dòng, phân tích và xác định thuộc họ phụ I.2 Burkholderia lipase/chaperone [12] Trong bài báo này, chúng tôi biểu hiện năng suất cao lipase hoàn thiện LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở E coli BL21 dưới sự điều khiển của T7 promoter Cả hai protein được tinh sạch

và lipase được hoạt hóa với chaperone Một số tính chất hóa lý của lipase tái tổ hợp được nghiên cứu

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dầu olive được mua của Sigma (Mỹ), Bacto-tryptone và cao nấm men của Difco (Korea) Enzyme hạn chế, CIAP, T4 ligase do Roche (Korea) cung cấp DNA Gel-Extraction Kit và Ni-NTA-matrice được mua của QIAGEN, PCR mix

và Minipreps của Bioner (Korea)

Hình 1 Các plasmid biểu hiện pELipAB và pELipB dẫn xuất từ vector biểu hiện pET22b+ cho hệ E coli BL21 Phân đoạn chèn và điểm cắt hạn chế sử dụng để nhân dòng trên hình T7Pro, T7 promoter; PelB, PelB signal peptide; LipA, lipase hoàn thiện; His, đuôi 6-histidine; T7Ter, T7 terminator; (LipB, 56aa chaperone cắt 56aa;

LipB, chaperone hoàn chỉnh

Hai plasmid pELipAB và pELipB (Hình 1) được thiết kế trước đây [12] dẫn xuất từ pET22b+ vector dưới sự kiểm soát của T7 promoter được sử dụng để biểu hiện cao lần lượt lipase LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở

Escherichia coli BL21 (DE3) E coli BL21 được nuôi cấy trong môi trường LB với ampicillin (nồng độ cuối cùng 100 (g/ml) ở 37(C Hai trăm ml LB chứa 200 (l ampicillin (100 mg/ml) được chủng với 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm và

nuôi cấy ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cho tới khi

OD600nm đạt 0,6, sau đó cảm ứng với 200 (l IPTG (100 mM) Dịch nuôi cấy được ủ ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cảm ứng Tế bào tươi được thu nhận bằng ly tâm ở 6,000 rpm trong 10 phút ở 4°C, được sử dụng tinh sạch protein hoặc bảo quản ở -20°C để tinh sạch sau

Chaperone (LipBhis được biểu hiện ở E coli pELipB dưới dạng hòa mang đuôi 6-his được tinh sạch bằng kit Ni-NTA (QIAGEN)

Lipase LipA được biểu hiện dưới dạng thể vùi Để tinh

sạch LipA, tủa 50 ml dịnh nuôi cấy được siêu âm (3x 1

phút, nghỉ 1 phút) trong 1 ml đệm 5 mM imidazole (pH 8,0) và dịch tế bào được ly tâm 15 phút ở 4(C tại 12,000 rpm Qui trình được lặp lại tối thiểu 5 lần cho tới khi tủa tế bào đồng nhất với một pha trắng Tủa trắng đồng nhất được hòa lại vào 1 ml đệm 8 M urea (pH 8,0) và lắc ít nhất một giờ ở nhiệt độ phòng Dịch LipA được sử dụng để hoạt hóa

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp

Bradford với Bio-Rad protein assay kit

Điện di SDS gel 12,5% (w/v) polyacrylamide (SDS-PAGE) được thực hiện theo phương pháp Laemmli [15] với thiết bị Bio-Rad

Hoạt hóa lipase được thực hiện như công bố trước đây [12] Hai trăm (g lipase LipA tinh sạch được hoạt hóa trong 10

ml nước cất với 220 (g (tỷ lệ phân tử 1:1) chaperone

(LipBhis Sau 24 giờ ở 4°C, dịch nổi lipase được sử dụng

để xác định tính chất

Hoạt tính lipase được xác định theo phương pháp pH-stat (pH-stat 718, Metrohm, Thụy sỹ) dùng cơ chất dầu olive như đã mô tả [16] Một đơn vị hoạt tính được tính là hàm lượng enzyme giải phóng ra 1 (mol acid béo mỗi phút

Để tối ưu nhiệt độ phản ứng, hoạt tính lipase được xác định với pH 8,0 và ở nhiệt độ khác nhau 25 - 75°C Đối với tối

ưu pH phản ứng, hoạt tính enzyme được đo ở 55°C với các giá trị pH khác nhau từ 7,0 đến 11,5 Để khảo sát ảnh

hưởng của nhiệt độ lên độ bền, một lượng lipase được ủ 30 phút [16] trong đệm 0,1 M Tris pH 8,0 ở các nhiệt độ khác nhau 25 - 80°C Đỗi với ảnh hưởng của pH lên độ bền, một lượng lipase được ủ 30 phút ở 30°C trong đệm 0,1 M

(acetate, phosphate, Tris-HCl, glycine/HCl, hoặc

phosphate/KOH) với các giá trị pH khác nhau Hoạt tính còn lại được xác định ở 55°C pH 9,0 Mọi xác định đều được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Biểu hiện lipase và chaperone

Lipase LipA được biểu hiện ở E coli BL21 pELipAB với năng suất cao 70 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh 3) và được tinh sạch theo phương pháp đơn giản nhiều

bước ly tâm - siêu âm SDS-PAGE biểu thị một băng duy nhất sau khi tinh sạch (Hình 2, kênh 4)

Chaperone được biểu hiện ở E coli BL21 pELipB với mức

độ cao 12 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh 1) (LipABis tinh sạch cho một băng protein trên SDS-PAGE (Hình 2, kênh 2)

Hình 2 SDS-PAGE của lipase LipA và chaperone LipB tinh sạch bằng Ni-NTA biểu hiện cao ở E coli BL21 Nhuộm Coomassie Brilliant Blue Kênh M, thang trọng lượng phân tử chuẩn kDa; Kênh 1, dịch tế bào E coli pELipB sau khi cảm ứng IPTG; Kênh 2, chaperone LipBhis tinh sạch bằng Ni-NTA (từ dịch E coli pELipB); Kênh 3, dịch tế bào E coli pELipAB sau khi cảm ứng IPTG; Kênh 4, lipase LipA tinh sạch (dịch tế bào E coli

pELipAB)

Nhiệt độ tối ưu và độ bền với nhiệt

Nhiệt độ tối ưu của LipA là 55°C (Hình 3) Hoạt tính lipase tăng dần từ 20% (25°C) lên tối đa 100% (55°C) và sau đó giảm mạnh xuống 69% (60°C) Từ 60 - 75°C, hoạt tính giảm rất chậm từ 69% xuống 57% Lipase này là enzyme

ưa nhiệt

Nhiệt độ ủ khác nhau 25 - 80°C ảnh hưởng rất rõ ràng tới

độ bền lipase trong đệm 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 trong 30 phút Hoạt tính tương đối không xử lý nhiệt (mẫu đối

chứng) được định là 100% Hoạt tính lipase còn lại tỷ lệ nghịch với nhiệt độ ñ Nó tăng lên 117% khi được ủ ở nhiệt

độ thấp (25 - 40°C) (Hình 3) ở nhiệt độ ủ 45°C hoạt tính giữ được 84% Sau đó, hoạt tính giảm mạnh xuống 3% ở 60°C Lipase bị bất hoạt (<3%) ở dải nhiệt độ 60 - 80°C (Hình 3)

Hình 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lipase ()

và độ bền () Đối với tối ưu nhiệt độ, hoạt tính của 1 g lipase hoạt hóa được đo bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH 8,0 và nhiệt độ khác nhau

25 - 75C Đối với độ bền nhiệt, 1 g lipase được ủ trong đệm 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, trong 30 phút, ở nhiệt độ khác nhau 25 - 80°C, và hoạt tính được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH

9,0 và 55°C

pH tối ưu và độ bền pH

Hoạt tính tối ưu của LipA được khảo sát ở 55°C với dải pH

7,0 - 11,5 (Hình 4) Lipase biểu thị hoạt tính tối ưu ở pH 10,75 Hoạt tính tương đối tăng chậm và dần dần từ 0,4% ở

pH 7,0 lên 14,1% ở pH 8,5 sau đó không thay đổi nhiều 13,7 - 15,5% trong dải pH 8,5 - 9,75 Hoạt tính còn lại tăng mạnh từ 15,5% ở pH 9,75 lên hoạt tính tối đa 100% ở 10,75 cũng như giảm mạnh sau tối đa Tại pH 11,5 lipase mất hoạt tính Lipase này rất kiềm

pH khác nhau của đệm ủ 0,1 M ảnh hưởng rõ rệt lên độ bền lipase sau 30 phút ủ ở 30°C Hoạt tính tương đối lipase

không ủ (4°C) làm đối chứng được định là 100%

Hình 4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính lipase () và độ bền () Để tối ưu pH, hoạt tính của 1 g lipase được đo bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất

ở 55°C và pH khác nhau pH 7,0 - 11,0 Đo độ bền pH, 1 g

enzyme được xử lý trong đệm 0,1 M với pH khác nhau

pH 4,0 - 12,5 ở 30°C trong 30 phút và hoạt tính lipase được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu

olive làm cơ chất ở 55°C và pH 9,0

Độ bền LipA rất thấp ở dải pH 4,0 - 6,0, hoạt tính còn lại tăng dần từ 5% (pH 4,0) lên 45% (pH 6,0) (Hình 4) Hoạt tính lipase còn lại một nửa (45 - 55%) ở pH 6,0 - 8,0 và tăng mạnh tới tối đa ở pH 9,0 (112% hoặc 131% lần lượt đối với đệm Tris-HCl hoặc glycine/KOH) Khi pH tăng lên

10, hoạt tính lipase tương đối là 88% Sau đó hoạt tính giảm mạnh xuống 9% ở pH 11,0 ở pH 11,0 - 12,5, LipA biểu thị độ bền thấp (8 - 9%)

KẾT LUẬN

Lipase và chaperone chủng Ralstonia sp M1 được biểu hiện cao trong E coli BL21 với mức lần lượt là 70 và 12

mg/g tế bào tươi Lipase sau khi hoạt hóa hoạt động ở nhiệt

độ và pH tối ưu 55°C và 10,75 Đây là một enzyme kiềm

và chịu nhiệt Độ bền nhiệt tới 45°C, trong môi trường

kiềm pH 8,5 - 10,0

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Marinelle, M., M Holmquist and K Hult, 1995 In the interfacial activitation of Candida antarctica lipase A and B

as compared with with Humicola lanuginosa lipase

Biochim Biocphys Acta 1258: 272-276

2 Jaeger, K.-E and T Eggert, 2002 Lipases for

biotechnology Curr Opinion in Biotech 13: 390-397

3 Chihara-Siomi, M., K Yoshikawa, N

Oshima-Hirayama, K Yamamoto, Y Sogabe, T Nakatani, T

Nishioka and J Oda, 1992 Purification, molecular cloning, and expression of lipase from Pseudomonas aeruginosa Arch Biochem Biophys 296: 505-513

4 Wohlfarth, S., C Hoesche, C Strunk and U K Winkler,

1992 Molecular genetics of the extracellular lipase of

Pseudomonas aeruginosa PAO1 J Gen Microbiol 138: 1325-35

5 Sullivan, E R., J G Leahy and R R Colwell, 1999 Cloning and sequence analysis of the lipase and lipase chaperone-encoding genes from Acinetobacter

calcoaceticus RAG-1, and redefinition of a proteobacterial lipase family and an analogous lipase chaperone family Gene 230: 277-286

6 Kok, R G., J J v Thor, I M Nugteren-Roodzant, B Vosman and K J Hellingwerf, 1995 Characterization of lipase-deficient mutants of Acinetobacter calcoaceticus BD413: identification of a periplasmic lipase chaperone essential for the production of extracellular lipase J

Bacteriol 177: 3295-3307

7 Aoyama, S., N Yoshida and S Inouye, 1988 Cloning, sequencing and expression of the lipase gene from

Pseudomonas fragi IFO-12049 in E coli FEBS Lett 242: 36-40

8 Frenken, L G., M R Egmond, A M Batenburg, J W Bos, C Visser and C T Verrips, 1992 Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the

active site residues Appl Environ Microbiol 58:

3787-3791

9 Jorgensen, S., K W Skov and B Diderichsen, 1991 Cloning, sequence, and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia: lipase production in heterologous hosts requires two Pseudomonas genes J Bacteriol 173: 559-567

10 Taipa, M A., K Liebeton, J V Costa, J M Cabral and

K E Jaeger, 1995 Lipase from Chromobacterium

viscosum: biochemical characterization indicating

homology to the lipase from Pseudomonas glumae

Biochim Biophys Acta 1256: 396-402

11 Litthauer, D., A Ginster and E Skein, 2002

Pseudomonas luteola lipase: a new member of the

320-residue Pseudomonas lipase family J Enzyme Microb Technol 30: 209-215

12 Quyen, D T., T T Nguyen, T T G Le, H K Kim, T

K Oh and J K Lee, 2004 A novel subfamily I.2 lipase and its chaperone from Ralstonia sp M1 with new

effectively refolding ratio of lipase:chaperone and an

evidence for genome deletions of these genes in Ralstonia

solanacearum species Submitted to Gene

13 Arpigny, J L and K E Jaeger, 1999 Bacterial

lipolytic enzymes: classification and properties Biochem

J 343: 177-183

14 Frenken, L G., J W Bos, C Visser, W Muller, J Tommassen and C T Verrips, 1993 An accessory gene, lipB, required for the production of active Pseudomonas glumae lipase Mol Microbiol 9: 579-589

15 Laemmli, U K., 1970 Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4

Nature 227: 680-685

16 Quyen, D T., C Schmidt-Dannert and R D Schmid,

2003 High-level expression of a lipase from Bacillus

thermocatenulatus BTL2 in Pichia pastoris and some

properties of the recombinant lipase Protein Expr Purif 28: 102-110

Lời cám ơn:

Công trình này được thực hiện nhờ sự tài trợ kinh phí của Chương trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học

Tự nhiên năm 2004-2005

SUMMARY

Overexpression of a alkaline and thermophilic lipase from Ralstonia sp M1 in E coli

Quyen Dinh Thi, Le Thi Thu Giang, Nguyen Thi Thao

Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology

Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea

The mature lipase LipA and its 56aa-truncated chaperone

LipBhis (with 6xhis-tag) from Ralstonia sp M1 were over-expressed in E coli BL21 under the control of T7 promoter with a high level of 70 mg and 12 mg protein per gram of wet cells, respectively The simply purified lipase

LipA was effectively refolded with its by Ni-NTA purified chaperone LipBhis in molar ratio 1:1 at 4°C for 24 hours

in H2O The in vitro refolded lipase LipA had an optimal activity in the temperature range of 50 - 55°C and was stable up to 45°C with more than 84% activity retention The maximal activity was observed at pH 10.75 for

hydrolysis of olive oil and found to be stable over alkaline

pH range 8.0 - 10.5 with more than 52% activity retention

Người thẩm định khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Dao, Phòng Enzyme học, Viện Công nghệ Sinh học