BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM" doc

TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN MỞ ĐẦU Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) từ lâu đã được coi như là một loại "thần dược” với những tác dụng giá trị dược liệu như bổ gan, thận, phổi, điều hoà huyết áp, làm giảm lượng đường và colesteron trong máu Gần đây nấm Linh Chi còn được dùng để điều trị các bệnh ung thư và được xem là nguyên liệu chứa nhiều chất chống oxy hoá. Nhằm đóng góp thêm các dẫn liệu về loại nấm có nhiều giá trị dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu các enzyme bảo vệ oxi hoá của nấm Linh Chi, trong đó trước hết tập trung vào 3 enzym chính đó là catalase, superoxid dismutase và NADH oxidase. Bài báo này giới thiệu một số kết quả mà chúng tôi đã thu được. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum - ký hiệu GAL được lấy từ phòng Giống nấm gốc của Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, được GS. Trịnh Tam Kiệt định tên khoa học. Phương pháp nghiên cứu - Nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum được trình bày trong [1,2] - Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng casein làm chất chuẩn [7] - Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp McCord và Fredovich [3,9] - Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của Thibodeau và cộng sự [8] và lượng H 2 O 2 còn lại được xác định theo phương pháp của Mottola và cộng sự [10] - Hoạt độ của NOX được xác định theo phương pháp của Poole và Clairborne [11] - Điện di trên gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp của Laemmli [6] -Tinh sạch enzyme bằng cột sắc ký trao đổi ion qua cột DE- 52, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G100 [4,5]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự sinh trưởng và phát triển của nấm GAL Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hệ sợi của nấm GAL phát triển thích hợp ở 26-28 o C. Sau 18-24 giờ cấy, hệ sợi bắt đầu phát triển mạnh trên môi trường nuôi cấy lỏng. Chủng Ganoderma lucidum có tốc độ sợi mọc từ 150 - 200 ml/giờ. Còn trong điều kiện nuôi cấy sinh quả thể, kết quả cho thấy sau khoảng 25-30 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm bắt đầu bện kết. Sau khoảng 2-3 tháng kể từ khi cấy giống, tán nấm phát triển thành thục, mỗi bịch chỉ cho 1-2 tán nấm lớn, năng suất thu hái tương đối thấp từ 2,5 - 4%. Hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm GAL Hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm GAL Kết quả xác định hoạt độ của enzym NADH oxidase được trình bày ở hình 1. Hình 1. Hoạt độ NADH oxidase (NOX) của nấm GAL Qua đây chúng tôi thấy rằng hoạt độ NOX của nấm GAL nhìn chung là tương đối thấp, chỉ đạt 0,049 đơn vị/ g nguyên liệu tươi. Hoạt độ NOX của nấm GAL ở dạng sinh khối cao hơn so với hoạt độ NOX ở dạng quả thể đạt 0,029 đơn vị/g nguyên liệu tươi Hoạt độ enzym catalase (CAT) của nấm GAL Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữ vai trò quan trọng phân huỷ các H 2 O 2 trong hầu hết các cơ thể sinh vật. Kết quả xác định hoạt độ CAT của mẫu GAL ( hình 4) cho thấy hoạt độ CAT của nấm GAL nhìn chung là tương đối cao, đạt tương ứng là 2,331 đv/mg protein và 2,319 đv/mg protein ở dạng quả thể và dạng sinh khối. Hình 2. Hoạt độ catalase (CAT) của nấm GAL Hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) của nấm GAL Kết quả phân tích hoạt độ enzym SOD của nấm GAL được biểu hiện ở hình 5, nhìn vào đồ thị cho ta thấy hoạt độ riêng enzym SOD của quả thể là 1,517 đv/mgPr, còn ở dạng sinh khối hoạt độ riêng tương ứng với 10,279 đv/mgPr Hình 3. Hoạt độ superoxit dismuatse (SOD) của nấm GAL Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NADH chúng tôi đã chọn enzym NADH oxidase để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất. Bước đầu tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của NOX từ sinh khối nấm GAL. Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NOX chúng tôi đã chọn enzym NOX để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất. Tinh sạch một phần enzym NOX từ sinh khối nấm GAL Để tinh sạch NOX từ sinh khối của nấm GAL, chúng tôi tiến hành thu dịch chiết, bổ sung thêm 0,1 thể tích đệm Tris-HCL 100mM, pH 8,0 để nồng độ cuối cùng của đệm là 100mM, pH đảm bảo đạt 8,0 và cho sắc ký qua cột gel DEAEcellulose DE-52, cột Sigma có kích thước 3x14 cm, được cân bằng với cùng đệm trên. Phần protein gắn trên cột được rửa chiết bằng gradient NaCl từ 50 mM- 1000 mM pha trong đệm Tris- HCl 100mM, pH 8,0. Kết quả phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn sắc ký qua cột cho thấy phần dịch không hấp thụ không có hoạt độ NOX. Phần hấp thụ được đẩy ra dưới dạng 3 đỉnh protein chính, trong đó chỉ có đỉnh đầu tiên được đẩy ra ở nồng độ khoảng 370mM là có hoạt độ NOX. Sử dụng SDS-PAGE để đánh giá độ sạch của chế phẩm NOX sau khi qua cột DE-52 (hình 4) cho thấy chế phẩm có một băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa và một số băng protein khác nhưng ít rõ nét hơn ( H4.cột 2) Để tiếp tục tinh sạch NOX của GAL, chúng tôi đã tiến hành tập trung các phân đoạn có hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô đặc mẫu bằng centricon và cho sắc ký qua cột lọc gel Sephadex G-100. Cột có kích thước 1x70cm, được cân bằng với đệm. Kết quả rửa chiết và phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn qua cột Sephadex G100 cho thấy có 2 đỉnh protein chính, trong đó đỉnh thứ nhất có hoạt độ NOX. Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bước lọc gel cho thấy ngoài băng protein 40 kDa vẫn còn một số băng khác có mặt trong chế phẩm, cho thấy chế phẩm chưa được tinh sạch hoàn toàn và cần tiếp tục tinh sạch. Hình 4: Kết quả điện di phổ băng protein của nấm GAL Cột M: Thang chuẩn protein; Cột 1: Dịch mẫu thô nấm GAL; Cột 2: Mẫu chạy qua cột DE-52 ; Cột 3: Mẫu chạy cột lọc gel G-100 Nghiên cứu một số tính chất của enzym NOX Sau khi thu được chế phẩm NOX tinh sạch một phần qua bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu một số tính chất của enzym. Độ bền nhiệt Kết quả phân tích độ bền của enzym NOX bằng cách ủ enzym ở các nhịêt độ khác nhau và sau đó xác định hoạt độ còn lại (hình 5) cho thấy NOX của nấm GAL là tương đối bền với nhiệt, ở nhiệt độ 30-60 o C sau 15 phút xử lý enzym vẫn giữ nguyên hoạt độ ban đầu. Tuy vậy khi xử lý ở 80 o C, trong 15 phút thì enzym chỉ còn 10% hoạt độ ban đầu. [...]... H2O Kết quả xác định lượng H2O2 sau phản ứng giữa NADH và enzym cho thấy H2O2 không hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase của nấm GAL thuộc nhóm sinh H2O Tóm lại, qua nghiên cứu này chúng tôi đã điều tra được hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá là SOD, CAT và NOX của nấm GAL ở dạng quả thể cũng như dạng sinh khối Có sự khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu này Chúng tôi cũng đã bước đầu thu...Ảnh hưởng của một số ion kim loại Kết quả phân tích ảnh hưởng của 5 ion kim loại (Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+ , Zn2+) và anion F- lên hoạt độ của NOX (hình 6) cho thấy chỉ có Fe2+ ở nồng độ 3-4mM có khả năng làm tăng một phần hoạt độ của NOX Các ion Ca2+, Mg2+ và Zn2+ và anion F- không ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym Còn ion Cu2+ ở nồng độ 4mM ức chế hoạt độ của NOX Hình 6: Ảnh hưởng của ion kim loại... phương pháp sắc ký qua cột trao đổi ion DE-52 và cột lọc gel Sephadex G-100 Các kết quả xác định tính chất chứng tỏ NOX của nấm GAL là thuộc nhóm sinh H20, khá bền với nhiệt, được hoạt hoá bởi Fe2+ và bị ức chế bởi Cu2+ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 1981 2 Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý ở Việt Nam, Nhà xuất bản mũi Cà Mau - 1996 3 Beanchamp,... 6: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ của NOX Xác định NOX của nấm GAL là thuộc loại sinh H2O hay sinh H2O2 Theo các nghiên cứu khác nhau [10], NADH oxidase của các sinh vật được phân thành hai nhóm: nhóm thứ nhất xúc tác cho phản ứng oxi hoá một phân tử NADH đến oxi và hình thành nên một phân tử H2O2, vì vậy được gọi là NOX sinh H2O2 Nhóm thứ hai oxi hoá 2 phân tử NADH và tạo H2O, nên có tên là... Biol Chem., 261 : 14525 - 14533 SUMMARY Investigation on some anti-oxidation enzymes of Ganoderma lucidum For many year Ganoderma lucidum (GAL) has been considered to be a valualbe medicinal fungus with anticancer and anti-oxidation activities In this study, Ganoderma lucidum was selected for investigation of some anti-oxidation enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), NADH oxidase... incubated at 80oC Some ions such as Mg2+, Ca2+ at 1 - 4mM concentrations hardly effect the activity of enzyme Fe2+ at 1 - 4mM concentration stimulates the activities of the enzyme whereas Cu2+ at the same concentrations shows to be strongly inhibitory for its activity Người thẩm định nội dung khoa học: TS Bùi Phương Thuận ... has higher activity of CAT and NOX enzymes than GAL fruit body SOD is present at the lowest level in both of samples The NOX (which was partially purifed by chromatography on DEAE-cellulose and Sephadex-G100 columns) appears to work well at pH 7.5 – 8 as a thermostable enzyme with more than 60% of activity remained after treatment at 60oC for 15 minutes However, the enzyme quickly lost its activity when... Biochem., 193: 265 - 270 9 Mc Cord, J.M, Fridovich, L., 1969 Superoxide dismutase an enzymic function orerthoenperia J Biochem 244 : 6049 - 6055 8 Mc Cord, J.M, Fridovich, L., 1969 Superoxide dismutase an enzymic function forerthoenperia J Biochem 244 : 6049 - 6055 9 Mottola - Aebi, H.E., (1987), " Catalase" In : Methods of enzymatic analysis, , eds, Bermeyer, J., Grabl, M., VCH Publishers New York., 273 . TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN MỞ ĐẦU Nấm. đã tiến hành tìm hiểu các enzyme bảo vệ oxi hoá của nấm Linh Chi, trong đó trước hết tập trung vào 3 enzym chính đó là catalase, superoxid dismutase và NADH oxidase. Bài báo này giới thiệu. tương đối thấp từ 2,5 - 4%. Hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm GAL Hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm GAL Kết quả xác định hoạt độ của enzym NADH oxidase được trình bày ở hình