khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của nấm linh chi (ganoderma lucidum) được trồng ở miền nam việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ ------ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐIỀU KIỆN LY TRÍCH HOẠT CHẤT CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM ĐƯỢC TRỒNG Ở MIỀN NA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐIỀU KIỆN LY TRÍCH HOẠT CHẤT CỦA

NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

ĐƯỢC TRỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐIỀU KIỆN LY TRÍCH HOẠT CHẤT CỦA

NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

ĐƯỢC TRỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

Năm học 2014-2015

Đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐIỀU KIỆN LY TRÍCH

HOẠT CHẤT CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) ĐƯỢC

TRỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Trọng Quang và Nguyễn Thanh Tùng là tác giả của luận văn này, tôi xin cam đoan luận văn đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến đóng góp của các thầy, cô trong hội đồng chấm bảo vệ luận văn

Trưởng Khoa:………

Ts Tôn Nữ Liên Hương

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của nấm linh chi (Ganoderma Lucidum) được trồng ở miền nam Việt Nam”

3 Sinh viên thực hiện: Lê Trọng Quang MSSV: 2102386

b Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

Ts Tôn Nữ Liên Hương

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của

nấm linh chi (Ganoderma Lucidum) được trồng ở miền nam Việt Nam”

3 Sinh viên thực hiện: Lê Trọng Quang MSSV: 2102386

b Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2014

Cán bộ phản biện

LỜI CẢM ƠN

- -

Trong suốt quá trình học tập ở bậc đại học, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy

cô trong Bộ môn Hóa và bên cạnh việc thực hiện luận văn tốt nghiệp đã giúp chúng

em tiếp thu được nhiều kiến thức bổ ích, tích lũy được nhiều kinh nghiệm quan trọng

để hỗ trợ cho công việc sau này Đạt được kết quả như ngày hôm nay, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Tất cả các thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô của Bộ môn Hóa - Khoa Công Nghệ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường Đại học

Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Tôn Nữ Liên Hương giảng viên chính Bộ môn Hóa - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo điều kiện để chúng em hoàn thành tốt luận văn

Em xin gởi cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Việt Bách, đã luôn quan tâm, chỉ bảo và cho chúng em những lời khuyên chân thành nhất trong quá trình theo học tại trường

Cảm ơn các anh chị và các bạn phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1 đã giúp đỡ và cho lời khuyên quý báu trong quá trình chúng em thực hiện luận văn

Cuối cùng, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và các bạn trong lớp Công Nghệ Hóa K36 Những người đã luôn bên chúng em, động viên, ủng

hộ và giúp đỡ chúng em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt luận văn của mình

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi xin cam kết luận văn này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của chúng tôi và kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2014

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv

LỜI CAM ĐOAN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC BẢNG xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2

2.1 Tổng quan về nấm 2

2.1.1 Nấm 2

2.1.2 Giới thiệu nấm Linh chi 3

2.1.2.1 Phân loại 3

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái Linh chi ở Việt Nam 4

2.1.2.4 Thành phần dược tính cơ bản trong nấm Linh chi 5

2.2 Tổng quan về một số hợp chất quan trọng trong nấm Linh chi 7

2.2.1 Alkaloid 7

2.2.1.1 Định nghĩa 7

2.2.1.2 Tính chất 8

2.2.1.3 Công dụng 8

2.2.2 Ganoderma Adenosine 8

2.2.3 Hợp chất Saponin 9

2.2.3.1 Khái niệm chung về saponin 9

2.2.3.2 Công dụng 9

2.2.4 Germanium hữu cơ 10

2.2.5 Polysaccharide 10

2.2.5.1 Khái niệm 10

2.2.5.2 Phân loại 11

2.2.5.3 Cấu trúc của PS trong nấm linh chi 11

2.2.5.4 Tác dụng dược lý của PS từ nấm linh chi 13

2.2.6 Triterpenoid 14

2.2.6.1 Khái niệm 14

2.2.6.2 Cấu trúc của các bộ khung cơ bản 14

2.2.6.3 Tác dụng dược lý của triterpenoid trong linh chi 16

2.3 Tổng quan một số phương pháp định tính, định lượng các hoạt có trong nấm linh chi 16

2.3.1 Định tính 17

2.3.1.1 Định tính alkaloid 17

2.3.1.2 Định tính hợp chất saponin 17

2.3.1.3 Định tính triterpenoid 18

2.3.1.4 Định tính Polysaccharide 18

2.3.1.5 Định tính acid hữu cơ 18

2.3.2 Định lượng 19

2.3.2.1 Định lượng đường tổng 19

2.3.2.2 Định lượng Polysaccharide 19

2.3.2.3 Định lượng đường khử 19

2.3.2.4 Định lượng pectin 24

2.3.2.5 Định lượng hàm lượng Nitơ tổng 24

2.3.2.6 Định lượng Triterpenoid 26

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 29

3.1 Phương tiện nghiên cứu 29

3.1.1 Thời gian 29

3.1.2 Đối tượng 29

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Định danh và xử lý mẫu 30

3.3.1.1 Định danh 30

3.3.1.2 Xử lý mẫu 30

3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết 30

3.3.2.1 Khảo sát dung môi 30

3.3.2.2 Khảo sát nhiệt độ 30

3.3.2.3 Khảo sát thời gian chiết 31

3.3.2.4 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi 31

3.3.2.5 Khảo sát phương pháp chiết 32

3.3.3 Xác định độ ẩm mẫu nấm nguyên liệu 32

3.3.4 Định tính một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu 32

3.3.4.1 Định tính alkaloid 32

3.3.4.2 Xác định hợp chất saponin 33

3.3.4.3 Định tính triterpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard) 34

3.3.4.4 Định tính Polysaccharide 35

3.3.4.5 Định tính acid hữu cơ 35

3.3.5 Định lượng một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu 35

3.3.5.1 Định lượng đường tổng 35

3.3.5.2 Định lượng Polysaccharide 36

3.3.5.3 Xác định đường đơn trong mẫu linh chi 38

3.3.5.4 Định lượng đường khử 38

3.3.5.5 Xác định đường không khử trong mẫu linh chi 40

3.3.5.6 Xác định pectin trong mẫu linh chi 41

3.3.5.7 Định lượng hàm lượng Nitơ tổng (protein thô) 42

3.3.5.8 Định lượng Triterpenoid 43

3.3.6 Xây dựng quy trình một số hợp chất quan trọng trong linh chi 43

3.3.6.1 Quy trình tách chiết polyssacharides 43

3.3.6.2 Quy trình tách chiết Triterpenoid 45

3.3.7 Xây dựng quy trình chiết cao tổng từ mẫu linh chi 46

3.4 Phương pháp sử lý số liệu 48

3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính 48

3.4.2 Xây dựng đường chuẩn 48

3.4.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 49

3.4.4 Xử lí và kiểm tra số liệu thực nghiệm 50

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

4.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết 52

4.1.1 Khảo sát dung môi 52

4.1.2 Khảo sát nhiệt độ 52

4.1.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi 53

4.1.4 Khảo sát thời gian chiết 53

4.1.5 Khảo sát phương pháp chiết 54

4.2 Kết quả khảo sát dược tính nấm linh chi 55

4.2.1 Định tính alkaloid 55

4.2.2 Định tính saponin 56

4.2.3 Định tính triterpenoid 57

4.2.4 Định tính polysaccharide 58

4.2.5 Định tính acid hữu cơ 58

4.3 Kết quả xác định hàm lượng một số hợp chất có trong linh chi 58

4.3.1 Xác định độ ẩm 58

4.3.2 Định lượng đường tổng theo phương pháp phenol – sulfuric 59

4.3.3 Định lượng Polysaccharide 60

4.3.4 Định lượng đường đơn 63

4.3.5 Định lượng đường khử 63

4.3.6 Định lượng đường không khử 64

4.3.7 Định lượng pectin 64

4.3.8 Định lượng protein (Nitơ tổng) 64

4.3.9 Kết quả quy trình tách chiết polysaccharide 65

4.3.10 Kết quả quy trình tách chiết triterpenoid 66

4.3.10.1 Tách chiết cao toàn phần 66

4.3.10.2 Tinh chế, phân đoạn và xác định hàm lượng TP 67

4.3.11 Kết quả quy trình chiết cao tổng từ linh chi 69

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

DANH MỤC HÌNH

Hình 2-1 Nấm Linh chi 3

Hình 2-2 Bộ khung β-(1-6)-D-glucan 12

Hình 2-3 Bộ khung β-(1-3)-D-glucan 12

Hình 2-4 Bộ khung β-glucan và α-mannan 13

Hình 2-5 Một khung sườn 32 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi 14

Hình 2-6 Một khung sườn 30 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi 15

Hình 2-7 Một khung sườn 27 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi 15

Hình 2-8 Một khung sườn 24 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi 16

Hình 2-9 Dạng không proton hóa của Coomasie Blue G-250 (C47H48N3O7S2Na) 25

Hình 3-1 Phổ UV-Vis D-glucose chuẩn của một số mẫu sau khi xử lý bằng phenol-sulfuric 38

Hình 3-2 Quy trình tách chiết polyssacharides 44

Hình 3-3 Quy trình thu gọn 44

Hình 3-4 Sơ đồ quy trình tách chiết triterpenoid (Trần Cao Sơn, 2010) 45

Hình 3-5 Quy trình chiết hoạt chất từ nấm linh chi Ganoderma lucidum trên dung môi nước 47

Hình 4-1 Phản ứng định tính Alkaloid 56

Hình 4-2 Thử nghiệm tính tạo bọt 56

Hình 4-3 Thử ngiệm Fontan – Kaudel 57

Hình 4-4 Phản ứng Liebermann – Burchard định tính Triterpenoid 57

Hình 4-5 Phản ứng định tính polysaccharide 58

Hình 4-6 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ saccharose 59

Hình 4-7 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ D-glucose 62

Hình 4-8 A Trước khi chuẩn độ - B Sau khi chuẩn độ - C Sau khi chuẩn 30 giây 63

Hình 4-9 A Trước khi chuẩn độ - B Sau khi chuẩn độ 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2-1 Thành phần dược tính cơ bản trong nấm Linh chi 5

Bảng 2-2 Bảng tỉ lệ giữa KMnO4 và đường khử 21

Bảng 2-3 Bảng tìm lượng glucoza theo phương pháp Rodzevich 23

Bảng 2-4 Hệ số tắt của các loại Protein liên quan tới hệ miễn dịch ở bước sóng 280 26

Bảng 4-1 Khảo sát lượng chất chiết thu hồi với từng loại dung môi 52

Bảng 4-2 Khảo sát nhiệt độ 52

Bảng 4-3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi 53

Bảng 4-4 Khảo sát thời gian chiết 53

Bảng 4-5 Khảo sát phương pháp chiết 54

Bảng 4-6 Bảng đo mật độ quang của đường 59

Bảng 4-7 Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn 61

Bảng 4-8 Hệ số tương quan ở các khoảng nồng độ khác nhau 61

Bảng 4-9 Hàm lượng polysaccharide thu được sau thí nghiệm 65

Bảng 4-10 Độ lặp lại của phương pháp 65

Bảng 4-11 Hàm lượng triterpenoid trong cao toàn phần và các phân đoạn 67

Bảng 4-12 So sánh hàm lượng triterpenoid tổng Ta + Tna 68

Bảng 5-1 Hàm lượng các hợp chất trong mẫu linh chi Vina đã khảo sát 71

Bảng 5-2 Hàm lượng các chất trong nấm linh chi trong các tài liệu đã tham khảo 71

Bảng 5-3 Hàm lượng hợp chất có trong 100 g mẫu linh chi khô vùng Himalaya 72

Hiện nay, người dân Việt Nam sử dụng nấm Linh chi khá nhiều, từ nhiều nguồn khác nhau: nuôi trồng, thu hái trong thiên nhiên, nhiều khi không xác định rõ nguồn gốc mà chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, nhiều loài không biết có hoạt tính sinh học hay không Mặt khác, nhiều địa phương trong nước đang có phong trào nuôi trồng nấm

Linh chi Ganoderma lucidum, lấy giống từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Giá bán

nấm trên thị trường dao động từ 300.000 - 30.000.000 đ/kg tùy theo loại nấm: nuôi trồng, thiên nhiên, thời gian thu hoạch ngắn ngày hay dài ngày Việc nuôi trồng và sử dụng nấm ồ ạt như vậy là không có cơ sở khoa học

Vì vậy, việc định tính và định lượng thành phần hóa học nhằm đánh giá chất lượng nấm Linh chi là một vấn đề có ý nghĩa không chỉ về mặt khoa học mà còn đáp ứng nhu cầu cấp thiết hiện nay của xã hội Xuất phát từ những nhu cầu trên, chúng tôi

chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất trong nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum) được trồng ở miền nam Việt Nam”

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm

2.1.1 Nấm

Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ R.H.Whitaker đưa ra hệ thống phân loại:

- Giới khởi sinh (Monera): Gồm vi khuẩn và tảo lam

- Giới nguyên sinh (Protista): Gồm một số tảo đơn bào, nấm đơn bào có khả năng di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật sinh

- Giới nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota)

- Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia)

độc lập giới thực vật và giới động vật

2.1.2 Giới thiệu nấm Linh chi

 Loài: Ganoderma lucidum

Linh chi đã được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền Trung Quốc và các nước châu Á trong nhiều thập kỷ qua

Linh chi đỏ (Xích chi) gồm rất nhiều loài khác nhau như: Ganoderma lucidum Karst, Ganoderma resinaceum Boud, Ganoderma multiplicatum Pat, Ganoderma ramosissimum Zhao,

Trong đó, loài Ganoderma lucidum được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2-1 Nấm Linh chi

Quả thể có cuống dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi trở thành đính tâm

do quá trình liền tán Cuống nấm hình trụ, hoặc mảnh (đường kính cỡ 0,3 -0,8 cm), hoặc lớn hơn (tới 2 - 3,5 cm), ít khi phân nhánh, từ 2,7 - 22 cm, đôi khi uốn khúc cong Lớp vỏ cuống láng đỏ - nâu đỏ - nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm, màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen, nhẵn bóng, láng như verni Nấm thường sẫm màu dần khi già, lớp vỏ láng phủ tràn kín mặt trên mũ, đôi khi có lớp phấn Kích thước mũ nấm có thay đổi Phần đính cuống nhô lên hoặc lõm xuống Phần thịt nấm có màu vàng kem, nâu nhạt hoặc trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và dưới Ở lớp trên, các tia sợi hướng lên được thấy rõ, đầu các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng chứa laclate không tan trong nước nên nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

Tầng sinh sản (thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,8 cm, màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng – vàng chanh nhạt, khoảng 3 – 5 ống/mm

Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng – hình chùy, không màu Dài 16 – 22

µm, mang bốn đảm bào tử (basidiospores)

Đảm bào tử dạng trứng cụt (truncate), cấu trúc lớp vỏ kép (bitunicate), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu Kích thước dao động (8 – 11,5) x (6 – 7,7) µm

2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái Linh chi ở Việt Nam

Nấm linh chi phân bố rộng khắp Việt Nam từ Bắc vào Nam, từ vùng rừng núi, cao nguyên tới đồng bằng Nấm Hồng Chi thường mọc trên các loại cây gỗ thuộc họ đậu (Fabales) sống hay đã chết Quả thể rộ vào mùa mưa, có thể ở trên thân cây (cuống thường ngắn, tai nhỏ), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (nổi hoặc ngầm gần mặt đất), cuống nấm thường dài, có thể phân nhánh và tán nấm lớn (≈

30 cm) Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ Điều kiện môi trường cho nấm phát triển cụ thể như sau:

 Nhiệt độ thích hợp

Giai đoạn nuôi sợi: Từ 20 ºC – 30 ºC

Giai đoạn quả thể: Từ 22 ºC – 28 ºC

 Độ ẩm

Độ ẩm cơ chất: 60 – 62%

Độ ẩm không khí: 80-95%

 Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm linh

chi cần có độ thông thoáng tốt

 Ánh sáng

Giai đoạn nuôi sợi: Không cần ánh sáng

Giai đoạn phát triển quả thể: Cần ánh sáng tán xạ Cường độ ánh sáng cân đối từ mọi phía

 pH: Hồng Chi thích nghi trong môi trường trung tính đến acid yếu (pH từ 5,5-7)

 Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cenlulose (Nguyễn Hữu Đống và cộng

sự, 2005)

2.1.2.4 Thành phần dược tính cơ bản trong nấm Linh chi

Với phương pháp cổ điển trước đây, người ta đã phân tích các thành phần dược tính tổng quát của nấm Linh chi như sau

Bảng 2-1 Thành phần dược tính cơ bản trong nấm Linh chi

Nguồn: (Trần Hùng, 2004)

Hiện nay, hàng trăm loại hoạt chất sinh học khác nhau đã được xác định, chủ yếu bao gồm polysaccharide, triterpenoid, nucleotid, steroid, acid béo, peptid và các nguyên tố vi lượng

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpen mới, bao gồm lucidumol A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R Trong đó lipophilic có thành phần chính là Lanostane triterpen Có khoảng 130 hợp chất được

ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi Thành phần và hàm lượng triterpen phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường Vai trò của triterpene

có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV

Hàng loạt các nghiên cứu đã chứng minh rằng polysaccharide và triterpen của nấm Linh Chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính Ganopoly ức chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút Ngoài ra polysaccharide và triterpen tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử

của polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300 đvC Những tổng kết về

vai trò sinh dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh Chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ

He và cộng sự (1992) đã khảo cứu các nhóm hoạt chất BN3B - gồm 4 polysaccharide đồng nhất có hoạt tính tăng miễn dịch Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside

Hikino và cộng sự từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều polysaccharide Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết đường, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan Đây chính là cơ

sở trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường

Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng

tính miễn dịch Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng

phương pháp dung hợp Protoplast giữa chủng G lucidum với G applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), kết quả là làm tăng cường hoạt

tính chống khối u của các phức polysaccharide – protein lên đáng kể

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già bởi polysaccharide, rõ thêm khả năng làm trẻ hóa, tăng tuổi thọ của nấm Linh Chi

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ

hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G lucidum và G applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993)

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng Dược lý mạnh nhất là nhóm saponine, triterpenoide và các acid ganoderic Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế angiotensine conversino enzyme (ACE), ức chế sinh tổng cholesterol và hạ huyết áp

Các cuộc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy rằng, linh chi có garnoderic acid tác động ngăn chặn virus làm tổn hại gan và tác động giải độc gan, qua đó có thể ứng dụng được để điều trị bệnh gan ở người

Bên cạnh đó, linh chi còn có tác dụng diệt vi khuẩn và chống lại tác động của các virus HSV-1, HSV-2, cúm, loét miệng, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Candida albicans, và Escherichia Coli

2.2 Tổng quan về một số hợp chất quan trọng trong nấm Linh chi

2.2.1 Alkaloid

2.2.1.1 Định nghĩa

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng

Tuy nhiên, cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng nối với nitơ và một

số alkaloid không có phản ứng kiềm Một số alkaloid có thể phản ứng acid yếu do

có nhóm chức acid trong phân tử (Nguyễn Phước Nhuận, 2001; Trần Hùng, 2004)

điều chế dạng thuốc để uống (Nguyễn Phước Nhuận, 2001; Trần Hùng, 2004)

2.2.1.3 Công dụng

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y Dược

và nhiều chất rất độc Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc của alkaloid (Nguyễn Phước Nhuận, 2001; Trần Hùng, 2004)

Chức năng của adenosine:

 Giảm độ nhớt máu

 Ức chế kết dính tiểu cầu

 Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

 Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

 Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não

 Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

2.2.3 Hợp chất Saponin

2.2.3.1 Khái niệm chung về saponin

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm 2 phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon…

Saponin có tính chất đặc trưng: khi hoà tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, làm vỡ hồng cầu Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200 ºC trở lên và có thể trên 300 ºC Saponin bị tủa bởi chì acetat, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 carbon,

cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

 Saponin triterpenoid pentacylic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean

 Saponin triterpenoid tetracylic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dummanran, lanostan, cucurbitan

Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

 Tác dụng thông tiểu

 Tác dụng kháng viêm, chống khối u (Lê Xuân Thám, 1996)

2.2.4 Germanium hữu cơ

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà hóa học người Đức khám phá vào năm 1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa

Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Germanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khỏe Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Germanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

Chức năng của Germanium:

 Tăng cường khả năng mang oxygen và làm giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

 Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

 Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

2.2.5 Polysaccharide

2.2.5.1 Khái niệm

Polysaccharide là polymer thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate được cấu tạo từ

nhiều monosaccharide kết hợp lại với nhau, dạng bột có màu vàng (Bao và cộng sự,

2001)

Chúng không tan trong các dung môi kém phân cực và phân cực trung bình như alcol, acetone, n-hexane, benzene, ethyl acetate, tetrachloromethane, chloroform và ether nhưng tan trong các dung môi phân cực như nước, NaOH loãng, formamide và dimethylsulfoxide

PS thuần (homopolysaccharide): bao gồm 2 loại

 Polyhomosaccharide (glycan): đây là loại PS chỉ gồm 1 loại đường đơn trong phân tử

 Polyheterosaccharide (heteroglycan): đây là loại PS được cấu tạo từ nhiều loại đường đơn khác nhau

PS tạp (heteropolysaccharide): bao gồm 2 loại

 N-heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường và các hợp chất của nitơ

 S-heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường và các hợp chất của lưu huỳnh

Nấm linh chi chứa một hỗn hợp phức tạp các PS PS của G lucidum đã được

chứng minh là được cấu tạo từ một loạt các MS như: glucose, galactose, mannose,

arabinose, xylose, fucose, rhamnose, glucuronic acid, galacuronic acid .(Saito và cộng sự,1989) PS của G lucidum đa số thuộc loại glucan, galactan và heteroglycan,

ngoài ra, còn tồn tại ở dạng PS tạp

2.2.5.3 Cấu trúc của PS trong nấm linh chi

Cấu trúc của PS trong G lucidum phụ thuộc vào: giống, điều kiện sinh trưởng và

phát triển, thời gian thu hoạch, điều kiện tách chiết

Tuỳ thuộc vào các yếu tố trên mà PS trong G lucidum sẽ có bộ khung khác nhau

(hoặc β)-(1→4) và α (hoặc β)-(1→6) Tùy thuộc điều kiện chiết: nóng hay lạnh, kiềm hay nước mà số lượng và thành phần liên kết, đường đơn của sản phẩm nhận được sẽ thay đổi

Hình 2-4 Bộ khung β-glucan và α-mannan

2.2.5.4 Tác dụng dược lý của PS từ nấm linh chi

Những hợp chất có hoạt tính kháng ung thư là glycoprotein, heteroglycan, chúng thường là các hợp chất tan trong nước (Russell và Paterson, 2006)

Chống ung thư, tăng tính miễn dịch, hạ đường huyết, tăng tổng hợp protein, tăng chuyển hoá acid nucleic Nhiều hoạt tính sinh học được chỉ ra như là tác nhân ngăn ngừa khối u và chống virus có trong mầm của nấm Gần đây, phần dịch chiết bằng

etanol trong G lucidum được Alice Yu cùng cộng sự chứng minh là có khả năng

2.2.6.2 Cấu trúc của các bộ khung cơ bản

Triterpenoid của Ganoderma chứa chủ yếu bộ khung lanostane, được phân loại

thành nhiều nhóm dựa vào số carbon và trạng thái oxy hoá của chúng

Có 4 bộ khung cấu trúc cơ bản là bộ khung 32, 30, 27 và 24 carbon

 Các triterpenoid có bộ khung 32 carbon

Hình 2-5 Một khung sườn 32 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi

Cho đến nay, dẫn chất của triterpenoid có bộ khung 32 carbon khác thường đã

được tìm thấy trong nấm linh chi không nhiều, chỉ khoảng 3 hợp chất (Cheng và cộng

sự, 2010)

 Các triterpenoid có bộ khung 30 carbon

Theo các tài liệu (Liu và cộng sự, 2006; Tsuyoshi và cộng sự, 1986; Xu và cộng

sự, 2010; Yang và cộng sự, 2007) mà chúng tôi tham khảo được, có khoảng 88 chất có

cùng bộ khung 30 carbon, bao gồm các acid ganoderic, acid ganoderenic, acid ganodermic, acid ganolucidic… Đây là những triterpenoid đã được phân lập nhiều nhất từ linh chi

Hình 2-6 Một khung sườn 30 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi

 Các triterpenoid có bộ khung 27 carbon

Đã tìm thấy khoảng 10 hợp chất triterpenoid có bộ khung 27 carbon, chủ yếu là các acid lucidenic như acid lucidenic A, B, C, D1, D2 (Yang và cộng sự, 2007; Tsuyoshi và cộng sự, 1984; Tsuyoshi và cộng sự, 1985)

Hình 2-7 Một khung sườn 27 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi

 Các triterpenoid có bộ khung 24 carbon

Bộ khung 24 carbon không phổ biến trong nấm linh chi Có khoảng 3 hợp chất,

chủ yếu tồn tại ở dạng alcol và ceton (Tsuyoshi và cộng sự, 1985; Tsuyoshi và cộng

sự, 1986)

Hình 2-8 Một khung sườn 24 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi

Qua việc phân tích các bộ khung chúng tôi rút ra một số nhận xét:

 Đã phát hiện khoảng 104 triterpenoid trong nấm linh chi, gồm 3 hợp chất có

bộ khung 32 carbon, 88 hợp chất có bộ khung 30 carbon, 10 hợp chất có bộ khung 27 carbon và 3 bộ khung có 24 carbon

 Có khoảng 73 hợp chất tìm thấy trong phân đoạn chloroform, một số trong phân đoạn NaHCO3 và ethyl acetate

 Các hợp chất này khác nhau về bộ khung và nhóm định chức tuy vẫn là

triterpen

Đặc điểm của một số nhóm chất triterpenoid phổ biến

 Các cấu tử đều tan trong chloroform

 Các cấu tử đều có phân tử khối từ 400 đến 700 đvC

 Bước sóng hấp thụ cực đại của các cấu tử đều nằm trong vùng tử ngoại, tập trung trong khoảng 200 đến 300 nm

2.2.6.3 Tác dụng dược lý của triterpenoid trong linh chi

 Hạ huyết áp

 Ức chế tổng hợp Cholesterol, histamin

 Giảm đau, bảo vệ gan, chống khối u

2.3 Tổng quan một số phương pháp định tính, định lượng các hoạt có trong nấm linh chi

Phần 2: Lấy mẫu ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: Chloroform: Ethanol 95o: NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính bazơ) Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff

2.3.1.2 Định tính hợp chất saponin

Chiết nguyên liệu với ethanol 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc

Cô dịch lọc bốc hơi đến cặn khô Dùng cặn để làm các phản ứng định tính (Nguyễn Kim Phu Phụng, 2007)

Thử nghiệm tính tạo bọt

Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin Hòa tan một lượng cặn tương ứng với nước nóng Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt

Lấy một lượng cặn tương ứng với 1g bột Dược liệu, đun cách thủy để hòa tan với 10mL nước Chia đều vào 2 ống nghiệm

 Ống 1: thêm 2 mL HCl 0.1 N (pH = 1)

 Ống 2: thêm 2 mL NaOH 0.1 N (pH = 13)

Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm

Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền như nhau thì

sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid

Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là

có saponin steroid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2011)

2.3.1.3 Định tính triterpenoid

Chiết nguyên liệu bằng diethylether Dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn với anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch chloroform Tiếp tục thêm 1 – 2 mL H2SO4 đậm đặc, nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu

đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím Kết luận có triterpenoid

2.3.1.4 Định tính Polysaccharide

Ngâm mẫu thử trong dung môi thích hợp Nếu dịch chiết thu được cho màu xanh lục khi tác dụng với thuốc thử anthrone – acid sulfuric hoặc cho màu vàng da cam khi tác dụng với thuốc thử phenol – acid sulfuric thì kết luận có Polysaccharide

Với anthrone là cetone, có công thức phân tử: C14H10O, CTCT

2.3.1.5 Định tính acid hữu cơ

Chiết nguyên liệu bằng nước Dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm, thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3 Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3thì kết luận có acid hữu cơ

được hàm lượng đường tổng của mẫu cần khảo sát (Pelagia Research Library)

c Phương pháp Phenol – Sulfuric

Thực hiện phản ứng tạo màu (da cam) giữa đường tổng trong mẫu nghiên cứu với thuốc thử phenol khi có sự hiện diện của H2SO4 Cường độ màu được đo bằng máy quang phổ so màu ở bước sóng 490 nm Dựa vào đồ thị chuẩn của saccharose

tinh khiết với thuốc thử, tính ra hàm lượng đường tổng của mẫu nghiên cứu (Bao và cộng sự, 2001; Krishnaveni và cộng sự, 1984)

2.3.2.2 Định lượng Polysaccharide

Dựa vào phản ứng thuỷ phân PS thành monosaccharide, mono tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490 nm Từ đường chuẩn xây dựng từ dung dịch D-Glucose tinh khiết, ta xác định được hàm lượng polysaccharide có trong mẫu

2.3.2.3 Định lượng đường khử

a Phương pháp Bertrand

Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, frutose, mantose ) có thể dễ dàng khử CuO thành Cu2O (Cu2+  Cu+), kết tủa đồng

(I) oxide có màu đỏ gạch, qua đó định lượng được đường khử (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử Fehling Thuốc thử Fehling là hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch CuSO4 – gọi là Fehling A, và dung dịch kiềm của muối Seignette (muối kali natri tactrate) – gọi là Fehling B

Khi trộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn Đầu tiên tạo thành kết tủa Cu(OH)2 màu xanh da trời

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối seignette tạo thành muối phức hòa tan

HO-CHCOONa O-CHCOONa

Cu(OH)2 + Cu + 2H2O HO-CHCOOK O-CHCOOK

Muối phức trên là một hợp chất không bền Các đường có chứa nhóm aldehyde hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling

CH2OH OH-CHCOOK

Để định lượng Cu2O tạo thành, trước hết oxi hóa nó bằng dung dịch sắt (III) hoặc bằng sắt kép sulfate trong môi trường acid sulfuric, đồng (I) bị oxi hóa trở lại đồng (II), còn sắt (III) bị khử thành sắt (II)

Cu2O + 2Fe3+ + 2H+ 2Cu2+ + 2Fe2+ + H2O

Lượng Fe2+

tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nhờ dung dịch KMnO4

trong môi trường acid

5Fe2+ + MnO4- + 8H+ 5Fe3+ + Mn2+ + 4H2O

Từ lượng KMnO4 tiêu tốn trong chuẩn độ, có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính hàm lượng đường trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lượng đồng và lượng đường khử Bertrand

Để đơn giản việc tính toán, người ta lập bảng tỷ lệ trực tiếp giữa lượng dung dịch KMnO4 (1/30 N) và đường khử bằng thực nghiệm Biết được lượng dung dịch KMnO4dùng chuẩn độ lượng đường tạo thành, ta tính được lượng đường có trung dung dịch cần phân tích

Cu+) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO4 dư tính được lượng đường khử

Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau: (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Khi trộn hai dung dịch Fehling (I) và Fehling (II) với nhau thì xảy ra phản ứng theo hai giai đoạn

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

HO-CHCOONa O-CHCOONa

Cu(OH)2 + Cu + 2H2O HO-CHCOOK O-CHCOOK

Muối phức trên là một hợp chất không bền Các đường có chứa nhóm aldehyde hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+

thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling

CH2OH OH-CHCOOK Lượng CuSO4 dư cho tác dụng với KI trong môi trường H2SO4 sẽ giải phòng Iod

tự do:

CuSO4 + 4KI + H2SO4 I2 + CuI2 + 2K2SO4 Chuẩn độ lượng iod tạo thành bằng Natri thiosunlfate (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch

I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI

OH

NO2 O2N

OH

NH2 O2N

[O], oxi hóa khử

Hiệu số 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5

Hiệu số 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6

c Phương pháp Acid Dinitro – Salicylic (DNS)

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu (đỏ cam) giữa đường khử với thuốc thử acid dinitro-salicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu khảo sát (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

d Phương pháp màu trên phổ quang kế

Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur, ion này có màu xanh đậm (xanh prusse) Nhờ vậy, ta có thể dùng phương pháp này để định lượng đường (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

2K3Fe(CN)6 + KOH 2K4Fe(CN)4 + H2O + [O]

CH2OH – (CHOH)4 – CHO + [O] HOOC – (CHOH)4 – COOH

2.3.2.4 Định lượng pectin

Trong môi trường kiểm loãng, pectin hòa tan sẽ giải phóng nhóm methoxyl thành rượu methylic và acid pectic tự do Acid pectic tự do trong môi trường khi có mặt acid acetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat Từ hàm lượng muối kết tủa có thể tính được hàm lượng pectin có trong mẫu phân tích (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

2.3.2.5 Định lượng hàm lượng Nitơ tổng

a Phương pháp Kjeldahl

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể (động thực vật) hay mô được gọi là nitơ tổng Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein Nitơ không có trong thành phần protein như các muối vô cơ, acid nitric, acid amin tự do, các peptit, ure, các dẫn xuất của ure, là nitơ phi protein (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein Trước tiên, vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Phản ứng của quá trình vô cơ hóa mẫu xảy ra như sau:

2H2SO4 2SO2 + O2 + 2H2O Oxide tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 đặc tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine, carbon, và hidro của acid amine tạo thành CO2, H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Mg, Ca chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, MgO, CaO Đuổi Amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + H2O

NH3 bay cùng với nước sang bình hứng chứa H3PO3

2NH4OH + 4H3PO3 (NH4)2B4O7 + 7H2O Hoặc H2SO4: 2NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H2O

b Phương pháp Coomasie Brilliant Blue G-250

Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue

G-250 liên kết với protein trong dung dịch acid, dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu dam cam đỏ Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy

ra và có màu xanh xuất hiện (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Hình 2-9 Dạng không proton hóa của Coomasie Blue G-250 (C 47 H 48 N 3 O 7 S 2 Na)

c Phương pháp quang phổ

Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280 nm của protein Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280 nm do các acid amine Trytophan, Tyrosin và một phần là Phenyl-Alanin Sự hấp thụ ở bước sóng 280 nm của chúng cũng thay đổi tùy loại protein, nhưng hệ số tắt đo được của mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh khiết (với hệ số tắt là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường truyền qua sóng 1cm) (Nguyễn Văn Mùi, 2001)