SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 17
2.3.1 Định tính
2.3.1.1 Định tính alkaloid
Để phát hiện sự có mặt của alkaloid trong mẫu, ngƣời ta thƣờng áp dụng nguyên tắc thử Webb với cách thử gồm 2 phần.
Phần 1: Hòa tan mẫu thử, lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 thuốc thử: Mayer và Dragendorff. Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo quy định là dƣơng tính. Tuy nhiên, nếu khơng có kết tủa cũng chƣa thể kết luận đƣợc là khơng có alkaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
Phần 2: Lấy mẫu ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: Chloroform: Ethanol 95o: NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (mơi trƣờng phải có tính bazơ). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung mơi đến cạn, thu đƣợc cặn. Hịa tan cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
2.3.1.2 Định tính hợp chất saponin
Chiết nguyên liệu với ethanol 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cặn khơ. Dùng cặn để làm các phản ứng định tính (Nguyễn Kim Phu Phụng, 2007).
Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phƣơng pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Hòa tan một lƣợng cặn tƣơng ứng với nƣớc nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt.
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 18
Lấy một lƣợng cặn tƣơng ứng với 1g bột Dƣợc liệu, đun cách thủy để hòa tan với 10mL nƣớc. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 mL HCl 0.1 N (pH = 1) Ống 2: thêm 2 mL NaOH 0.1 N (pH = 13)
Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền nhƣ nhau thì sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2011).
2.3.1.3 Định tính triterpenoid
Chiết nguyên liệu bằng diethylether. Dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch chloroform. Tiếp tục thêm 1 – 2 mL H2SO4 đậm đặc, nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid.
2.3.1.4 Định tính Polysaccharide
Ngâm mẫu thử trong dung mơi thích hợp. Nếu dịch chiết thu đƣợc cho màu xanh lục khi tác dụng với thuốc thử anthrone – acid sulfuric hoặc cho màu vàng da cam khi tác dụng với thuốc thử phenol – acid sulfuric thì kết luận có Polysaccharide.
Với anthrone là cetone, có cơng thức phân tử: C14H10O, CTCT
2.3.1.5 Định tính acid hữu cơ
Chiết nguyên liệu bằng nƣớc. Dịch chiết nƣớc cho vào một ống nghiệm, thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận có acid hữu cơ.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 19
2.3.2 Định lƣợng
2.3.2.1 Định lƣợng đƣờng tổng a. Phƣơng pháp dùng đƣờng kế
Dựa trên sự phân cực ánh sáng của saccharose. Dùng đƣờng kế đo năng suất quang phân cực của saccharose bằng cách đọc chỉ số hàm lƣợng trên đƣờng kế.
b. Phƣơng pháp Anthrone
Phản ứng anthrone là cơ sở một phƣơng pháp nhanh chóng và thuận tiện cho việc xác định đƣờng tổng hiện diện trong nguyên liệu. Thực hiện phản ứng tạo màu của đƣờng tổng khi có sự xuất hiện của thuốc thử anthrone (màu xanh lục hoặc xanh lục đậm). Cƣờng độ màu đƣợc đo ở bƣớc sóng 630 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn, ta tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng tổng của mẫu cần khảo sát (Pelagia Research Library).
c. Phƣơng pháp Phenol – Sulfuric
Thực hiện phản ứng tạo màu (da cam) giữa đƣờng tổng trong mẫu nghiên cứu với thuốc thử phenol khi có sự hiện diện của H2SO4. Cƣờng độ màu đƣợc đo bằng
máy quang phổ so màu ở bƣớc sóng 490 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn của saccharose tinh khiết với thuốc thử, tính ra hàm lƣợng đƣờng tổng của mẫu nghiên cứu (Bao và
cộng sự, 2001; Krishnaveni và cộng sự, 1984).
2.3.2.2 Định lƣợng Polysaccharide
Dựa vào phản ứng thuỷ phân PS thành monosaccharide, mono tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng λ = 490 nm. Từ đƣờng chuẩn xây dựng từ dung dịch D-Glucose tinh khiết, ta xác định đƣợc hàm lƣợng polysaccharide có trong mẫu.
2.3.2.3 Định lƣợng đƣờng khử a. Phƣơng pháp Bertrand
Phƣơng pháp dựa trên cơ sở trong môi trƣờng kiềm, các đƣờng khử (glucose, frutose, mantose ...) có thể dễ dàng khử CuO thành Cu2O (Cu2+ Cu+), kết tủa đồng
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 20
(I) oxide có màu đỏ gạch, qua đó định lƣợng đƣợc đƣờng khử (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Định lƣợng đƣờng khử thƣờng dùng thuốc thử Fehling. Thuốc thử Fehling là hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch CuSO4 – gọi là Fehling A, và dung dịch kiềm của muối Seignette (muối kali natri tactrate) – gọi là Fehling B.
Khi trộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa Cu(OH)2 màu xanh da trời.
CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối seignette tạo thành muối phức hòa tan.
HO-CHCOONa O-CHCOONa
Cu(OH)2 + Cu + 2H2O HO-CHCOOK O-CHCOOK
Muối phức trên là một hợp chất khơng bền. Các đƣờng có chứa nhóm aldehyde hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và đƣờng bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling.
CHO O-CHCOONa (CH-OH)4 + 2 Cu + 2 H2O CH2OH O-CHCOOK COOH OH-CHCOONa (CH-OH)2 + 2 + Cu2O CH2OH OH-CHCOOK Để định lƣợng Cu2O tạo thành, trƣớc hết oxi hóa nó bằng dung dịch sắt (III) hoặc bằng sắt kép sulfate trong môi trƣờng acid sulfuric, đồng (I) bị oxi hóa trở lại đồng (II), còn sắt (III) bị khử thành sắt (II).
Cu2O + 2Fe3+ + 2H+ 2Cu2+ + 2Fe2+ + H2O Lƣợng Fe2+
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 21
trong môi trƣờng acid.
5Fe2+ + MnO4- + 8H+ 5Fe3+ + Mn2+ + 4H2O
Từ lƣợng KMnO4 tiêu tốn trong chuẩn độ, có thể tính đƣợc lƣợng Cu2O và từ đó tính hàm lƣợng đƣờng trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lƣợng đồng và lƣợng đƣờng khử Bertrand.
Để đơn giản việc tính tốn, ngƣời ta lập bảng tỷ lệ trực tiếp giữa lƣợng dung dịch KMnO4 (1/30 N) và đƣờng khử bằng thực nghiệm. Biết đƣợc lƣợng dung dịch KMnO4 dùng chuẩn độ lƣợng đƣờng tạo thành, ta tính đƣợc lƣợng đƣờng có trung dung dịch cần phân tích.
Bảng 2-2 Bảng tỉ lệ giữa KMnO4 và đƣờng khử
KMnO4 1/30 N (mL) Glucose (mg) KMnO4 1/30 N (mL) Glucose (mg)
0,2 1 2 3 4 5 6 7 0,0 0,8 1,8 2,8 3,9 5,0 6,1 7,2 8 9 10 11 12 13 14 … 8,3 9,3 10,4 11,5 12,6 13,7 14,8 … b. Phƣơng pháp vi lƣợng Rodzevich
Phƣơng pháp dựa trên cơ sở trong môi trƣờng kiềm, các đƣờng khử (glucose, fructose, mantose, …) có thể khử dễ dàng đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid (Cu2+ Cu+) dƣới dạng kết tủa màu đỏ và qua lƣợng CuSO4 dƣ tính đƣợc lƣợng đƣờng khử. Cơ chế của q trình xảy ra theo các giai đoạn sau: (Nguyễn Văn Mùi, 2001)
Khi trộn hai dung dịch Fehling (I) và Fehling (II) với nhau thì xảy ra phản ứng theo hai giai đoạn.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 22
HO-CHCOONa O-CHCOONa
Cu(OH)2 + Cu + 2H2O HO-CHCOOK O-CHCOOK
Muối phức trên là một hợp chất khơng bền. Các đƣờng có chứa nhóm aldehyde hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+
thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và đƣờng bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling.
CHO O-CHCOONa (CH-OH)4 + 2 Cu + 2 H2O CH2OH O-CHCOOK COOH OH-CHCOONa (CH-OH)2 + 2 + Cu2O CH2OH OH-CHCOOK Lƣợng CuSO4 dƣ cho tác dụng với KI trong môi trƣờng H2SO4 sẽ giải phòng Iod tự do:
CuSO4 + 4KI + H2SO4 I2 + CuI2 + 2K2SO4
Chuẩn độ lƣợng iod tạo thành bằng Natri thiosunlfate (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính đƣợc lƣợng đƣờng khử có trong dung dịch.
SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng 23 OH NO2 O2N OH NH2 O2N
[O], oxi hóa khử
COOH COOH
Bảng 2-3 Bảng tìm lƣợng glucoza theo phƣơng pháp Rodzevich
Natri thiosunfat 0,1 N Glucoza Natri thiosunfat 0,1 N Glucoza mL 1 2 3 4 5 mg 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 Hiệu số 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 mL 6 7 8 9 10 mg 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 Hiệu số 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6
c. Phƣơng pháp Acid Dinitro – Salicylic (DNS)
Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu (đỏ cam) giữa đƣờng khử với thuốc thử acid dinitro-salicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu khảo sát (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
d. Phƣơng pháp màu trên phổ quang kế
Các loại đƣờng khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur, ion này có màu xanh đậm (xanh prusse). Nhờ vậy, ta có thể dùng phƣơng pháp này để định lƣợng đƣờng (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 24
CH2OH – (CHOH)4 – CHO + [O] HOOC – (CHOH)4 – COOH
2.3.2.4 Định lƣợng pectin
Trong môi trƣờng kiểm lỗng, pectin hịa tan sẽ giải phóng nhóm methoxyl thành rƣợu methylic và acid pectic tự do. Acid pectic tự do trong mơi trƣờng khi có mặt acid acetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat. Từ hàm lƣợng muối kết tủa có thể tính đƣợc hàm lƣợng pectin có trong mẫu phân tích (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
2.3.2.5 Định lƣợng hàm lƣợng Nitơ tổng a. Phƣơng pháp Kjeldahl
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể (động thực vật) hay mô đƣợc gọi là nitơ tổng. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Nitơ khơng có trong thành phần protein nhƣ các muối vô cơ, acid nitric, acid amin tự do, các peptit, ure, các dẫn xuất của ure,... là nitơ phi protein (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Trƣớc tiên, vơ cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Phản ứng của q trình vơ cơ hóa mẫu xảy ra nhƣ sau:
2H2SO4 2SO2 + O2 + 2H2O
Oxide tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 đặc tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine, carbon, và hidro của acid amine tạo thành CO2, H2O, cịn nitơ đƣợc giải phóng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Mg, Ca .... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, MgO, CaO .... Đuổi Amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 25
NH3 bay cùng với nƣớc sang bình hứng chứa H3PO3
2NH4OH + 4H3PO3 (NH4)2B4O7 + 7H2O Hoặc H2SO4: 2NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H2O
b. Phƣơng pháp Coomasie Brilliant Blue G-250
Phƣơng pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue G- 250 liên kết với protein trong dung dịch acid, dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu dam cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với cả nhóm kỵ nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hóa khơng xảy ra và có màu xanh xuất hiện (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Hình 2-9 Dạng khơng proton hóa của Coomasie Blue G-250 (C47H48N3O7S2Na)
c. Phƣơng pháp quang phổ
Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bƣớc sóng 280 nm của protein. Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280 nm do các acid amine Trytophan, Tyrosin và một phần là Phenyl-Alanin. Sự hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm của chúng cũng thay đổi tùy loại protein, nhƣng hệ số tắt đo đƣợc của mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh khiết (với hệ số tắt là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đƣờng truyền qua sóng 1cm) (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 26
Bảng 2-4 Hệ số tắt của các loại Protein liên quan tới hệ miễn dịch ở bƣớc sóng 280
Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt
IgG IgM IgA IgD 13,6 11,8 13,2 15,3 Chuỗi γ Chuỗi μ Chuỗi α Chuỗi nhẹ 13,7 13,9 12,3 12,3 Oncanavalin A Lactin Lens Calinaris
BSA
120 12,5 6,7
2.3.2.6 Định lƣợng Triterpenoid
a. Phương pháp khối lượng
Tách chiết bằng dung môi (thƣờng là Chloroform CHCl3), tinh chế và cân khối lƣợng triterpenoid (Gow và cộng sự, 2008).
b. Phương pháp điện di mao quản
Với chất chuẩn nội là GTA (Glycyrrhetinic acid), λ = 254 nm, dung môi acetonitrile 57%, dung dịch đệm natri borate 25nM có pH = 9,0; điện áp 27,5 KV, phƣơng pháp này chỉ dùng cho các phân tử phân cực và đã định lƣợng đƣợc 4 Ganoderic acid: GA-Mk, GA-Me, GA-S, GA-T (Na Dinga và cộng sự, 2010).
c. Phương pháp HPLC
- Điều kiện sắc ký: Bơm 6050, detector DAD với bƣớc sóng 252 nm, cột tách: RP-18 (7 μm, 250 x 25 mm), tốc độ dòng: 7,8 mL/phút, thời gian: 200 phút. Pha động: Hỗn hợp acetonitrile: acid acetic 2% = 1:3 ở 80 phút đầu, sau đó là tỉ lệ 1:2 (Deng-hai Chen and William Kuan-dee Chen, 2003).
- Định lƣợng 9 ganoderic acid, bao gồm: Ganoderic acid A (1), B (2), C (3), D (4), E (5), C5 (6), C6 (7), G (8) và ganoderenic acid G (9). Hàm lƣợng của các 9 ganoderic acid trong Ganoderma tsugae trong khoảng 0,641 – 0.783%.
Ƣu điểm: Phƣơng pháp có độ chính xác và độ nhạy cao.
Nhƣợc điểm: với mỗi cấu tử địi hỏi phải có một chất chuẩn riêng, nhƣ vậy để định lƣợng tất cả triterpenoid trong nấm linh chi, cần phải có hơn 100 chất chuẩn, các chất này chỉ có thể phân lập từ nấm linh chi. Việc sử dụng HPLC để đánh giá nhanh
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 27
chất lƣợng linh chi là quá tốn kém và hiện nay gần nhƣ là không tƣởng. Việc tách ra thành các phân đoạn hẹp để có thể chạy sắc ký cho hơn 100 cấu tử này cũng không phải là việc đơn giản. Cho tới nay, mới áp dụng đƣợc cho khoảng 9 cấu tử đều là ganoderic acid.
d. Định lượng bằng phương pháp trắc quang UV-VIS ♦ Định luật Lambert-Beer và tính cộng tính của độ hấp thụ
Định luật Lambert-Beer
Ở điều kiện dung dịch có nồng độ đủ lỗng, định luật Lambert-Beer thể hiện qua công thức (Trần Tứ Hiếu, 2003):
Aλ = ελ.L.C Trong đó:
Aλ: độ hấp thụ quang của cấu tử ở bƣớc sóng λ.
ελ: hệ số hấp thụ quang của cấu tử ở bƣớc sóng λ. L: chiều dày cuvet đựng mẫu.
C: nồng độ cấu tử.
Tính cộng tính của độ hấp thụ
Tính chất cộng tính độ hấp thụ: Độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp tại một bƣớc sóng bất kỳ bằng tổng độ hấp thụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp tại bƣớc sóng đó.
Phƣơng trình biểu diễn tính chất cộng tính độ hấp thụ (Nguyễn Thị Kim Phụng, 2007).
Aλ = ∑ = ∑ .L. Trong đó:
Ci: nồng độ cấu tử thứ i trong dung dịch.
Aλ: độ hấp thụ của dung dịch chứa n cấu tử tại bƣớc sóng λ. Ai,λ: độ hấp thụ của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng λ.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 28
εi,λ: hệ số hấp thụ phân tử của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng λ. n: số cấu tử hấp thụ ánh sáng có trong dung dịch.
Nguyên nhân làm sai lệch tính chất cộng tính độ hấp thụ:
- Quá trình tạo phức dị nhân và quá trình liên hợp giữa các phức. - Sự tán xạ ánh sáng ở các máy đo.
♦ Trắc quang trực tiếp bằng UV
Định lƣợng nhanh tổng triterpenoid với chất chuẩn là ganoderic acid F, Đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu ở 257 nm. Dựa vào đƣờng chuẩn suy ra nồng độ tổng