SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 17
2.3.1 Định tính
2.3.1.1 Định tính alkaloid
Để phát hiện sự có mặt của alkaloid trong mẫu, ngƣời ta thƣờng áp dụng nguyên tắc thử Webb với cách thử gồm 2 phần.
Phần 1: Hòa tan mẫu thử, lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 thuốc thử: Mayer và Dragendorff. Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo quy định là dƣơng tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa cũng chƣa thể kết luận đƣợc là không có alkaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
Phần 2: Lấy mẫu ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: Chloroform: Ethanol 95o: NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trƣờng phải có tính bazơ). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu đƣợc cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
2.3.1.2 Định tính hợp chất saponin
Chiết nguyên liệu với ethanol 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cặn khô. Dùng cặn để làm các phản ứng định tính (Nguyễn Kim Phu Phụng, 2007).
Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phƣơng pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Hòa tan một lƣợng cặn tƣơng ứng với nƣớc nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt.
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 18
Lấy một lƣợng cặn tƣơng ứng với 1g bột Dƣợc liệu, đun cách thủy để hòa tan với 10mL nƣớc. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 mL HCl 0.1 N (pH = 1) Ống 2: thêm 2 mL NaOH 0.1 N (pH = 13)
Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền nhƣ nhau thì sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2011).
2.3.1.3 Định tính triterpenoid
Chiết nguyên liệu bằng diethylether. Dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch chloroform. Tiếp tục thêm 1 – 2 mL H2SO4 đậm đặc, nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid.
2.3.1.4 Định tính Polysaccharide
Ngâm mẫu thử trong dung môi thích hợp. Nếu dịch chiết thu đƣợc cho màu xanh lục khi tác dụng với thuốc thử anthrone – acid sulfuric hoặc cho màu vàng da cam khi tác dụng với thuốc thử phenol – acid sulfuric thì kết luận có Polysaccharide.
Với anthrone là cetone, có công thức phân tử: C14H10O, CTCT