Sử dụng phần mềm Excel và Origin 8.0
3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính
Quét phổ một dãy chuẩn có nồng độ thay đổi, dựa vào phổ đồ, vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ. Quan sát sự phụ thuộc đến khi khơng cịn tuyến tính.
3.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn
- Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn.
- Xác định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình).
- Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng khảo sát sẽ là một đƣờng biểu diễn có phƣơng trình: y = ax + b.
Trong đó, a: giá trị độ dốc slope
b: giá trị hệ số chặn intercept Hệ số tƣơng quan:
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 49
∑( ̅)( ̅) √∑( ) √∑( ̅) Với 0,995 < R 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt.
3.4.3 Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Trong đó: SD = Sy/x: độ lệch chuẩn của tín hiệu
a: độ dốc của đƣờng chuẩn
- Sai số tương đối (RE):
( )
Trong đó: C: nồng độ của chất xác định đƣợc (μg/mL) C0: nồng độ của chất đã biết trƣớc (μg/mL)
- Độ lặp lại
Độ lặp lại đƣợc đánh giá qua giá trị độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD)
√∑ ( ̅)
; ( ) ̅
Trong đó: xi: giá trị nồng độ thứ i (μg/mL)
: giá trị trung bình của nồng độ i ở n mẫu (μg/mL) n: số mẫu thí nghiệm.
Để ƣớc lƣợng sai số định lƣợng (giá trị đó có đƣợc chấp nhận hay khơng) bằng cách dựa vào phƣơng trình Horwitz (RSDR):
( ) ( )
Trong đó: C: nồng độ (đƣợc biểu diễn dƣới dạng phân số)
RSDR: độ lệch chuẩn tƣơng đối khi xác định chất phân tích có
nồng độ C đó ở các phịng thí nghiệm khác nhau (dùng bất cứ phƣơng pháp phân tích nào). Khi phân tích chất có nồng độ C trong phịng thí
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 50
nghiệm với một phƣơng pháp phân tích, nếu đạt đƣợc độ lặp lại với RSD(%) RSDPTN = ½.RSDR là chấp nhận đƣợc.
- Độ đúng
Độ đúng của phƣơng pháp có thể xác định đƣợc qua độ thu hồi (Rev) khi phân tích mẫu thật đã thêm chuẩn một lƣợng xác định chất cần phân tích.
( ) Trong đó:
a: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu (μg/mL)
CT: nồng độ chất xác định đƣợc trong mẫu sau khi thêm chuẩn (μg/mL) Ca: nồng độ chất xác định đƣợc trong mẫu khi chƣa thêm chuẩn (μg/mL)
3.4.4 Xử lí và kiểm tra số liệu thực nghiệm
- Khoảng tin cậy của số liệu kết quả nghiên cứu ̅ ̅ ( )
√
• : là giá trị trung bình của kết quả nghiên cứu sau n thí nghiệm
• t(P,f): giá trị của chuẩn Student với độ tin cậy P = 0,95 và bậc tự do f = n–1 • S: độ lệch chuẩn.
- So sánh kết quả phân tích của hai phƣơng pháp khác nhau. So sánh hai phƣơng sai phƣơng sai và bằng chuẩn Fisher:
• Tính (Ftính 1) • Tra bảng tìm giá trị F (P = 0,95, f1 = n1 – 1, f2= n2 – 1) • So sánh Ftinh và F(p,f1, f2): Nếu Ftính<F(p,f1, f2) , đồng nhất. Nếu Ftính>F(p,f1, f2) , không đồng nhất. So sánh và :
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 51
Trƣờng hợp đồng nhất:
Tính √ là phƣơng sai chung của hai tập số liệu thí nghiệm) theo cơng thức: √ √( ) ( ) ( ) ( ) Tính | ̅ ̅̅̅| √ Tra bảng tìm giá trị t(p, f = n1 + n2 – 2) So sánh ttính và tlt: Nếu ttính<t(p, f) đồng nhất ở mức ý nghĩa p.
Nếu ttính>t(p, f) không đồng nhất ở mức ý nghĩa p. Trƣờng hợp , không đồng nhất: | ̅ ̅̅̅| √ √ Tra bảng tìm giá trị t(p, f = n1 + n2 – 2) So sánh ttinh và tlt: Nếu ttính<t(p, f) đồng nhất ở mức ý nghĩa p.
Nếu ttính>t(p, f) khơng đồng nhất ở mức ý nghĩa p. So sánh ttính và t(p, f): (tƣơng tự nhƣ trên).
Vận dụng vào mẫu nguyên liệu: nấm linh chi
Pha các mẫu thực cần đo. Nồng độ trong mẫu khơng đƣợc vƣợt ra ngồi giới hạn cao nhất và thấp nhất của đƣờng chuẩn, tốt nhất là phải nằm ở vùng giữa đƣờng chuẩn.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 52
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết 4.1.1 Khảo sát dung môi
Bảng 4-1 Khảo sát lƣợng chất chiết thu hồi với từng loại dung môi.
Dung môi Lƣợng chất chiết thu hồi (%)
n-hexan Chloroform EtOH 96% EtOH 70% EtOH 45% H2O 3,06 6,52 9,01 9,95 9,12 10,82
Hàm lƣợng chất chiết đạt cao nhất với dung môi nƣớc. Nƣớc và ethanol là những dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thân thiện với môi trƣờng, giá thành rẻ hơn so với hexan hay Chloroform. Chúng tôi nhận thấy hàm lƣợng chất chiết giữa các EtOH nồng độ khác nhau khơng có sự chênh lệch đáng kể, tuy nhiên để thuận lợi cho q trình cơ quay, chúng tơi quyết định chọn EtOH 96% thay vì các nồng độ khác. Với kết quả nhƣ vậy các khảo sát tiếp theo sẽ đƣợc thực hiện chủ yếu trên dung môi nƣớc và EtOH 96%.
4.1.2 Khảo sát nhiệt độ
Bảng 4-2 Khảo sát nhiệt độ
Nhiệt độ (ºC) Lƣợng chất chiết thu hồi (%)
EtOH 96% H2O 50 70 90 12,85 14,27 14,50 13,05 14,90 15,10
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 53
4.1.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi
Bảng 4-3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi
Tỉ lệ nl/dm
Lƣợng chất chiết thu hồi (%)
EtOH 96% H2O 1/20 1/30 1/40 7,48 9,95 10,1 9,33 10,82 11,1
4.1.4 Khảo sát thời gian chiết
Bảng 4-4 Khảo sát thời gian chiết
Thời gian (h)
Lƣợng chất chiết thu hồi (%)
EtOH 96% H2O 5 7 9 8,47 9,95 10,28 10,9 10,82 11,3
Với các thông số nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ chiết, tỉ lệ ngun liệu – dung mơi có các khoảng biến thiên là Z1 = 30 ºC (nhiệt độ phòng) – 90 ºC, Z2 = 5h – 9h, Z3 = 1/10 – 1/40, lập một quy hoạch trực giao cấp một, hai mức tối ƣu, đƣợc phƣơng trình hồi quy mơ tả đúng thực nghiệm là:
Y = 6,69 + 0,53X1 + 0,09X2 – 0,15X3
Hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại tại các điều kiện nhiệt độ chiết 90 ºC, thời gian chiết 9 h và tỉ lệ nguyên liệu – dung mơi là 1/40. Tuy nhiên, với mục đích lựa chọn các thơng số q trình chiết sao cho hàm lƣợng chất chiết thu hồi cao với điều kiệu không ảnh hƣởng tới chất lƣợng các hợp chất có trong nấm linh chi (cùng một số điều kiện khách quan khác nhƣ: giá thành hóa chất, nguyên liệu, thiết bị …), chúng tôi lựa chọn các thông số sau:
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 54
Nhiệt độ chiết: 70 ºC. Thời gian chiết: 7 h.
Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/20 hoặc 1/30 tùy khảo sát.
4.1.5 Khảo sát phƣơng pháp chiết
Với các thông số đã lựa chọn nhƣ trên, chúng tôi tiến hành chiết với 2 phƣơng pháp, chiết hồi lƣu và chiết soxhlet, ngoài ra chúng tơi cịn khảo sát ở nhiệt độ cao hơn (100 ºC). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 4-5 Khảo sát phƣơng pháp chiết
Thời gian (h)
Lƣợng chất chiết thu hồi (%)
70 ºC 100 ºC
Chiết soxhlet
Chiết hồi lƣu (1 lần) Chiết hồi lƣu (3 lần)
7,98 5,23 12,89 14,26 6,20 13,05 Nhận xét ♦ Chiết Soxhlet
Ƣu điểm của phƣơng pháp
Chiết đƣợc tối đa tƣơng ứng với nhiệt độ xác định.
Hạn chế đƣợc thể tích dung mơi tối đa (thuận lợi cho quá trình xử lý tiếp theo).
Dễ dàng xác định tín hiệu dừng (dung dịch trong suốt khơng màu).
Nhƣợc điểm
Lƣợng mẫu nhỏ (khoảng vài gam đến vài chục gam).
Nhiệt độ tại bình chiết cao (bằng nhiệt độ đun), nhƣ vậy dung dịch chứa hoạt chất ở nhiệt độ cao trong thời gian dài, hoạt chất có khả năng bị phân hủy. Trong khi đó, nhiệt độ tại nơi xảy ra cân bằng của quá trình chiết (trụ chiết) lại thấp hơn so với bình chiết khoảng 30 ºC, quá trình chiết xảy ra ở nhiệt độ thấp cho hiệu quả chiết không triệt để.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 55
Với các đặc điểm trên, phƣơng pháp chiết soxhlet có thể đƣợc khảo sát để nghiên cứu định lƣợng hoạt chất, với các yếu tố phải khảo sát là: thời gian chiết, dung mơi, thể tích dung mơi, nhiệt độ chiết, cần xem xét chất đƣợc chiết ra có bị phân hủy hay khơng.
♦ Chiết hồi lƣu
Ƣu điểm của phƣơng pháp
Lƣợng mẫu có thể lớn hơn so với chiết soxhlet, nhƣng vẫn hạn chế trong điều kiện phịng thí nghiệm.
Nhiệt độ tại nơi xảy ra q trình chiết là nhiệt độ sơi của dung môi (100 ºC), cao hơn chiết soxhlet, nên có thể chiết nhanh hơn.
Nhƣợc điểm
Muốn chiết đƣợc tối đa (đến khi dịch chiết trong suốt không màu), phải chiết nhiều lần, vì vậy tổng thể tích dịch chiết thƣờng lớn hơn nhiều so với chiết soxhlet, gây khó khăn cho các q trình về sau.
Mẫu và hoạt chất đều phải tiếp xúc với nhiệt độ sôi của dung môi trong thời gian dài.
Do hàm lƣợng của phƣơng pháp hồi lƣu kém hơn hẳn so với chiết soxhlet, mặt khác, dịch chiết còn rất đậm, chứng tỏ chiết hồi lƣu 1 lần vẫn chƣa triệt để, vì vậy chúng tơi tiến hành chiết hồi lƣu mẫu 3 lần và gộp dịch chiết lại.
Song song đó, khi tăng nhiệt độ, hàm lƣợng chất chiết thu hồi của phƣơng pháp soxhlet là vƣợt trội, nhƣng do điều kiện khảo sát không cho phép nhiệt độ quá cao, nên chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp chiết hồi lƣu nhiều lần để tiến hành các khảo sát sau này, đặc biệt là quy trình tách chiết polysaccharide và triterpenoid.
4.2 Kết quả khảo sát dƣợc tính nấm linh chi 4.2.1 Định tính alkaloid 4.2.1 Định tính alkaloid
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.1 thu đƣợc kết quả nhƣ sau Thử với thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa màu trắng .
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 56
Thử với thuốc thử Dragendorff: Dịch chuyển sang màu nâu. Kết luận: Nấm linh chi có chứa alkaloid.
Hình 4-1 Phản ứng định tính Alkaloid
A. Thử với thuốc thử Dragendorff; B. Thử với thuốc thử Mayer
4.2.2 Định tính saponin
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.2 thu đƣợc kết quả nhƣ sau Thử nghiệm tính tạo bọt: Quan sát thấy bọt bền hơn 60 phút.
Kết luận: Nấm linh chi có chứa saponin.
Hình 4-2 Thử nghiệm tính tạo bọt
A. Ống nghiệm lúc mới thử nghiệm; B. Ống nghiệm ở thời điểm 60 phút
A B
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 57
Thử nghiệm Fontan – Kaudel: Quan sát thấy ống nghiệm thêm NaOH 0,1 N
có bọt cao hơn so với ống khi thêm HCl 0,1 N.
Kết luận: Nấm linh chi có saponin steroid
Hình 4-3 Thử ngiệm Fontan – Kaudel
A. Ống thêm dung dịch HCl; B. Ống thêm dung dịch NaOH
4.2.3 Định tính triterpenoid
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.3 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục.
Kết luận: Nấm linh chi có chứa triterpenoid.
Hình 4-4 Phản ứng Liebermann – Burchard định tính Triterpenoid
a b
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 58
4.2.4 Định tính polysaccharide
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.4 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: quan sát phản ứng thấy xuất hiện màu vàng da cam.
Kết luận: Nấm linh chi có chứa polysaccharide.
Hình 4-5 Phản ứng định tính polysaccharide
4.2.5 Định tính acid hữu cơ
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.5 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: quan sát thấy xuất hiện bọt rất ít.
Kết luận: Nấm linh chi hầu nhƣ khơng có acid hữu cơ.
4.3 Kết quả xác định hàm lƣợng một số hợp chất có trong linh chi
4.3.1 Xác định độ ẩm
Giấy lọc đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi: m0 = 1,45 Khối lƣợng giấy lọc và bột nấm trƣớc khi sấy: m = 6,55
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 59
4.3.2 Định lƣợng đƣờng tổng theo phƣơng pháp phenol – sulfuric Xây dựng đƣờng chuẩn Xây dựng đƣờng chuẩn
Bảng 4-6 Bảng đo mật độ quang của đƣờng
Hàm lƣợng đƣờng (µg/mL) Mật độ quang 10 20 30 40 50 60 70 0,177 0,350 0,533 0,617 0,780 0,944 1,110
Hình 4-6 Đƣờng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ saccharose
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 60
y = 0,0155x + 0,023 với R = 0,998
Trong đó: x: nồng độ của dung dịch cần xác định giá trị mật độ quang (μg/mL) y: giá trị mật độ quang R: hệ số tƣơng quan.
Mật độ quang đo đƣợc của mẫu ymẫu = 1,099 đã đƣợc pha loãng 15 lần
Hàm lượng đường tương ứng có trong mẫu
Ta có hàm lượng đường tổng chứa trong 100g mẫu linh chi
Với mẫu 2 và mẫu 3, kết quả thu đƣợc lần lƣợc là 5,213 (g) và 5,202 (g). Có thể nhận thấy sai số là rất nhỏ, kết quả giữa 3 mẫu không xê dịch nhiều nên chúng tôi không xử lý thông kê số liệu.
Vậy hàm lượng đường tổng trung bình có trong 100g mẫu nấm linh chi
4.3.3 Định lƣợng Polysaccharide
Xác định khoảng tuyến tính
Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn sau khi xử lý bằng phenol- sulfuric đƣợc chỉ ra ở bảng 4-7.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 61
Bảng 4-7 Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn.
STT Nồng độ (μg/mL) Độ hấp thụ quang 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0,000 0,204 0,409 0,611 0,824 1,021 1,155 1,201 1,446
Độ tuyến tính của đƣờng chuẩn đƣợc đánh giá thông qua giá trị hệ số tƣơng quan. Hệ số tƣơng quan R đạt yêu cầu: 0,995≤ R≤ 1 hay 0,99 ≤ R2≤ 1.
Bảng 4-8 Hệ số tƣơng quan ở các khoảng nồng độ khác nhau
STT Khoảng nồng độ Hệ số tƣơng quan Phƣơng trình hồi quy
1 2 3 4 5 0 – 100 0 – 125 0 – 150 0 – 175 0 – 200 0,9999 0,9999 0,9986 0,9914 0,9934 0,0082 X – 0,0014 0,0082 X – 0,0004 0,0079 X – 0,0126 0,0072 X – 0,0443 0,0071 X – 0,0516
Từ bảng 4-8 chúng tơi thấy rằng độ tuyến tính của đƣờng chuẩn tốt nhất ở trong khoảng từ 0 - 125 μg/mL, nếu tăng nồng độ D-glucose, độ tuyến tính bắt đầu giảm và vẫn cịn tuyến tính trong khoảng 0 - 150 μg/mL. Tùy theo khoảng nồng độ của mẫu phân tích mà sử dụng khoảng nồng độ thích hợp. Đối với mẫu đang khảo sát, chúng tôi chọn khoảng nồng độ từ 0 - 125 μg/mL để xây dựng đƣờng chuẩn.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 62
Ta xây dựng đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0-125 μg/mL.
Hình 4-7 Đƣờng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ D- glucose
Từ hình 4-7 chúng tơi có phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 0,0082x – 0,0004 với R = 0,9999 Trong đó:
x: nồng độ của dung dịch cần xác định giá trị mật độ quang (μg/mL) y: giá trị mật độ quang R: hệ số tƣơng quan.
Mật độ quang đo đƣợc của mẫu ymẫu = 0,863 sau khi đã pha lỗng 3 lần Hàm lƣợng D-Glucose có trong mẫu
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 63
Hàm lƣợng Polysaccharide có trong 100 g mẫu linh chi:
Với mẫu 2 và mẫu 3, mật đo quang đo đƣợc (ymẫu) lần lƣợt là 0,861 và 0,862. Khi quy ra hàm lƣợng polysaccharide có trong 100g mẫu linh chi, số liệu là giống nhau, chúng tôi không xử lý thống kê số liệu.
4.3.4 Định lƣợng đƣờng đơn
Đƣờng đơn có trong 100 g mẫu linh chi:
4.3.5 Định lƣợng đƣờng khử
Khi dùng 10 mL dung dịch đã chuẩn bị để xác định lƣợng đƣờng khử, chúng tôi không nhận thấy xuất hiện kết tủa khi cho hỗn hợp Fehling. Vì vậy, chúng tơi dùng 40mL dung dịch cần xác định đƣờng khử.
Tiến hành chuẩn độ dung dịch sắt (II) bằng KMnO4, chúng tôi nhận thấy dung dịch chuyển từ màu vàng nhạt sang màu hồng. Màu dung dịch bền trong khoảng 20-30 giây, sau đó chuyển lại về màu vàng. KMnO4 dùng để chuẩn độ là 1 mL.
Hình 4-8 A. Trƣớc khi chuẩn độ - B. Sau khi chuẩn độ - C. Sau khi chuẩn 30 giây
Từ đó, tra bảng tỷ lệ giữa KMnO4 1/30 N và đƣờng khử của Bertrand, ta đƣợc giá trị a = 0,8 (mg)
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 64
Với mẫu 2 và mẫu 3, lƣợng KMnO4 vẫn là 1 mL, nên hàm lƣợng đƣờng khử vẫn là 2%, chúng tôi không xử lý thông kê số liệu.