Phƣơng pháp
Chúng tôi thực hiện định lƣợng Polysaccharide theo phƣơng pháp so màu đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.2.2.
Thực hiện
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 37
- Cân chính xác 0,25 g D-glucose cho vào bình định mức 250 mL rồi định mức bằng nƣớc cất tới vạch ta đƣợc dung dịch A. Nhƣ vậy, nồng độ dung dịch D-glucose là 1 mg/mL (1000 μg/mL).
- Lấy 50 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ 100 μg/mL (dung dịch B).
- Lần lƣợt lấy 0; 25; 50; 75; 100 mL dung dịch B pha thành 100 mL thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/mL.
- Lấy 125 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ 250 μg/mL (dung dịch C).
- Lần lƣợt lấy 50; 60; 70; 80 mL dung dịch C pha thành 100 mL thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 μg/mL.
- Mỗi mẫu lấy 1 mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Đặt các ống nghiệm vào cốc nƣớc sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớc sóng 490 nm, thu đƣợc các giá trị độ hấp thụ quang.
- Từ các kết quả thu đƣợc, xây dựng đƣờng chuẩn.
Xác định đƣờng trong mẫu
- Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm chịu nhiệt.
- Thêm 5 mL HCl 2,5 M vào ống nghiệm, giữ ống nghiệm trong nƣớc sôi 3 giờ rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.
- Trung hoà acid dƣ bằng Na2CO3 đến khi không còn bọt khí thoát ra.
- Dịch chiết nƣớc đƣợc cô về 100 mL, lấy 10 mL dịch chiết trên tủa với EtOH 96º. Quay ly tâm để thu kết tủa, hoà tan kết tủa bằng nƣớc rồi định mức thành 100 mL.
- Lấy 1 mL dung dịch trên cho vào ống nghiệm có nút đậy kín. Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều.
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 38
- Đặt các ống nghiệm vào cốc nƣớc sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Hình 3-1 Phổ UV-Vis D-glucose chuẩn của một số mẫu sau khi xử lý bằng phenol-sulfuric
- Từ hình 3-1 chúng tôi thấy rằng tất cả các mẫu đều có bƣớc sóng hấp thụ cực đại tại 490 nm nên chúng tôi dùng tia bức xạ có bƣớc sóng 490 nm để định lƣợng Polysaccharide bằng phƣơng pháp phenol-acid sulfuric.
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớc sóng 490 nm. Kết hợp với phƣơng trình đƣờng chuẩn, suy ra hàm lƣợng Polysaccharide tinh khiết có chứa trong mỗi mẫu Polysaccharide tổng thô.
Thực nghiệm
Tiến hành thực hiện định lƣợng polysaccharide của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1 g) với các bƣớc thực hiện và tính toán kết quả nhƣ trên.