Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của cao hexan lá bình bát dây coccinia grandis (l ) j voigt họ cucurbitaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC ĐỀ TÀI: CHUYÊN NGÀNH HÓA HỮU CƠ Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Tiến Dũng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Dân An Tp.HCM, tháng 5- 2013 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Tiến Dũng truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp em hồn thành tốt q trình làm khóa luận Em gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Mai Đình Trị, phịng chất có hoạt tính sinh học giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến giúp em hồn thành tốt khóa luận Em xin cảm ơn q thầy khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM truyền đạt cho em kiến thức quý báu giúp em có kiến thức hành trang giúp ích cho việc hồn thành khóa luận Em gởi lời cảm ơn đến anh chị bạn làm đề tài phịng hợp chất có hoạt tính sinh học đặc biệt bạn lớp làm khóa luận ln giúp đỡ góp ý cho em suốt q trình làm khóa luận Con gởi lời cảm ơn chân thành đến ba, mẹ, anh chị động viên, hỗ trợ mặt tinh thần mà lẫn vật chất để n tâm hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Nguyễn Thị Dân An MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Giới thiệu bình bát dây[1,4] 11 1.1.1 Đặc điểm thực vật 11 1.1.2 Phân bố sinh thái[1,4] 13 1.2 Tác dụng dược lý 13 1.2.1 Theo y học cổ truyền [1] 13 1.2.2 Theo y học đại [16] 14 1.3 Thành phần hóa học bình bát dây[8] 17 1.4 Hoạt tính chống oxi hóa [3,9,15] 21 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 23 2.1.1 Hóa chất 23 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 23 2.2 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Nguyên liệu 24 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.2.1 Phương pháp phân lập chất 24 2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hóa học 24 2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH[3,9.15] 25 2.3 Thực nghiệm 26 2.3.1 Điều chế cao ethanol 26 2.3.2 Cô lập tinh chế hợp chất 27 2.3.3 Sơ đồ phân lâp hợp chất 30 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Hợp chất BBH7 Error! Bookmark not defined 3.2 Hoạt tính chống oxi hóa Error! Bookmark not defined CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Dây bình bát Hình 1.2 Lá bình bát dây Hình 1.3 Quả bình bát dây Hình 1.4 Hoa bình bát dây DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết sắc kí cột cao Hexan Bảng 2.2: Kết SKC phân đoạn H5 Bảng 3.1: Bảng so sánh số liệu phổ 1H NMR 13 C NMR DFA V với phổ 1H NMR 13C NMR cycloartanol Bảng 3.2: Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH cao chiết Bình bát dây Sơ đồ 1: Quy trình chiết Sơ đồ 2: Quy trình phân lập hợp chất DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 3: Phổ DEPT hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 4: Phổ HSQC hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 5: Phổ HMBC hợp chất BBH7 dung môi CDCl DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh H Hexane C Chloroform EA Ethyl acetate EtOH Ethanol MeOH Methanol Tiếng Việt SKLM Sắc kí lớp mỏng SKC Sắc kí cột Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Nuclear Magnetic Resonance 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance 1H-NMR Hydro (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance DEPT carbon (13) carbon (1) Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarization Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Coherence HSQC nhiều liên kết Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua Correlation liên kết δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học Ppm Part per million Phần triệu Mp Melting point Điểm nóng chảy S Singlet Mũi đơn D Doublet Mũi đôi Dd Double of doublet Mũi đôi đôi J Coupling constant Hằng số ghép spin (M)Hz (Mega) Hertz G Gram Mg Milligram Kg Kilogram LỜI MỞ ĐẦU Từ lâu, có nguồn thực vật đa dạng phong phú có nhiều lồi thực vật có ích đậu xanh dùng để nhiệt, giải độc tiêu khát; gừng có tác dụng ngăn ngừa đau thắt ngực, kích thích tiêu hóa Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật ngày đại Các nhà khoa học quan tâm nhiều đến việc tạo sản phẩm từ thiên nhiên có ứng dụng nhiều lĩnh vực như: y học, dược học, sinh học nơng nghiệp,…Bên cạnh nhà hóa học tiến hành tách chiết, lập, bán tổng hợp ngày nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo sản phẩm từ thiên nhiên để nâng cao chất lượng sống khơng lãng phí nguồn thực vật phong phú Bình bát dây Coccinia grandis L thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) loại dây leo chúng hoa kết trái quanh năm phân bố rộng rãi Việt Nam với hoạt tính sinh học kháng khuẩn, chống oxi hóa, trị bệnh tiểu đường,…Ngồi ra, người ta cịn sử dụng chế biến nhiều loại ăn khác Trên Thế giới có nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học bình bát dây Việt Nam cơng trình nghiên cứu lồi có Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxi hóa từ cao hexan bình bát dây 2.3.3 Sơ đồ phân lâp hợp chất Bột khô 1,4 kg − Ngâm dầm với EtOH 960 − Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol 300g − Trích pha lỏng với dung mơi: hexan, ethyl acetate, nước − Cô quay thu hồi dung môi Cao hexan Cao ethyl acetate Cao nước 171g 9,8g 76,1g SKC silica gel pha thường với hệ dung môi H:EA Phân đoạn H1 Phân đoạn H3 Phân đoạn H5 Phân đoạn H6 m=112.33g m=3.93g m=5.20g m=10.16g Phân đoạn H2 Phân đoạn H4 Phân đoạn H7 m=13.70g m=3.90g m=23.50g BBH7 m=1.5mg Sơ đồ 2: Quy trình phân lập hợp chất CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hợp chất BBH7 Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl ) δ H , ppm: 3,29 (1H; dd; 5,0 Hz; 10,5 Hz; H-3); 0,96 (3H; s; H-18); 0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a); 0,56 (1H; d; 4,5 Hz; H-19b); 0,87 (3H; d; 6,5 Hz; H-21); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-26); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-27); 0,96 (3H; s; H-28); 0,81 (3H; s; H-29); 0,89 (3H; s; H-30) Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl ) δ C , ppm: 32,9 (C-1); 30,4 (C-2); 78,8 (C-3); 40,5 (C-4); 47,9 (C-5); 21,1 (C-6); 26,0 (C-7); 47,1 (C-8); 20,0 (C-9); 26,1 (C-10); 26,5 (C-11); 31,9 (C-12); 45,3 (C-13); 48,8 (C-14); 35,6 (C-15); 28,1 (C-16); 52,6 (C-17); 18,0 (C-18); 29,9 (C-19); 36,1 (C-20); 18,3 (C21); 36,4 (C-22); 24,1 (C-23); 39,5 (C-24); 28,0 (C-25); 22,5 (C-26); 22,8 (C-27); 25,4 (C-28); 14,0 (C-29); 19,3 (C-30) 21 20 22 26 18 28 27 14 10 HO 17 12 19 30 29 cycloartanol Hợp chất BBH7 thu dạng tinh thể hình kim, cho phản ứng dương tính với thuốc thử đặc trưng terpenoid Phổ 1H NMR (phụ lục ) cho thấy tín hiệu bốn nhóm metyl bậc bốn δ H [0,96 (3H, s, H-18); 0,96 (3H, s, H-28); 0,81 (3H, s, H-29); 0,89 (3H, s, H-30)], ba nhóm metyl bậc ba δ H [0,87 (3H; d; 6,5 Hz; H-21); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-26); 0,86 (3H; d; 6,5 Hz; H-27)], hai proton không tương đương đặc trưng vòng cyclopropyl δ H [ 0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a) 0,56 (1H, d, 4,5 Hz; H-19b)] Trên phổ 1H NMR xác nhận có mặt nhóm β-OH gắn C-3 δ H 3,29 (1H; dd; 5,0 Hz; 10,5 Hz; αH-3) Phổ 13C NMR (phụ lục 2) kết hợp kỹ thuật DEPT (phụ lục ) cho thấy BBH7 có 30 carbon có nhóm -CH , 12 nhóm -CH , nhóm -CH, carbon bậc bốn Sự diện nhóm carbinol (–CH-OH) tái khẳng định tín hiệu δ C 78,8 phổ 13 C NMR Từ kết phổ nêu trên, công thức phân tử hợp chất BBH7 C 30 H 52 O với độ bất bão hòa Như BBH7 hợp chất triterpenoid năm vòng Phổ HSQC (phụ lục ) cho thấy hai tín hiệu proton trường cao δ H [0,33 (1H; d; 4,5 Hz; H-19a) 0,56 (1H; d; 4,5 Hz; H-19b)] gắn carbon bậc hai δ C 29,9 (C-19) Đồng thời phổ HMBC (phụ lục 5) cho thấy proton H-19a tương quan với hai carbon bậc bốn δ C [20,0 (C-9) 26,1 (C-10)] chứng tỏ BBH7 có chứa vịng cyclopropyl Điều chứng tỏ khung BBH7 cycloartan Ngoài kiện phổ NMR xác định hợp chất BBH7 mang nhóm -OH cấu hình β phân tử Với kết phân tích phổ nêu trên, kết hợp đối chiếu với số liệu phổ hợp chất cycloartanol nhận thấy có trùng hợp [6] (bảng 3.1) Do đó, hợp chất BBH7 xác định 9,19-cyclolanostan-3-ol (cycloartanol) Bảng 3.1: Bảng so sánh số liệu phổ 1H NMR 13C NMR DFA V với phổ 1H NMR 13C NMR cycloartanol BBH7 (CDCl ) Vị trí δC, ppm δ H , ppm (J, Hz) Cycloartanol (CDCl ) DEPT δC, ppm 32,9 -CH 32,1 30,4 -CH 30,0 δ H , ppm (J, Hz) 78,8 3,29 (1H, dd, 5,0; 10,5) -CH-O 79,0 40,5 >C< 45,5 47,9 -CH 52,4 21,1 -CH 22,4 26,0 -CH 26,3 47,1 -CH 48,1 20,0 >C< 21,3 10 26,1 >C< 26,6 11 26,5 -CH 27,4 12 31,9 -CH 30,6 13 45,3 >C< 47,3 14 48,8 >C< 49,0 15 35,6 -CH 33,1 16 28,1 -CH 28,4 17 52,6 -CH 52,6 18 18,0 -CH 18,2 0,96 (3H, s) 0,33 (1H; d; 4,5) 19 29,9 36,1 21 18,3 -CH 0,87 (3H; d; 6,5) 0,94 (3H, s) 0,33 (1H, d, 4) 29,2 0,56 (1H; d; 4,5) 20 3,29 (1H, dd, 4,5; 11,5) 0,54 (1H, d, 4) -CH 35,7 -CH 19,5 0,91 (3H, d; 6,6) 22 36,4 -CH 37,2 23 24,1 -CH 25,6 24 39,5 -CH 40,7 25 28,0 -CH 28,2 26 22,5 0,86 (3H; d; 6,5) -CH 22,8 0,87 (3H; d; 6,6) 27 22,8 0,86 (3H; d; 6,5) -CH 23,1 0,87 (3H; d; 6,6) 28 25,4 0,96 (3H, s) -CH 26,2 0,95 (3H, s) 29 14,0 0,81 (3H, s) -CH 14,2 0,82 (3H, s) 30 19,3 0,89 (3H, s) -CH 20,2 0,90 (3H, s) 3.2 Hoạt tính chống oxi hóa Bảng 3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH cao chiết Bình bát dây Stt Mẫu SC 50 (µg/ml) Kết Ghi Chứng (+) 14,78 Dương tính Vitamin C Chứng (−)  Âm tính DMSO BBD-C-H 78,12 Dương tính BBD-C-EA 41,74 Dương tính BBD-C-H O 113,05 Dương tính CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong khóa luận này, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao hexan hoạt chống oxi hóa bình bát dây Coccinia grandis L., thuộc họ Cucurbitaceae thu hái tỉnh Bến Tre vào tháng năm 2012 Bằng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, SKLM tiến hành với nhiều hệ dung môi khác phân lập hợp chất BBH7 Dựa vào số liệu phổ 1HNMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC tìm hiểu them tài liệu cấu trúc hợp chất xác định cycloartanol Đồng thời tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa cao hexan, ethyl acetate, nước phương pháp bắt gốc tự DPPH kết thu cao ethyl acetate có hoạt tính chống oxi hóa mạnh cao hexan cao nước bình bát dây 4.2 Kiến nghị Bình bát dây chưa nghiên cứu nhiều Việt Nam qua tài liệu tham khảo bình bát dây có nhiều hoạt tính chống oxi hóa, ức chế alpha amylase, trị bệnh tiểu đường… Và để có nhận định tổng quan bình bát dây cần có hướng nghiên cứu như: Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học phân đoạn cao cịn lại từ bình bát dây khảo sát thành phần hóa học chất lập Ngồi ra, khảo sát thành phần hóa học từ thân, quả… bình bát dây TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam Tập 2, NXB Giáo dục, 170-171 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thanh Tâm (2010), Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa độc tính tế bào số hợp chất Lignan Stilbene, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Luận văn thạc sĩ, 3-7 Tài liệu nước Aggarwal Ashish S, Suralkar Ujwala R, Chaudhari Sugandha G, Deshpande SV2, Garud Aniket A, Talele Sandeep G (2011), “Analgesic and antipyretic activity of methanolic extract of Coccinia grandis L leaves in experimental animals”, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2(4), 175 – 182 A Sivaraj, B Preethi Jenifa, M Kavitha, P Inbasekar, B Senthilkumar, A Panneerselvam (2011),” Antibacterial activity of Coccinia grandis leaf extract on selective bacterial strains”, Journal of Applied Pharmaceutical Science 01 (07); 120-123 Bushra khan (1998), Studies on the chemical constituents of Cucumis prophetarum, Luận án tiến sĩ hóa học, Đại học karachi, Pakistan Deshpande S.V., Patil M.J., Parmar K.K., Daswadkar S.C and Khodade R.B (2011), “A study on antioxidant activity of fruit extracts of Coccinia grandis L.Voigt”, 2011, International Journal of Drug Research and Technology, 1(1), 69-72 Geetu Singha, Prasoon Guptaa, Preeti Rawata, Anju Purib, Gitika Bhatiab, Rakesh Mauryaa(2007), “Antidyslipidemic activity of polyprenol from Coccinia grandis in high-fat diet-fed hamster model”, Phytomedicine 14, 792– 798 Gouki, M., Kensaku, T., Koji, W., Tomoyuki, O K I., Mami, M., Ikuo, S., et al., (2006), Evaluation of antioxidant activity of vegetables from Okinawa Prefecture and determination of some antioxidative compounds Food Science and Technology Research, 12, 8–14 10 Muthuswamy Umamaheswari, Kuppusamy AsokKumar, Arumugam Somasundaram, Thirumalaisamy Sivashanmugam, Varadharajan Subhadradevi, Thenvungal Kochupapy Ravi (2007), “Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants”, Journal of Ethnopharmacology, 109, 547–551 11 Papiya Mitra Mazumder, D Sasmal and R Arivudai Nambi (2008), “ Antiulcerogenic and antioxidant effects of Coccinia grandis (Linn.) Voigt leaves on aspirin – induced gastric ulcer in rats”, Natural product radiance, 7(1), 15 – 18 12 Rajeswari Arunachalam , Sujatha Dhanasingh , Balasaraswathi Kalimuthu , Mani Uthirappan , Chellan Rosea, Asit Baran Mandal (2012), “Phytosynthesis of silver nanoparticles using Coccinia grandis leaf extract and its application in the photocatalytic degradation”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 94, 226–230 13 Raju Patil , Ravindra Patil , Bharati Ahirwar , Dheeraj Ahirwar (2011), “Current status of Indian medicinal plants with antidiabetic potential: a review”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S291-S298 14 S.V Deshpande, M J Patil, S.C Daswadkar, U Suralkar, A Agarwal (2011), “A study on anti-inflammatory activity of the leaf and stem extracts of Coccinia grandis L Voigt”, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, (3), 247-250 15 Takuya Katsube, Yoko Tsurunaga, Mari Sugiyama, (2009), Effect of air- drying temperature on antioxidant capacity and stability of polyphenolic compounds in mulberry (Morus alba L.) leaves, Food Chemistry, 113, 964– 969 16 Tamilselvan N, Thirumalai T, Elumalai EK, Balaji R, David E (2011), “Pharmacognosy of Coccinia grandis: a review”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S299-S302 17 U A Deokate and S S Khadabadi (2011), “Pharmacology and phytochemistry of Coccinia indica”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, (11), 155-159 18 Vadivu R, Krithika A, Biplab C, Dedeepya P, Shoeb N, Lakshmi KS (2008), “Evaluation of Hepatoprotective Activity of the Fruits of Coccinia grandis Linn”, International Journal of Health Research, 1(3), 163-168 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 3: Phổ DEPT hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 4: Phổ HSQC hợp chất BBH7 dung môi CDCl Phụ lục 5: Phổ HMBC hợp chất BBH7 dung môi CDCl NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Chủ tịch Thư ký Uỷ viên ... tục khảo sát thành phần hóa học phân đoạn cao cịn lại từ bình bát dây khảo sát thành phần hóa học chất lập Ngồi ra, khảo sát thành phần hóa học từ thân, quả… bình bát dây TÀI LIỆU THAM KHẢO... bột bình bát dây Coccinia grandis có hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống lt [11] Cao methanol, cao nước bột bình bát dây Coccinia grandis L thử nghiệm hoạt tính chống loét chuột cao methanol... nghiên cứu hoạt tính sinh học bình bát dây Việt Nam cơng trình nghiên cứu lồi có Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxi hóa từ cao hexan bình bát dây CHƯƠNG