Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng có hoạt tính rộng và có tác động lên hầu hết các loại tế bào của hệ miễn dịch như tế bào B, tế bào T, tế bào gan, tiền tế bào máu và các tế bào của hệ thần kinh trung ương. IL-6 được sản sinh bởi nhiều loại tế bào khác nhau và hoạt động như một cytokine tiền viêm và kháng viêm. Để có thể biểu hiện hiệu quả trong hệ prokaryote, gen IL-6 của gà đã được tách dòng được tối ưu hóa bằng chương trình Optimum Gene Codon Optimization Analysis và hệ số thích ứng codon đã tăng lên 0,89. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pGS-21a-chIL-6 mang gen IL-6 của gà đã được tối ưu hóa. Protein IL-6 của gà đã biểu hiện trong tế bào BL21 khi cảm ứng bằng IPTG. Protein biểu hiện được kiểm tra trên gel polyacrylamid và thấy rằng protein có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, tương đương với tính toán lý thuyết và chủ yếu ở dạng inclusion bodies.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 259-264 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN IL-6 CỦA GÀ TRONG E COLI BL21 Vũ Thị Thu Huyền*, Phạm Việt Cường, Trần Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Kim Cúc Viện Hóa sinh biển, (*)huyenvuibt@gmail.com TĨM TẮT: Interleukin-6 (IL-6) cytokine đa chức có hoạt tính rộng có tác động lên hầu hết loại tế bào hệ miễn dịch tế bào B, tế bào T, tế bào gan, tiền tế bào máu tế bào hệ thần kinh trung ương IL-6 ñược sản sinh nhiều loại tế bào khác hoạt ñộng cytokine tiền viêm kháng viêm Để biểu hiệu hệ prokaryote, gen IL-6 gà ñã ñược tách dòng tối ưu hóa chương trình Optimum Gene Codon Optimization Analysis hệ số thích ứng codon ñã tăng lên 0,89 Đã thiết kế thành công vector biểu pGS-21a-chIL-6 mang gen IL-6 gà ñã ñược tối ưu hóa Protein IL-6 gà biểu tế bào BL21 cảm ứng IPTG Protein biểu ñược kiểm tra gel polyacrylamid thấy protein có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, tương đương với tính tốn lý thuyết chủ yếu dạng inclusion bodies Từ khóa: Biểu gen, chIL 6, Cytokine, Interleukin 6, tối ưu hóa trình tự gen MỞ ĐẦU Interleukin-6 (IL-6) thuộc họ cytokine IL-6 cytokine đa chức năng, giữ vai trò điều chỉnh ñáp ứng miễn dịch, phản ứng pha cấp tạo máu (haematopoiesis), bao gồm tăng sinh sản xuất kháng thể tế bào lai, có tiềm trở thành phụ gia phân tử cho vaccine thay cho kháng sinh IL-6 ñược sinh nhiều loại tế bào khác tác ñộng lên tế bào B, tế bào T, tế bào gan (hepatocytes), tiền tế bào máu (haematopoietic progenitor cells) tế bào hệ thần kinh trung ương [1, 3, 4, 10, 12, 13, 15] IL-6 hoạt ñộng cytokine tiền viêm chống viêm IL6 ñược tiết tế bào T đại thực bào để kích thích đáp ứng miễn dịch bị thương Đối với ñáp ứng miễn dịch vật chủ tới nguồn bệnh, IL-6 cần cho kháng chuột chống lại vi khuẩn, Streptococcus pneumoniae IL-6 “myokine”, cytokine sinh ñể ñáp ứng lại sư co cách tăng hàm lượng Ngoài ra, nguyên bào xương tiết IL-6 để kích thích tạo xương Vai trò IL-6 cytokine chống viêm trung gian thông qua việc ức chế TNF-α IL-1, hoạt hóa IL-1ra IL-10 IL-6 đại thực bào phản ứng lại phân tử vi khuẩn ñặc hiệu, gọi mẫu phân tử liên quan nguồn bệnh (PAMPs) thơng qua loạt tín hiệu, cảm ứng tăng sản xuất cytokine [2, 3, 9, 11] Gần ñây, gen IL-6 gà (ChIL-6) ñã ñược tách dòng từ dòng tế HD11 ChIL-6 tái tổ hợp ñược tạo [2, 5, 6, 7, 9] rchIL-6 tương tự rhIL-6 làm tăng sinh dòng tế bào lai 7TD1 phụ thuộc IL-6 chuột rchIL-6 cảm ứng tổng hợp corticosterone gà in vivo Li cs (2010) thành cơng tách dòng gen chIL6 thiết kế vector biểu pET 32a(+)/chIL6 E coli [5] Liu et al (2009) [6] cho thấy rChIL-6 biểu hệ eukaryot làm tăng đáng kể hiệu miễn dịch vaccine LaSota bệnh Newcastle IL-6 sử dụng thị trạng thái miễn dịch chế phẩm kháng nguyên kháng chIL-6 sở ñể phát triển phương pháp huyết học ñể phát IL-6 gà [5] Gen ChIL-6 ñã ñược tách dòng gắn vào vector biểu pET 32a(+) protein tái tổ hợp ñã biểu thành cơng tế bào BL21 cảm ứng IPTG sau [5] Scott et al (2006) [9] sử dụng vector pMAL-c2 để tách dòng biểu gen chIL-6 rchIL-6 protein biểu ñã ñược tinh sử dụng cột lực amylose PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Gen IL-6 gà: Gen chIL-6 ñược thu nhận từ mô lách gà tháng tuổi, tách dòng lưu giữ plasmid pCR2.1 Tiến hành đọc trình tự xử lý tối ưu hóa trình tự Trình tự Interleukin-6 gà sau tối ưu hóa (ch-IL6-opt) phần mềm hãng GenScript ñược chuyển vào vector tách dòng pUC57 (GenScript) Chủng vi khuẩn: Escherichia coli DH5α BL21 (DE3) hãng Invitrogen Chủng E coli 259 Vu Thi Thu Huyen, Pham Viet Cuong, Tran Thị Kim Dung, Nguyen Thi Kim Cuc ñược nuôi 37oC môi trường LuriaBertani lỏng rắn, bổ sung ampicillin cần thiết ñể chọn lọc giữ plasmid tái tổ hợp Vector biểu hiện: Vector pGS-21a (GenScript) ñược sử dụng ñể thiết kế vector biểu gen E coli Vector pGS-21a có khả biểu mạnh protein tái tổ hợp, vector có promoter T7, ñược cài hai lần 6xHis GST thuận lợi cho trình tinh protein Thiết kế vector biểu hiện: Cặp mồi ñặc hiệu ñược xây dựng ñể khuếch ñại đoạn gen chIL-6opt dài 726bp, mồi xi 5’TATCCCATGGGCCGCCATGAACTTTACC GAAGG-3’có điểm cắt enzyme giới hạn Nco I (gạch chân), mồi ngược 5’TCCGCTCGAGAGCGGAGAACGAGCGGG3’có điểm cắt enzyme giới hạn Xho I PCR ñược tiến hành với template plasmid DNA pUC57/chIL-6-opt, với thành phần: loại primer µl, dNTP µl, taq polymerase 0,5 µl, dung dịch ñệm cho enzyme 2,5 µl, template µl Chu trình nhiệt PCR: 94oC phút, 30 chu kì [94oC 30 giây, 64oC 45 giây, phút], 72oC phút, giữ mẫu oC Biểu gen chIL-6-opt: Chủng E coli BL21 chứa plasmid tái tổ hợp ni lắc qua đêm mơi trường LB 37oC Dịch ni cấy chuyển sang môi trường với tỉ lệ 1%, nuôi tiếp 3-4 cho ñến OD600 ñạt 0,6 Bổ sung IPTG 0,5M ñể cảm ứng biểu gen 37oC Thu tế bào ly tâm 5000 vòng/phút 4oC 10 phút, rửa tế bào PBS lạnh Tế bào ñược làm tan PBS lạnh siêu âm, ly tâm 10000 vòng/phút 4oC 10 phút, tách cặn dịch Protein tái tổ hợp ñược kiểm tra ñiện di SDS-PAGE sau ñược biến tính 100oC 10 phút Phản ứng ELISA: Để khẳng ñịnh chắn mẫu thu nhận ñược dương tính với kháng thể ChIL-6, chúng tơi thực phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-Phản ứng hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme), sử dụng phương pháp ELISA Sanwich trực tiếp tóm bắt kháng nguyên (chicken Interleukin-6 ELISA kit- Cusabio) 260 Tiến hành phản ứng: Chủng E coli BL21 chứa plasmid tái tổ hợp ni lắc qua đêm mơi trường LB 37oC, pha lỗng nồng ñộ 10o, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Bổ sung 100 µl mẫu, đối chứng vào giếng có phủ sẵn kháng thể chIL-6, ủ 2h 37oC Loại bỏ dịch, khơng rửa Thêm 100 µl Biotin-antibody vào giếng, ủ 1h 37oC, loại bỏ dịch, rửa lần 200 µl wash buffer giếng Thêm 100 µl HRP-avidin vào giếng, ủ 1h 37oC, rửa lại lần 200 µl wash buffer giếng Thêm 90 µl chất TMB, ủ 10-30 phút 37oC Thêm 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào giếng Đo OD 450 nm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tối ưu hóa trình tự gen chIL-6 cho hệ biểu procaryote Hệ biểu E coli thường ñược lựa chọn ñể biểu gen ngoại lai số ưu ñiểm genome chúng ñã ñược nghiên cứu kỹ, ñây hệ biểu gen linh hoạt, dễ sử dụng, rẻ tiền, mức ñộ biểu gen ngoại lai cao, thường chiếm tới 30% protein tổng tế bào Mặc dù vậy, mức độ biểu cao khơng phải ñạt ñược, ñặc biệt ñối với gen có nguồn gốc từ loài khác Một nhiều nguyên nhân ảnh hưởng ñến hiệu biểu protein khác loại E coli mức ñộ sử dụng codon (biased codon usage) Ngoài ra, biểu gen chứa mã (codon) gặp (rare codons) dẫn ñến lỗi dịch mã, mà codons E coli thường có nhiều gen khác loại (từ eukaryot vi khuẩn archaea), vậy, cần phải tối ưu hóa gen trước biểu E coli [8] Gen IL-6 ñược tách dòng từ gà Việt Nam (Vietnamese Gallus gallus domesticaBreed Ri), gồm 726 nucleotides, mã hoá cho 241 amino acid Để biểu tốt hệ thống E coli, chuỗi nucleotide chIL-6 gà cần phải ñược chuyển ñổi sang mã E coli, phải đảm bảo trình tự amino acid khơng thay đổi Vì vậy, chương trình Optimum Gene Codon Optimization Analysis (GenScript) ñã ñược sử dụng ñể tìm kiếm mã khơng phù hợp biểu hệ procaryote chuyển đổi sang TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 259-264 mã E coli (appendix) Sau chuyển ñổi, hệ số CAI (Codon Adaptation Index), thay ñổi từ CAI: 0,65 thành CAI: 0,89 (CAI: 1,0 ñược coi hồn thiện với mức độ biểu cao nhất) (hình 1) Sau dịch mã gen thay ñổi sang protein so sánh với chIL-6 nguyên thủy thấy rằng, tỷ lệ tương ñồng amino acid 100% Như vậy, thay đổi số nucleotides khơng ảnh hưởng đến trình tự amino acid protein biểu Hình Hệ số thích ứng codon CAI (Codon Adaptation Index) gen chIL-6 trước sau tối ưu hóa Thiết kế vector biểu pGS-21a/chIL-6-opt Gen chIL-6 sau thay ñổi mã dịch protein cho phù hợp (chIL-6opt) với ñiều kiện biểu hệ procaryot ñược tổng hợp đưa vào plasmid pUC57 (GenScript) để giữ dòng Sử dụng cặp mồi ñược thiết kế template plasmid pUC57/chIL-6opt, PCR ñã ñược tiến hành theo phương pháp mơ tả sản phẩm PCR kiểm tra agarose gel (hình 2) Để tạo plasmid mang gen chIL-6opt, sản phẩm PCR sau ñược tinh plasmid pGS-21a ñều ñược cắt enzymes giới hạn Nco I Xho I, sau điện di gel agarose 1% (hình 3) Tinh sản phẩm cắt tiến hành phản ứng Hình Điện di ñồ sản phẩm PCR Marker Fermentas; 2, 3, Sản phẩm PCR ligation ñể gắn gen chIL-6opt vào vector biểu pGS-21a nhờ T4-DNA ligase Plasmid tái tổ hợp pGS-21a/chIL-6opt ñược biến nạp vào chủng E coli BL21 khả biến, chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp ampicillin Cắt plasmid tái tổ hợp từ dòng chọn lọc E.coli tái tổ hợp enzymes giới hạn Nco I Xho I ñiện di gel agarose 1% để kiểm tra kết gắn gen (hình 4) Kết kiểm tra DNA plasmid xử lý với enzyme Nco I Xho I hình cho thấy, gen chIL-6-opt ñã gắn ñược vào vector pGS-21a Hình Điện di ñồ sản phẩm cắt Nco I Xho I sản phẩm PCR (1, 2, 3) plasmid pGS-21a (5, 6, 7) 261 Vu Thi Thu Huyen, Pham Viet Cuong, Tran Thị Kim Dung, Nguyen Thi Kim Cuc Hình Điện di đồ sản phẩm cắt plasmids pGS-21a/chIL-6opt Marker Fermentas; 2, Sản phẩm cắt plasmids pGS-21a/chIL-6opt Nco I Xho I Hình Điện di đồ SDS-PAGE dịch ni cấy Marker protein (Fermentas); Dịch chứa protein tế bào ni cấy mang pGS-21a/chIL-6-opt cảm ứng IPTG; Dịch chứa protein tế bào nuôi cấy mang pGS-21a/chIL-6-opt không cảm ứng; Dịch chứa protein tế bào ni cấy mang pGS-21a/chIL-6-opt cảm ứng; Dịch ni cấy dòng tế bào khơng cảm ứng; Dịch chứa protein tế bào nuôi cấy mang pGS-21a/chIL-6-opt cảm ứng sau phá siêu âm; Cặn ly tâm dịch chứa protein tế bào nuôi cấy mang pGS21a/chIL-6-opt cảm ứng sau phá siêu âm Biểu gen chIL-6-opt BL21 Dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp sau chọn lọc ni mơi trường LuriaBertani lỏng, bổ sung ampicillin, cảm ứng IPTG thu sinh khối Sinh khối tế bào hòa nước cất, bổ sung ñệm loading buffer chất biến tính protein (DTT), biến tính 262 100oC 10 phút Điện di protein tổng thu ñược SDS-PAGE ñể kiểm tra khả biểu gen chIL-6-opt tế bào E coli BL21(DE3) (hình 5) Kết điện di cho thấy, protein có trọng lượng phân tử khoảng 27 kDa (trọng lượng phân tử tính tốn theo lý thuyết TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 259-264 protein tái tổ hợp chIL-6-opt) biểu rõ dòng chọn lọc (giếng 2) Dòng tế bào E coli xác định mang plasmid tái tổ hợp khơng cảm ứng IPTG không tổng hợp chIL-6 (giếng 3) Protein tái tổ hợp chIL-6-opt) ñược tổng hợp trạng thái thể vùi, vậy, dịch ni cấy không xuất băng tương ứng ChIL-6-opt tái tổ hợp (giếng 4) Để xác định trạng thái hòa tan protein, tế bào E coli sau cảm ứng ñược thu hồi, phá màng tế bào siêu âm ly tâm tách phần dịch phần cặn Cả hai phần ñều ñược bổ sung dung dịch ñệm loading buffer, dịch biến tính DTT biến tính 100oC 10 phút, sau kiểm tra băng điện di gel polyacrylamid Có thể thấy, lượng protein tái tổ hợp hòa tan (giếng 7) Phản ứng ELISA Kết phản ứng Elisa cho thấy, dịch nuôi chủng E coli BL21 chứa plasmid tái tổ hợp ni lắc qua đêm mơi trường LB 37oC, pha lỗng nồng ñộ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 106 Gen chIL-6 gà Việt Nam (Vietnamese Gallus gallus domesticaBreed Ri) tách dòng, gắn vào vector biểu pGS 21a protein tái tổ hợp ñã biểu tốt ñược cảm ứng IPTG E coli BL21 (DE3) Ký hiệu A B C D E F G H Nồng độ pha lỗng 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Chứng âm OD 0,336 0,304 0,279 0,242 0,205 0,163 0,102 0,013 Hình Kết phản ứng ELISA KẾT LUẬN Gen IL-6 gà ñã ñược tối ưu hóa cho biểu tế bào prokaryote chương trình Optimum Gene Codon Optimization Analysis làm tăng hệ số thích ứng codon (CAI) lên từ 0,65 đến 0,89 Đã tách dòng thiết kế thành cơng vector biểu pGS-21achIL-6 mang gen chIL-6 sau tối ưu hóa Protein tái tổ hợp biểu tế bào E coli dòng BL21(DE23) cảm ứng IPTG Protein biểu ñã ñược kiểm tra gel polyacrylamid có khối lượng phân tử khoảng 27kDa, phù hợp với lý thuyết chủ yếu trạng thái inclusion body không tan Lời cảm ơn: Chúng chân thành cảm ơn chương trình Cơng nghệ Sinh học nơng nghiệp Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn TÀI LIỆU THAM KHẢO Giansanti F., Giardi M F and Botti D., 2006 Avian Cytokines - An Overview Current Pharmaceutical Design, 12(24): 3083-3099 Pamela J Ferro, Christina L Swaggerty, Haiqi He, Lisa Rothwell Pete Kaiser, Michael H Kogut, 2005 Recombinant chicken IL-6 does not activate heterophils isolated from day-old chickens in vitro Developmental and Comparative Immunology, 29: 375-383 Johnson M A., Pooley C., Lowenthal J W., 2000 Delivery of avian cytokines by adenovirus vectors Dev Comp Immunol., 24(2-3): 343-354 Tadamitsu Kishimoto, 2006 Proceedings: Interleukin-6: discovery of a pleiotropic cytokine Arthritis Research & Therapy, 8(Suppl 2): S2 Min Li, Yuanping Wang, Nianli Zou, Sanjie Cao, Xintian Wen and Yong Huang, 2010 263 Vu Thi Thu Huyen, Pham Viet Cuong, Tran Thị Kim Dung, Nguyen Thi Kim Cuc The polyclonal antibody against chicken interleukine-6 prepared by immunization of recombinant eukaryotic plasmid can react eficiently with its procaryotic expression protein J Anim Veter Adv., 9(21): 26792684 Liu R L., N L Zou, H N Wang, P Liu, Y Huang, 2009 Construction of eukaryotic expression plasmids encoding chicken interleukin and study on its immunoenhancement on Newcstle disease lasota vaccine Acta Vet Zootechnica Sinica, 40: 93-97 Immunopath., 114: 173-177 10 Kirsten Schneider, Reinhard Klaas, Bernd Kaspers and Peter Staeheli, 2001 Chicken interleukin-6: cDNA structure and biological properties Eur J Biochem., 268: 4200-4206 Norihisa Nishimichi, Masayoshi Aosasa, Tsuyoshi Kawashima, Hiroyuki Horiuchi, Shuichi Furusawa, Haruo Matsuda, 2005 Biological activity of recombinant chicken interleukin-6 in chicken hybridoma cells Veterinary Immunol Immunopath., 106: 97105 13 Klein B., Wijdenes, X G Zhang, M Jourdan, J M Boiron, J Brochier, J Liautard, M Merlin, C Clement and B Morel-Fournier, 1991 Murine antiinterleukin-6 monoclonal antibody thearpy for a patient with plasma cell leukima Blood, 78: 1198-1204 14 Xie C H., R Q Yan, B A Cui, X L Zhao, Z M Wu, Z L Zhang and J Zhang, 2008 Enhancement of immune response to vaccine by recombinant chicken interleukin6 Chinese J preventive Vet Med., 30 15 Http://www.bio.davidson.edu/Courses/ Immunology/Students/Spring2003/Sole/ myfavprotein.htm El-Rashdy, M Redwan, 2006 The optimal gene sequence for optimal protein expression in Escherichia coli: Principle requirements Arab J Biotech., 9(3): 493-510 T R Scott, H S Lillehoj, 2006 Monoclonal antibodies against chicken interleukin-6 Veterinary Immunol 11 Smolen J S., Maini R N., 2006 Interleukin-6: a new therapeutic target Arthritis Res Ther., (Suppl 2): S5 12 Jacques Van Snick, 1990 Interleukin-6: An overview Annu Rev Immunol., 8: 253278 EXPRESSION OF CHIL-6 GENE ENCODING CHICKEN INTERLEUKIN-6 IN E COLI BL21 (DE3) Vu Thi Thu Huyen, Pham Viet Cuong, Tran Thị Kim Dung, Nguyen Thi Kim Cuc Marine Biochemical Institute, VAST SUMMARY Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine having a wide range of activity and has an impact on almost immune system cells such as B cells , T cells, hepatocytes, haematopoietic progenitor cells and cells of the central nervous system IL-6 is produced by many different cell types and acts as pro- and antiinflammation cytokine For effective expression in prokaryotic system, the cloned Vietnames chIL-6 gene was optimized using Optimum Gene Codon Optimization Analysis and the CAI was improved up to 0.89 The expression vector pGS-21a-chIL-6 containing optimized chIL-6 gene was successfully constructed By induction with IPTG, recombinant chIL-6 protein was expressed in BL21 The ELISA resuls and Polyacrylamid gel showed that expressed protein has molecular weight about 27 kDa, corresponding to theoretical calculation and mainly in inclusion bodies state Keywords: Chicken Interleukin 6, Cytokine, Expression, ELISA, Genentic optimization Ngày nhận bài: 21-6-2011 264 ... Tối ưu hóa trình tự gen chIL-6 cho hệ biểu procaryote Hệ biểu E coli thường ñược lựa chọn ñể biểu gen ngoại lai số ưu ñiểm genome chúng ñã ñược nghiên cứu kỹ, ñây hệ biểu gen linh hoạt, dễ sử... ưu hóa gen trước biểu E coli [8] Gen IL-6 tách dòng từ gà Việt Nam (Vietnamese Gallus gallus domesticaBreed Ri), gồm 726 nucleotides, mã hoá cho 241 amino acid Để biểu tốt hệ thống E coli, chuỗi... protein biểu Hình Hệ số thích ứng codon CAI (Codon Adaptation Index) gen chIL-6 trước sau tối ưu hóa Thiết kế vector biểu pGS-21a/chIL-6-opt Gen chIL-6 sau thay ñổi mã dịch protein cho phù hợp (chIL-6opt)