Bài viết nghiên cứu biểu hiện vùng gien preM-env của virút Dengue typ 2 trong nấm men Pichia Pastoris thông quá thiết kế plasmit chứa vùng gien preM-env; tổng hợp vùng gien preM-env; thiết kế và biến nạp vectơ biểu hiện pPICD2 vào nấm men P.pastoris...
27(3): 66-71 9-2005 Tạp chí Sinh học Nghiên cứu Biểu hiƯn vïng gien preM-env cđa virót Dengue typ nÊm men Pichia pastoris Phïng Thu Ngut, Ngun Hång Thanh, Đinh Duy Kháng, Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Bệnh sốt Dengue dịch bệnh nguy hiĨm nhÊt, chØ sau dÞch bƯnh sèt rÐt hiƯn phổ biến nớc nhiệt đới nhiệt đới Ước tính giới có khoảng 100 triệu ngời bị sốt Dengue hàng năm Mức độ biểu nghiêm trọng bệnh tợng sốt xuất huyết sốc Dengue dẫn đến tử vong, trẻ em Virút Dengue thuộc họ Flaviviridae gồm có typ kháng nguyên khác (từ DEN1 đến DEN4) Dịch sốt Dengue thờng bùng phát vào mùa hè vectơ trung gian truyền virút Dengue muỗi Aedes aegypti Hệ gien virút Dengue chứa khung đọc mở đơn dài khoảng 11 kb, m hãa cho protein cÊu tróc vµ protein khác Protein vỏ (E) protein cấu trúc bộc lộ bề mặt virút Dengue trởng thành, chứa khoảng 495 axit amin với trọng lợng phân tử khoảng 60 kDa [1] Protein E liên kết với thụ thể cảm ứng dung hợp màng virút với màng tế bào chủ, gây nên tợng nhiễm virút Dengue Ngoài ra, protein E chứa epitop kháng nguyên không trung hòa, gây nên tợng sốt xuất huyết Dengue sốc Dengue hay gọi trình tăng cờng phụ thuộc kháng thể Protein E đ đợc biểu mét sè hƯ biĨu hiƯn kh¸c nh− Escherichia coli, nấm men [2], côn trùng [3, 4] tế bào động vật [5, 6] Tuy nhiên, protein E biểu tế bào vi khuẩn không cuộn cấu trúc không gian để giữ đợc toàn epitop trung hòa [7] Trong đó, protein tái tổ hợp E đợc tổng hợp nhờ hệ thống nuôi cấy mô tế bào động vật tốn phức tạp Gien m hóa cho protein E (env) liªn kÕt víi gien m hãa cho protein PrM (preM-precusor membrane) tạo nếp gấp tăng tính bền vững cho protein E trình hình thành cấu trúc không gian virút Do đó, toàn vùng gien preM-env kháng nguyên quan trọng cho nghiên cứu vacxin chống lại virút Dengue đợc sử dụng chẩn đoán nhanh typ kháng nguyên virút Trong năm gần đây, hệ nấm men P pastoris đ đợc sử dụng nh hệ biểu mạnh không tốn để tổng hợp lợng lớn protein tái tổ hợp có hoạt tính Theo kết nhóm nghiên cứu Trung Quốc, vïng gien m hãa cho protein E cđa virót Dengue typ đ đợc biểu thành công P pastoris với trọng lợng phân tử khoảng 60 kDa [1] Điều chứng tỏ P pastoris đ đợc chọn nh vật chủ thích hợp để biểu gien virút Dengue Trong nghiên cứu này, sử dơng nÊm men P pastoris ®Ĩ biĨu hiƯn vïng gien preM-env virút Dengue typ phân lập Việt Nam với mục đích nhằm thu đợc lợng kháng nguyên tái tổ hợp Lợng kháng nguyên này, sau tinh sạch, đợc sử dụng để tạo Kit chẩn đoán nhanh phơng pháp Western blot phơng pháp ELISA Đây báo cáo nghiên cứu biểu hiƯn cđa vïng gien preMenv cđa virót Dengue typ nấm men P pastoris I phơng pháp nghiên cứu Thiết kế plasmit chứa vùng gien preMenv Công trình đợc tài trợ kinh phí đề tài khoa häc KC-04.18 66 Tr×nh tù vïng gien preM-env cđa virót Dengue typ phân lập Việt Nam đ đợc đăng ký Ngân hàng gien quốc tế với số đăng ký AJ574886 Vùng gien đợc tách làm hai dòng plasmit pCR2.1, dòng đầu chứa đoạn gien dài 1387 bp (pCRD2-5) dòng đầu chứa đoạn gien dài 1480 bp (pCRD2-3) Plasmit pCRD2-3 đợc cắt enzym HindIII (Biolabs) để thu đoạn gien đầu đợc ghép nối với pCRD2-5 đợc xử lý enzym để tạo nên vectơ tái tổ hợp chứa toàn vùng gien preM-env (ký hiệu pCRD2) Tổng hợp vùng gien preM-env Plasmit pCRD2 đợc sử dụng làm khuôn để tổng hợp nên vùng gien preM-env kỹ thuật PCR với hai đoạn mồi thiết kế thêm điểm cắt enzym hạn chế SnaBI vµ NotI 5’PrM-E-SnaBI: 5’-agt tac gta ttc cat tta acc aca cgt aac-3’ 3’PrM-E-NotI: 5’-a ggc ggc cgc tca atg atg atg atg atg atg ggc ctg cac cat aac tcc caa- Chơng trình PCR đợc bắt đầu phản ứng biến tính ADN sợi khuôn xảy nhiệt độ 94oC phút, 25 chu kỳ, chu kỳ gồm bớc Bớc 1: biến tính ADN sợi khuôn 94oC phút; bớc 2: đoạn mồi kết cặp bổ sung với trình tự sợi khuôn 57oC phút; bớc 3: tổng hợp kéo dài chuỗi 72oC Ph¶n øng kÕt thóc ë 72oC giữ mẫu 4oC Thiết kế biến nạp vectơ biểu pPICD2 vào nấm men P pastoris Sản phẩm PCR đợc cắt enzym hạn chế SnaBI NotI (Biolabs) ghép nối vào vectơ pPIC9 đợc xử lý hai enzym Plasmit tái tổ hợp đợc cắt kiểm tra enzym hạn chế SnaBI+NotI BamHI Plasmit pPICD2 đợc mở vòng enzym hạn chế StuI (Biolabs) đợc biến nạp vào tế bào P pastoris GS115 theo phơng pháp xung điện (GienePulser, Bio-Rad) Các thể biến nạp đợc chọn lọc môi trờng MD khuyết histidin (YNB 0,34%, glucoza 2%, biotin 0,0004%) Biểu protein tái tổ hợp Một số thể biến nạp phát triển mạnh môi trờng chọn lọc đợc cấy chuyển sang môi trờng lỏng PEG (1% yeast extract, 2% pepton, 1% glyxêrol) Tế bào đợc nuôi cấy lắc 30oC với tốc độ 230 vòng/phút; sau khoảng 20 giờ, ly tâm dịch nuôi cấy 3000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch hòa lại tế bào môi trờng PEM (1% yeast extract, 2% pepton, 1% mêtanol) để đạt đợc OD = 1, sau tiếp tục nuôi cấy lắc 230 v/p 28oC Tế bào đợc cảm ứng sau 24 mêtanol với nồng độ cuối 1% Dịch nuôi cấy sau ngày cảm ứng đợc thu lại tiến hành xác định protein điện di gel polyacrylamit 12,5% Kiểm tra khả liên kết protein tái tổ hợp PrM-E với kháng thể đặc hiệu kháng virút Dengue typ phơng pháp Western blot Protein tái tổ hợp đợc điện di gel SDSPAGE 12.5% Sau đó, protein đợc chuyển sang màng PVDF dung dịch đệm có mêtanol (glyxin: 14,41g; tris: 3g; 20% mêtanol) Điện di chuyển màng đợc thực hiệu ®iƯn thÕ 100V kho¶ng giê ë ®iỊu kiƯn lạnh Phần cha gắn protein màng đợc phủ dung dịch TBS 1X có chứa 5% sữa tách bơ 4oC qua đêm Rửa màng vài lần dung dịch TTBS (TBS 1X: 250 ml; tween 20: 250àl; bổ sung nớc đến 500 ml) khoảng phút Màng đợc ủ dung dịch chứa kháng thể kháng virút Dengue typ hut thá víi nång ®é pha lo ng thích hợp Màng đợc rửa vài lần dung dịch TTBS đợc ủ dung dịch kháng thể kháng IgG thỏ có gắn enzym peroxidaza Tiếp tục rửa màng đệm TTBS TBS Chuyển màng sang 30 ml dung dịch chất màu xuất băng Phản ứng đợc dừng lại cách rửa màng nhiều lần nớc cất II Kết nghiên cứu Thiết kế vectơ biểu vùng gien preMenv Toàn vùng gien preM-env virút Dengue typ đợc ghép nối đa vào vectơ biểu nấm men pPIC9 theo h×nh Vïng gien preM-env cđa virót Dengue typ có kích thớc khoảng 2000 bp Để đơn giản hóa 67 việc tách dòng, vùng gien đợc tách làm hai dòng đầu (pCRD2-3) đầu (pCRD2-5) (theo nh mô tả phần vật liệu phơng pháp) Nhìn từ hình 1, ta thấy có điểm cắt enzym hạn chế HindIII nằm gien vùng đa nối vectơ Vị trí điểm cắt HindIII nằm gien đầu 424 gien đầu 1179 Điểm HindIII nằm vùng gối lên đầu đầu vùng gien preM-env, enzym đợc sử dụng để cắt đoạn gien khoảng 1000 bp từ plasmit pCRD2-3và ghép nối với plasmit pCRD2-5 (5079 bp) đ đợc xử lý b»ng HindIII M13r M13r pUC ori pUC ori Hind III (424) pCR D2 -3' 1000 bp 5380 bp Amp 1480 bp 5287 bp HindIII f1 ori Xho I Sna BI Eco RI Avr I NotI S 5'AOX1 Amp f1 ori Z M13f Z 3'AOX1 M13r Hind III pCR D2 Amp f1 ori Z M 3f 3'AOX1 SnaBI DNA Ligaza 2000 bp 1000 bp (6079 bp) 8000 bp SalI M 3f Hind III (1179) Hind IIII pUC ori pPIC9 HIS 1387 bp pCR D2 -5' Amp Hind III PCR NotI preM-env (1959 bp) NotI SnaBI D2 S 3'AOX1 5'AOX1 Amp pPIC-D2 10.000bp HIS4 3'AOX1 StuI H×nh Sơ đồ thiết kế vectơ biểu vùng gien preM-env virút Dengue typ Hai đoạn gien đợc ghÐp nèi víi nhê enzym nèi ADN ligaza, t¹o plasmit tái tổ hợp có chứa đoạn gien hoàn chỉnh preM-env (ký hiƯu pCRD2) S¶n phÈm nèi sau biÕn nạp vào tế bào E coli DH5 đợc cắt kiểm tra enzym hạn chế BamHI HindIII (hình 2) Theo tính toán, plasmit pCRD2 cắt BamHI xuất băng có kích thớc khoảng 400, 500 5179 bp; xử lý pCRD2 HindIII xuất băng có kích thớc khoảng 1060 5019bp Kết hình cho thấy dòng xuất băng có kích thớc nh tính toán Nh 68 vậy, đ thu đợc plasmit tái tổ hợp pCRD2 có chứa toµn bé vïng gien preM-env bp 5000 1000 500 Hình Điện di sản phẩm cắt plasmit pCRD2 gel agaroza 0,8% Đờng chạy 1: thang ADN chuẩn; đờng chạy 2: sản phẩm cắt plasmit pCRD2 BamHI; đờng chạy 3: sản phẩm cắt plasmit pCRD2 HindIII Tổng hợp vùng gien preM-env Để đa toàn vùng gien preM-env hoàn chỉnh vào vectơ biểu pPIC9, hai đoạn mồi để nhân vùng gien preM-env đợc thiết kế có chứa điểm cắt enzym hạn chế SnaBI NotI Bên cạnh đó, để thuận lợi cho việc tinh protein sau này, đoạn mồi đầu đợc thiết kế thêm vùng m hóa cho histidin n»m tr−íc bé ba kÕt thóc Plasmit pCRD2 đợc sử dụng làm khuôn cho kỹ thuật PCR Kết PCR đợc kiểm tra gel agaroza 0,8% (hình 3) lý vectơ SnaBI+NotI, xuất băng có kích thớc với kích thớc gien khoảng 2000 bp Các băng điện di hình cho thấy sản phẩm cắt kiểm tra cho băng ADN có kích thớc nh tính toán Nh vậy, đ thiết kế thành công vectơ pPICD2 biểu vùng gien preM-env để đa vào nấm men P pastoris 8000 bp 1500 bp 500 bp Hình Sản phẩm cắt kiểm tra plasmit pPICD2 gel agaroza 0,8% 2000 bp Đờng chạy 1: thang ADN chuẩn; đờng chạy 2: dòng đối chứng pPICD2; đờng chạy 3: plasmit pPICD2/ BamHI; đờng chạy 4: plasmit pPICD2/ SnaBI+NotI 1000 bp BiĨu hiƯn protein t¸i tổ hợp PrM-E kD Hình Điện di sản phẩm PCR cđa vïng gien preM-env trªn gel agaroza 0,8% 116 Đờng chạy 1: thang ADN; đờng chạy 2: sản phẩm PCR 66 Kết hình cho thấy vùng gien preM-env có kích thớc khoảng 2000 bp đ đợc nhân lên thành công có kích thớc với tÝnh to¸n 43 ThiÕt kÕ plasmit biĨu hiƯn pPICD2 Sản phẩm PCR đợc cắt hai enzym hạn chế SnaBI+NotI đợc ghép nối vào vectơ pPIC9 đợc xử lý hai enzym Các plasmit pPIC9 chứa toµn bé vïng gien preM-env cđa virót Dengue typ (đợc ký hiệu pPICD2) pPICD2 đợc cắt kiểm tra enzym hạn chế BamHI, SnaBI+NotI Kết cắt kiểm tra pPICD2 đợc trình bày hình Kết hình cho thấy pPICD2 cắt BamHI xuất ba băng có kích thớc khoảng 507, 1402 8000bp; xử 79 kDa 35 25 18 14 Hình Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamit 12,5% để kiểm tra khả biểu vùng gien preM-env P pastoris sau ngày cảm ứng Đờng chạy 1: protein dòng đối chứng; đờng chạy 2: thang protein chuẩn; đờng chạy 3, 4: protein dòng chứa vùng gien preM-env Plasmit pPICD2 đợc mở vòng StuI để giúp định hớng cho trình tích hợp vùng 69 gien preM-env vào vùng đột biến gien m hóa histidin genom nấm men đợc dễ dàng Sau ngày nuôi cấy môi trờng MD khuyết histidin, đ xt hiƯn nhiỊu khn l¹c, chøng tá chđng nÊm men tái tổ hợp có khả tổng hợp histidin plasmit đ đợc tích hợp vào genom nấm men Kết biểu protein tái tổ hợp PrM-E đợc thể hình Kết hình cho thấy protein tái tổ hợp PrM-E có kích thớc khoảng 79 kDa đ đợc biểu tế bào nấm men P pastoris sau đợc cảm ứng mêtanol 1%, dòng đối chứng chứa vectơ pPIC9 không thấy xuất băng protein tơng ứng Trong tế bào nấm men, thờng xảy trình glycozyl hóa protein sau dịch m , protein ngoại lai đợc biểu thờng đợc gắn thêm gốc đờng Kích thớc protein tái tổ hợp PrM-E cao so với kích thớc protein PrM-E theo tính toán kDa, đợc giải thích trình glycozyl hóa kDa tế bào nấm men P pastoris Lợng protein tái tổ hợp sau biểu hiện, đợc xác định phơng pháp so sánh với protein chuẩn khoảng 0,1-0,2 mg/ml Phản ứng Western blot kiểm tra khả liên kết miễn dịch kháng nguyên-kháng thể với lợng protein tinh khoảng 0,001 mg/ml Vì vậy, lợng protein tái tổ hợp PrM-E đợc tổng hợp P pastoris sử dụng đợc phản ứng Western blot Từ kết trên, kết luận đ biểu thành công toàn vùng gien preMenv virút Dengue typ nÊm men P pastoris KÕt qu¶ kiĨm tra protein tái tổ hợp Western blot Protein tái tỉ hỵp sau biĨu hiƯn nÊm men P pastoris đợc kiểm tra khả liên kết miễn dịch với kháng thể đặc hiệu kháng virút Dengue typ huyÕt thá b»ng Western blot kDa 116 66 79 kDa 43 35 25 18 14 Hình Sự liên kết kháng nguyên tái tổ hợp PrM-E với kháng thể kháng virút Dengue typ huyết thỏ đợc kiểm tra Western blot Đờng chạy 1,3: thang protein chuẩn; đờng chạy 2: kết lai kháng nguyên PrM-E2 với kháng thể kháng virút Dengue typ 2; đờng chạy 4: protein tái tổ hỵp PrM-E cđa virót Dengue typ biĨu hiƯn P pastoris Kết biểu vùng gien preM-env hình (đờng chạy 4) cho thấy protein tái tổ hợp có kích thớc khoảng 79 kDa Các protein kháng nguyên PrM-E đợc chuyển sang màng PVDF đợc phủ với kháng thể kháng virút Dengue Kết lai Western blot hình (đờng chạy 2) cho thấy xuất băng protein nhất, 70 với kích thớc protein biểu Điều chứng tỏ protein tái tổ hợp PrM-E có khả liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng virút Dengue typ Kết mở triển vọng ứng dụng protein tái tổ hợp PrM-E2 cho mục đích tạo sinh phẩm chẩn đoán bệnh sốt Dengue sèt xuÊt huyÕt Dengue III KÕt luËn Hui-yong W et al., 2003: J Virol Methods, 109: 17-23 Hai đoạn gien tách dòng riêng biệt đầu (pCRD2-3) đầu (pCRD2-5) đ đợc ghép nối thành công để tạo thành vùng gien hoàn chỉnh pCRD2 enzym hạn chế HindIII Vïng gien pCRD2 cã kÝch th−íc kho¶ng 2000 bp đ đợc đa vào vectơ pPIC9 biểu thành công nấm men P pastoris mà giữ đợc tính kháng nguyên protein Protein tái tổ hợp có kích thớc khoảng 79 kDa đợc tổng hợp với hàm lợng khoảng 0,10,2mg/ml có khả đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng thể kháng virút Dengue typ phản ứng Western blot Tài liệu tham kh¶o Sugrue R J et al., 1997: J Virol Methods, 69: 159-169 Staropoli I et al., 1997: Vaccine, 15: 19461954 Kelly E P et al., 2000: Vaccine, 18: 25492559 Men R et al., 1991: J Virol., 65: 14001407 Men R et al., 2000: Vaccine, 18: 31133122 Himani B et al., 2001: Protein Expression and Purification, 23: 84-96 Expression of the gene region preM-env of Dengue virus type in Pichia pastoris Phung Thu Nguyet, Nguyen Hong Thanh, Dinh Duy Khang, Truong Nam Hai Summary The Dengue fever is one of the most serious illnesses in many tropical and subtropical countries Laboratory tests are essential for diagnosis of the Dengue infection The gene region preM-env of Dengue virus type containing about 2000 bp was amplified by using the RT-PCR method from the infected cell and cloned in the pCR2.1 vector This gene region was inserted in the pPIC9 vector for expression in the yeast cells The electroporation was used to transfer the recombinant plasmid (pPIC-D2) into P pastoris cells The expressed full-length PrM-E gene in P pastoris was identified by SDS-PAGE and Western-blot It was shown that the recombinant protein with molecular weight of approximately 79 kDa excreted into the supernatant of culture when induced with 1% methanol after days The protein concentration expressed in P pastoris was estimated of 0.1-0.2 mg/ml by the comparison with the molecular weight of the protein marker The result of Western blot indicated that the recombinant protein PrM-E was able to bind with rabbit monoclonal antibody specific to Dengue virus type The purified recombinant PrM-E protein will be applied for producing the diagnosis Kit of Dengue virus Ngµy nhËn bµi: 31-8-2004 71 ... Kết nghiên cứu Thiết kế vectơ biểu vïng gien preMenv Toµn bé vïng gien preM-env cđa virót Dengue typ đợc ghép nối đa vào vectơ biĨu hiƯn nÊm men pPIC9 theo h×nh Vïng gien preM-env cđa virót Dengue. .. pPICD2 biểu vùng gien preM-env để đa vào nấm men P pastoris 8000 bp 1500 bp 500 bp H×nh Sản phẩm cắt kiểm tra plasmit pPICD2 gel agaroza 0,8% 20 00 bp Đờng chạy 1: thang ADN chuẩn; đờng chạy 2: ... 17 -23 Hai đoạn gien tách dòng riêng biệt đầu (pCRD2-3) đầu (pCRD2-5) đ đợc ghép nối thành công để tạo thành vùng gien hoàn chỉnh pCRD2 enzym hạn chế HindIII Vùng gien pCRD2 có kích thớc khoảng 20 00